Viltolarsen (NS-065/NCNP-01)   中文名称: 维特塞普索

Dystrophin (DMD) pre-mRNA. Viltolarsen binds to a specific sequence in exon 53 of the dystrophin pre-mRNA, blocking the spliceosome complex's ability to include this exon in the final mRNA. This causes the splicing machinery to skip over exon 53, joining exon 52 to exon 54. This restores the open reading frame (ORF) of the dystrophin transcript in patients with certain deletions in the DMD gene (e.g., deletions that disrupt the reading frame). The result is the production of a shortened, internally deleted but still functional dystrophin protein, converting a severe Duchenne phenotype to a milder Becker-like phenotype.

杜氏肌营养不良症（DMD）是影响男孩最常见且最致命的肌肉萎缩疾病之一，由DMD基因突变引起。外显子跳跃已成为一种可行的DMD治疗方案。为了恢复阅读框并允许肌营养不良蛋白的产生，研究人员设计了反义寡核苷酸（AON）来诱导外显子跳跃[1]。

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作为一种反义寡核苷酸，viltolarsen 不用于无细胞酶抑制试验。其活性在无细胞体系中通过测定其与互补 RNA 靶序列杂交的能力来评估。熔解温度 (Tm) 分析是通过将 PMO 与对应于靶位点的合成 25-30 个碱基的 RNA 寡核苷酸混合来进行的。混合物加热（25-95℃），并在 260 nm 处监测吸光度以确定 Tm 值，Tm 值是结合亲和力的量度。Viltolarsen 与其靶 RNA 形成稳定的双链体（Tm > 60℃）。RNase H 切割试验不适用，因为 PMO 不募集 RNase H；它们通过空间位阻阻断剪接。

在基于细胞的检测中，viltolarsen 用于检测患者来源的成肌细胞（肌肉细胞）或永生化细胞系（例如 H2K 细胞），这些细胞系携带可发生外显子 53 跳跃的突变。细胞用浓度范围为 0.1-100 uM 的 viltolarsen 处理 24-72 小时（通常通过“裸露吸收”，即游离吸收，无需转染）。通过对肌营养不良蛋白转录本进行 RT-PCR 检测，然后进行凝胶电泳或毛细管电泳以分离全长产物和较短的产物，从而测定外显子跳跃效率。外显子跳跃的百分比通过密度扫描法进行定量。功能性肌营养不良蛋白的产生通过蛋白质印迹或免疫荧光法进行确认。外显子跳跃的 EC50 值通常在低微摩尔范围内（例如 1-10 uM）。 Viltolarsen 还能恢复细胞中肌营养不良蛋白相关蛋白复合物 (DAPC) 的表达。

首先在无细胞系统中，利用剪接微基因构建体评估 viltolarsen 的反义活性。构建一个包含人类 DMD 外显子 53 及其侧翼内含子序列的质粒。在体外（例如，使用 T7 RNA 聚合酶）转录该微基因，产生前体 mRNA。将 viltolarsen（0.1-10 uM）与前体 mRNA 一起加入核提取物（例如，HeLa 细胞核提取物）中。孵育 2-4 小时后，提取 RNA，并使用侧翼外显子的引物进行 RT-PCR。在凝胶上观察跳跃产物（外显子 53 缺失）。这证实了 PMO 直接抑制剪接体组装并导致跳跃。与简单的杂交相比，该检测方法更具生理相关性。

细胞活性检测采用来自经确诊存在53号外显子跳跃突变的DMD患者的原代人成肌细胞或成纤维细胞。将细胞培养于分化培养基中以诱导肌管形成。向培养基中加入浓度为0.1-100 uM的维托拉森（自由摄取）。48-96小时后，提取RNA，并通过嵌套RT-PCR检测外显子跳跃。引物位于51号和55号外显子。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳进行分离。外显子53跳跃产物的条带强度与全长产物的条带强度之比计算跳跃百分比。使用肌营养不良蛋白抗体（例如Dys-2）对细胞裂解液进行肌营养不良蛋白的Western blotting检测。利用肌营养不良蛋白抗体对肌管进行免疫荧光染色，可以观察恢复的蛋白质在肌膜上的定位。

在mdx52小鼠模型中评估了viltolarsen的体内疗效。该小鼠模型中肌营养不良蛋白基因的第52外显子缺失，因此可以进行第53外显子跳跃。Viltolarsen以10-100 mg/kg的剂量，每周或每两周一次，持续4-12周，通过静脉注射（IV）或皮下注射（SC）给药于mdx52小鼠。主要终点是骨骼肌（例如股四头肌、膈肌、心脏）中肌营养不良蛋白的恢复情况，通过蛋白质印迹法和免疫荧光染色进行检测。功能改善情况通过握力、跑步机运动距离和组织学分析（中心核减少、纤维化和血清肌酸激酶水平降低）进行评估。研究表明，Viltolarsen可显著提高肌营养不良蛋白的表达水平（例如，达到正常水平的5-10%），并改善肌肉病理。

