DNA-PK; DDR/DNA damage; DSBs (DNA double-strand breaks)

在 U251 和 NSC11 细胞中，VX-984（0-500 nM，30 分钟）抑制辐射引起的 DNA-PKcs 磷酸化 [1]。在 U251 和 NSC11 细胞中，VX-984 (0-500 nM) 以浓度依赖性方式增加 DNA-PKcs 磷酸化 [1]。 VX-984 (0-1 μM) 增强了 DSB 修复的替代机制，包括同源重组 (HR) 和放射重力 [1]。和 mNHEJ，或突变 NHEJ[2]。药物化合物含有氢、碳和其他元素的稳定重同位素。这些同位素主要用作药物开发中的定量示踪剂。由于其药代动力学特性和衍生特征而引起人们的兴趣[4]。黄昏物质可能具有以下好处：（1）延长体内半衰期。导致死亡的化合物可能能够延长化合物的体内半衰期或其药代动力学特性。这可以提高药物的便利性，同时也增强化合物的安全性、有效性和耐受性。增强肠道生物利用度 (2)。在肠壁和脐中，氘化物质会降低所需的代谢（首过代谢），从而增加到达其预期作用部位的不需要的药物的量。低剂量下更好的耐受性和活性取决于高生物利用度。 (3) 性能增强。氘化物质可提高死亡安全性并降低毒性或反应性 (4)。致死物质是无害的，并且能够减轻或消除药物化合物的负面影响。 (5) 保持其治疗特性。先前调查中预测死亡

在原位脑肿瘤异种移植物中，VX-984（0-100 mg/kg，口服强饲，每日）抑制辐射引起的 DNA-PKcs 磷酸化 [1]。口服 VX-984（0-50 mg/kg），每日两次，持续两天，可改善脑肿瘤异种移植物的放射敏感性[1]。

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将这些结果扩展到体内模型，用VX-984治疗小鼠抑制了原位脑肿瘤异种移植物中辐射诱导的DNA-PKcs磷酸化，表明该化合物在足够的浓度下穿过血脑肿瘤屏障。对于携带U251或NSC11脑肿瘤的小鼠，单独使用VX-984治疗对总体生存率没有显著影响；单靠辐射就能提高存活率。与对照组和单独辐射相比，接受联合方案的小鼠的存活率显著提高。这些结果表明，VX-984增强了脑肿瘤异种移植物的放射敏感性，并表明它可能有利于GBM的治疗管理[1]。

Neutral comet assay[1]
根据制造商的建议，使用市售试剂盒进行Neutral comet assay试验，并稍作修改。简而言之，单层被照射（10 Gy）并返回培养箱。在指定时间，产生单细胞悬浮液，用PBS洗涤，与低熔点琼脂糖（1:10）混合，并转移到提供的载玻片上。细胞在4°C下在湿冰上裂解1小时，在室温下电泳20分钟，并用70%乙醇固定。用SYBR Green对DNA进行染色，并用TriTek CometScore分析数字荧光图像。数据以剩余损伤百分比表示，其中在冰上照射并在照射后立即收集的培养物的橄榄尾力矩设置为100%损伤，照射后的剩余时间相应地归一化。通过减去假照射载体或VX-984处理样品的Olive尾矩，对VX-984或单独载体处理的所有时间点进行校正。每种条件下至少测量50个细胞。所提供的数据是3个独立实验的平均值±SEM。

蛋白质印迹分析 [1]
细胞类型： U251 和 NSC11 细胞
测试浓度： 0、100、250 和 500 nM
孵育持续时间：30 分钟
实验结果：所示浓度。当在辐射前 1 小时施用 VX-984 时，在每个神经胶质瘤系中观察到辐射诱导的 DNA-PKcs 磷酸化依赖性减少。单独使用 VX-984 治疗无效。

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类别转换重组分析[2]
通过用ACK裂解缓冲液裂解红细胞，然后使用抗CD43 MACS微珠和Mini-MACS柱进行反向选择，分离出B细胞。收集的B细胞在37°C下用5μM CFSE染色10分钟，然后在含有10%FBS、1x青霉素/链霉素、1%L-谷氨酰胺、1x MEM非必需氨基酸、1%丙酮酸钠、1%HEPES和53 mM 2-巯基乙醇的RPMI-1640中培养。培养基中补充了来自大肠杆菌的25μg/ml LPS、50 U/ml白细胞介素-4和1:1000大鼠抗CD180。在37°C和5%CO2的条件下，用VX-984（0.2、0.4和0.8μM）培养细胞72小时。 用5μl抗小鼠CD16/CD32阻断B细胞。一抗生物素大鼠抗小鼠IgG1和FITC大鼠抗鼠CD45R/B220以10μl的1:100稀释液加入，然后加入10μl 1:100稀释的链霉抗生物素-A647。使用Becton Dickinson FACSCalibur测量细胞增殖和IgG+细胞，并通过FlowJo软件分析数据。