在人体中，维托拉森（Viltolarsen）通过静脉注射给药。在动物（小鼠、大鼠、猴）的临床前药代动力学研究中，静脉或皮下注射维托拉森后，其血浆半衰期较短（数小时），但在骨骼肌中的滞留时间较长（数天至数周）。它主要分布于肾脏、肝脏和肌肉。该化合物通过内吞作用和溶酶体降解清除。它不经CYP酶代谢，因此预计不会发生药物相互作用。主要排泄途径是尿液。在人体药代动力学研究中，维托拉森（例如，每周静脉注射20 mg/kg）显示出线性药代动力学特征。输注结束时的达峰时间（Tmax）和血浆消除半衰期为2-3小时，但肌肉半衰期要长得多。其高分子量（约6 kDa）和亲水性PMO骨架限制了口服生物利用度。

在临床前毒理学研究中，viltolarsen 在临床相关剂量下耐受性良好。动物实验中最常见的不良反应为注射部位反应、轻度至中度肾小球肾炎（由 PMO 在肾脏蓄积引起）以及肾小管空泡化，这些不良反应均可逆。未观察到明显的肝毒性、心脏毒性或中枢神经系统毒性。在人体临床试验（II 期研究）中，最常见的不良反应为发热、呕吐、咳嗽和鼻咽炎。未报告与药物相关的严重不良事件或死亡病例。该药物不具有遗传毒性。2020 年，FDA 基于肌营养不良蛋白生成增加这一替代终点，批准 viltolarsen 用于适合进行 53 号外显子跳跃手术的 DMD 患者。目前正在监测其长期安全性和有效性。

[1]. Dzierlega K, et al. Optimization of antisense-mediated exon skipping for Duchenne muscular dystrophy. Gene Ther. 2020;27(9):407-416.

另见：Viltolarsen（注已移至）。

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维托拉森（Viltepso）于2020年8月获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗经确诊的、可进行53号外显子跳跃的杜氏肌营养不良症（DMD）患者。该药由日本新药株式会社（Nippon Shinyaku）的子公司NS Pharma研发。维托拉森是一种磷酰二胺吗啉代寡聚物（PMO），其骨架具有抗核酸酶降解的特性。其化学结构为all-P-ambo-(2',3'-氮杂二基-P,2',3'-三脱氧-P-(二甲氨基)-2',3'-seco)(2'-N->5')(CCTCCGGTTC TGAAGGTGTT C)。CAS号为2055732-84-6。维托拉森以溶液形式提供，仅供研究使用。该化合物不适用于人体研究。

6923.363

2055732-84-6

154562176

White to off-white solid powder

-33.1

2230

29

149

122

465

21200

42

CC1=CN(C(=O)NC1=O)[C@H]2CN(C[C@H](O2)COP(=O)(N3C[C@H](O[C@H](C3)N4C=C(C(=O)NC4=O)C)COP(=O)(N5C[C@H](O[C@H](C5)N6C=NC7=C6N=C(NC7=O)N)COP(=O)(N8C[C@H](O[C@H](C8)N9C=C(C(=O)NC9=O)C)COP(=O)(N1C[C@H](O[C@H](C1)N1C=NC2=C1N=C(NC2=O)N)COP(=O)(N1C[C@H](O[C@H](C1)N1C=NC2=C1N=C(NC2=O)N)COP(=O)(N1C[C@H](O[C@H](C1)N1C=NC2=C(N=CN=C21)N)COP(=O)(N1C[C@H](O[C@H](C1)N1C=NC2=C(N=CN=C21)N)COP(=O)(N1C[C@H](O[C@H](C1)N1C=NC2=C1N=C(NC2=O)N)COP(=O)(N1C[C@H](O[C@H](C1)N1C=C(C(=O)NC1=O)C)COP(=O)(N1C[C@H](O[C@H](C1)N1C=CC(=NC1=O)N)COP(=O)(N1C[C@H](O[C@H](C1)N1C=C(C(=O)NC1=O)C)COP(=O)(N1C[C@H](O[C@H](C1)N1C=C(C(=O)NC1=O)C)COP(=O)(N1C[C@H](O[C@H](C1)N1C=NC2=C1N=C(NC2=O)N)COP(=O)(N1C[C@H](O[C@H](C1)N1C=NC2=C1N=C(NC2=O)N)COP(=O)(N1C[C@H](O[C@H](C1)N1C=CC(=NC1=O)N)COP(=O)(N1C[C@H](O[C@H](C1)N1C=CC(=NC1=O)N)COP(=O)(N1C[C@H](O[C@H](C1)N1C=C(C(=O)NC1=O)C)COP(=O)(N1C[C@H](O[C@H](C1)N1C=CC(=NC1=O)N)COP(=O)(N1C[C@H](O[C@H](C1)N1C=CC(=NC1=O)N)CO)N(C)C)N(C)C)N(C)C)N(C)C)N(C)C)N(C)C)N(C)C)N(C)C)N(C)C)N(C)C)N(C)C)N(C)C)N(C)C)N(C)C)N(C)C)N(C)C)N(C)C)N(C)C)N(C)C)P(=O)(N(C)C)OC[C@@H]1CNC[C@@H](O1)N1C=CC(=NC1=O)N