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终止加入双报告子（EJ-DR）检测[2]
将U2OS EJ-DR细胞铺在含有10%炭剥离FBS和1%抗生素抗真菌剂的DMEM中的6孔板中。72小时后，洗涤细胞，用含有10%无tet FBS和1%抗生素抗真菌剂的DMEM代替培养基，并加入VX-984（0.5、0.7和1.0μM）。为了在I-Sce1位点诱导双链断裂，在药物加入后30分钟加入1μM Shield1和100nM曲安奈德。24小时后，洗涤细胞，加入新鲜的EJ-DR无Tet培养基和药物。72小时后，收集细胞，使用Becton Dickinson FACSCalibur测量HR和NHEJ水平，并通过FlowJo软件分析数据。

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免疫荧光分析[2]
该测定用于观察DNA损伤后，有和没有VX-984时，H2AX病灶的存在和随后的分辨率随时间的变化。磷酸化组蛋白变体H2AX（γ-H2AX）的水平是DNA损伤水平的替代标志。双链断裂（DSB）后，γH2AX立即形成明亮的核灶，可以通过免疫荧光显微镜进行染色和可视化。γ-H2AX病灶的存在被广泛认为是细胞中DSB的标志，并已被证明对DSB具有特异性[38]。我们使用γ-H2AX抗体来观察DNA损伤的细胞。

动物/疾病模型： 无胸腺雌性裸鼠（6-8 周龄，每组 7-8 只小鼠，U251 脑内异种移植）[1]
剂量： 0、50 和 100 mg/kg
给药途径： 每日经口灌胃，在照射（10 Gy）前 1 或 4 小时
实验结果： 照射后 DNA-PKcs 磷酸化水平降低。

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动物/疾病模型： 无胸腺雌性裸鼠（6-8周龄，每组7只，U251脑内异种移植瘤）[1]
剂量： 0、50 mg/kg
给药途径： 灌胃给药（po），每日两次，在局部肿瘤照射（3Gy）前30分钟给药，随后4小时（hrs (hours)），连续3天（3 × 3Gy）
实验结果： 与载体相比，单独使用VX-984治疗U251肿瘤对总生存期没有显著影响；单独放疗可提高生存率。与单独放疗相比，VX-984 与放疗联合治疗提高了肿瘤的放射敏感性，并显著提高了小鼠的生存率。

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原位异种移植[1]
将转导表达荧光素酶和 GFP 的 U251 (2.5 × 10⁵) 细胞或 CD133⁺ NSC11 (1.0 × 10⁵) 细胞（使用慢病毒 LVpFUGQ-UbC-ffLuc2-eGFP2 转导）颅内植入 6 至 8 周龄无胸腺雌性裸鼠 (Ncr nu/nu；NCI 动物生产计划) 的右侧纹状体，植入位置位于前囟前 1.0 mm、侧方 2.0 mm 处，深度为 3.0 mm，具体方法如前所述。生物发光成像 (BLI) 和局部照射均按先前描述的方法进行。将VX-984溶解于新鲜配制的5%甲基纤维素溶液中，并通过灌胃法给药。植入后第6天（U251组）或第20天（NSC11组），所有小鼠均检测到稳定的生物发光成像（BLI）信号。随后，根据BLI信号强度将小鼠随机分为四组：载体组、VX-984组、放射组（3 × 3 Gy）和VX-984联合放射组（每组7-8只小鼠）。治疗于次日开始。连续3天进行3 Gy放射治疗，每天在放射治疗前0.5小时和后4小时通过灌胃法给予VX-984（溶解于5%甲基纤维素溶液中）。进行辐射照射时，小鼠先用氯胺酮/赛拉嗪/醋丙嗪混合麻醉剂麻醉，然后置于通风良好的有机玻璃支架中，支架上设有覆盖小鼠整个躯干以及头部重要正常结构（耳朵、眼睛和颈部）的屏蔽层。辐射照射使用X-Rad 320 X射线照射器，配备2.0 mm铝滤片（峰值电压300 kV；电流10 mA），剂量率为2.9 Gy/分钟。所有体内辐射照射实验均使用同一台位于动物房内的仪器进行；每年进行一次产量和质量保证。每天监测小鼠直至出现神经系统症状（发病率）。辐射后，每两周（U251）或每周（NSC11）测量一次生物发光成像（BLI）和体重，直至该组第一只小鼠死亡。

[1]. The DNA-PK Inhibitor VX-984 Enhances the Radiosensitivity of Glioblastoma Cells Grown In Vitro and as Orthotopic Xenografts. Mol Cancer Ther. 2018 Jun;17(6):1207-1216.

[2]. VX-984 is a selective inhibitor of non-homologous end joining, with possible preferential activity in transformed cells. Oncotarget. 2018 May 25;9(40):25833-25841.