ZVXLKCOOOKREJD-OERAVCCFSA-N

InChI=1S/C244H381N113O88P20/c1-140-62-343(238(378)290-213(140)359)180-94-322(447(386,298(10)11)405-110-147-60-259-61-174(425-147)337-54-48-168(245)272-232(337)372)74-153(431-180)117-412-454(393,305(24)25)325-78-157(435-183(97-325)346-65-143(4)216(362)293-241(346)381)119-414-460(399,311(36)37)331-84-163(441-189(103-331)352-134-266-197-207(352)278-226(253)284-220(197)366)125-418-457(396,308(30)31)328-80-159(437-186(100-328)349-68-146(7)219(365)296-244(349)384)121-416-462(401,313(40)41)333-87-167(445-191(105-333)354-136-268-199-209(354)280-228(255)286-222(199)368)129-424-465(404,316(46)47)336-88-165(443-194(108-336)357-139-271-202-212(357)283-231(258)289-225(202)371)127-422-459(398,310(34)35)330-81-160(438-188(102-330)351-133-265-196-204(252)261-131-263-206(196)351)122-420-458(397,309(32)33)329-82-161(439-187(101-329)350-132-264-195-203(251)260-130-262-205(195)350)123-421-463(402,314(42)43)334-85-164(442-193(106-334)356-138-270-201-211(356)282-230(257)288-224(201)370)126-419-456(395,307(28)29)327-76-155(433-185(99-327)348-67-145(6)218(364)295-243(348)383)116-411-450(389,301(16)17)320-73-152(430-178(92-320)341-58-52-172(249)276-236(341)376)114-409-453(392,304(22)23)324-77-156(434-182(96-324)345-64-142(3)215(361)292-240(345)380)118-413-455(394,306(26)27)326-79-158(436-184(98-326)347-66-144(5)217(363)294-242(347)382)120-415-461(400,312(38)39)332-86-166(444-190(104-332)353-135-267-198-208(353)279-227(254)285-221(198)367)128-423-464(403,315(44)45)335-83-162(440-192(107-335)355-137-269-200-210(355)281-229(256)287-223(200)369)124-417-451(390,302(18)19)321-71-150(428-179(93-321)342-59-53-173(250)277-237(342)377)112-407-448(387,299(12)13)318-72-151(429-177(90-318)340-57-51-171(248)275-235(340)375)113-408-452(391,303(20)21)323-75-154(432-181(95-323)344-63-141(2)214(360)291-239(344)379)115-410-449(388,300(14)15)319-70-149(427-176(91-319)339-56-50-170(247)274-234(339)374)111-406-446(385,297(8)9)317-69-148(109-358)426-175(89-317)338-55-49-169(246)273-233(338)373/h48-59,62-68,130-139,147-167,174-194,259,358H,60-61,69-129H2,1-47H3,(H2,245,272,372)(H2,246,273,373)(H2,247,274,374)(H2,248,275,375)(H2,249,276,376)(H2,250,277,377)(H2,251,260,262)(H2,252,261,263)(H,290,359,378)(H,291,360,379)(H,292,361,380)(H,293,362,381)(H,294,363,382)(H,295,364,383)(H,296,365,384)(H3,253,278,284,366)(H3,254,279,285,367)(H3,255,280,286,368)(H3,256,281,287,369)(H3,257,282,288,370)(H3,258,283,289,371)/t147-,148-,149-,150-,151-,152-,153-,154-,155-,156-,157-,158-,159-,160-,161-,162-,163-,164-,165-,166-,167-,174+,175+,176+,177+,178+,179+,180+,181+,182+,183+,184+,185+,186+,187+,188+,189+,190+,191+,192+,193+,194+,446?,447?,448?,449?,450?,451?,452?,453?,454?,455?,456?,457?,458?,459?,460?,461?,462?,463?,464?,465?/m0/s1

1-[(2R,6S)-6-[[[(2S,6R)-2-[[[(2R,6S)-2-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-6-[[[(2S,6R)-2-[[[(2R,6S)-2-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-6-[[[(2R,6S)-2-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-6-[[[(2S,6R)-2-[[[(2S,6R)-2-[[[(2R,6S)-2-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-6-[[[(2S,6R)-2-[[[(2S,6R)-2-[[[(2S,6R)-2-[[[(2S,6R)-2-[[[(2R,6S)-2-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-6-[[[(2R,6S)-2-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-6-[[[(2R,6S)-2-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-6-[[[(2R,6S)-2-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-6-[[[(2S,6R)-2-[[[(2R,6S)-2-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-6-[[[(2R,6S)-2-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-6-(hydroxymethyl)morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]-6-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]-6-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]-6-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]-6-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]-6-(6-aminopurin-9-yl)morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]-6-(6-aminopurin-9-yl)morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]-6-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]-6-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)morpholin-4-yl]-(dimethylamino)phosphoryl]oxymethyl]-4-[[(2S,6R)-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)morpholin-2-yl]methoxy-(dimethylamino)phosphoryl]morpholin-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~100 mg/mL (~14.44 mM)

配方 1 中的溶解度: 50 mg/mL (7.22 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。