[3]. Abstract 3716: Potent radiation enhancement with VX-984, a selective DNA-PKcs inhibitor for the treatment of NSCLC. Cancer Res (2016) 76 (14_Supplement): 3716.

[4]. Impact of Deuterium Substitution on the Pharmacokinetics of Pharmaceuticals. Ann Pharmacother. 2019 Feb;53(2):211-216.

DNA依赖性蛋白激酶抑制剂VX-984是一种ATP竞争性DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）催化亚基抑制剂，具有增强化疗和放疗疗效的潜在作用。给药后，DNA-PK抑制剂VX-984与DNA-PK催化亚基结合并抑制其活性，从而干扰非同源末端连接（NHEJ）过程，阻止电离辐射或化疗引起的DNA双链断裂（DSB）的修复。这可增强化疗和放疗的细胞毒性，并导致肿瘤细胞死亡增加。肿瘤细胞修复DSB的能力增强是肿瘤细胞对化疗和放疗产生耐药性的主要原因；DNA-PK在NHEJ通路和DSB修复中发挥关键作用。

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放疗是胶质母细胞瘤（GBM）的主要治疗手段。由于DNA-PKcs是修复辐射诱导的DNA双链断裂（DSB）的关键因子，本研究评估了一种新型DNA-PKcs抑制剂VX-984增强胶质母细胞瘤（GBM）细胞放射敏感性的潜力。在体外条件下，用VX-984处理已建立的GBM细胞系U251和GBM干细胞样细胞（GSC）系NSC11，结果显示VX-984浓度依赖性地抑制了辐射诱导的DNA-PKcs磷酸化。克隆形成分析表明，VX-984处理以类似的浓度依赖性方式增强了各GBM细胞系的放射敏感性。γH2AX表达和中性彗星分析结果显示，VX-984抑制了U251和NSC11 GBM细胞中辐射诱导的DNA双链断裂的修复，提示VX-984诱导的放射增敏作用是通过抑制DNA修复实现的。 [1]

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目的：DNA双链断裂（DSB）可通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）进行修复。我们利用此前未报道的检测方法，验证了DNA-PK抑制剂VX-984的选择性。实验设计：采用原代B细胞中的类别转换重组（CSR）检测NHEJ的效率。采用细胞报告基因检测（U2OS EJ-DR）评估VX-984处理细胞中HR和NHEJ的效率。免疫荧光检测（IF）评估人星形胶质细胞和T98G胶质瘤细胞中γ-H2AX灶的DSB修复动力学。采用蛋白质印迹法评估DNA-PKcs底物的磷酸化情况。结果：我们发现VX-984可剂量依赖性地降低类别转换重组（CSR）效率，并通过EJ-DR检测发现HR和mNHEJ的效率显著剂量依赖性增加。免疫荧光检测显示，在VX-984存在的情况下，恶性细胞无法解析γ-H2AX灶。VX-984处理进一步降低了辐射诱导的DNA-PK底物磷酸化。结论：VX-984可有效抑制NHEJ，导致替代修复途径的代偿性增加，增加DNA双链断裂（DSB），并且似乎优先影响转化细胞。[2]

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电离辐射（IR）广泛用于癌症治疗，它会导致DNA双链断裂（DSB）。如果不进行修复，这些DSB对细胞是致命的。 DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）是非同源末端连接（NHEJ）通路中的关键酶，该通路可修复由电离辐射（IR）或化疗药物（如阿霉素）引起的双链断裂（DSB）。本研究旨在表征VX-984（一种选择性强效的DNA-PK催化亚基ATP竞争性抑制剂，即DNA-PKcs抑制剂）的放射增效作用，重点关注非小细胞肺癌（NSCLC）细胞和肿瘤异种移植模型。体外实验表明，VX-984可增强包括NSCLC细胞系在内的多种癌细胞系的IR细胞毒性，剂量增强因子（DEF）大于3。值得注意的是，与单独使用IR相比，VX-984与IR联合使用对正常人肺成纤维细胞的细胞毒性增强作用甚微。此外，VX-984在体外和体内均能降低非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中DNA-PKcs在S2056位点的自磷酸化水平，并减弱电离辐射（IR）诱导的DNA损伤标志物γH2AX和pKAP1的衰减。在NSCLC患者来源异种移植（PDX）模型中，VX-984联合IR（2 Gy x 3）可产生持久的完全缓解，而单独使用IR仅能延缓肿瘤生长，这与DNA损伤修复延迟相符。在这些模型中，VX-984联合IR的耐受性良好。这些数据表明，VX-984是一种有效的放射增敏剂，并为VX-984联合IR治疗NSCLC提供了强有力的理论依据。[3]

C23H23N7O

415.487346887589

415.209

C, 66.49; H, 6.06; N, 23.60; O, 3.85

1476074-39-1

1476071-49-4 (normal);1562396-65-9 (demethyl);1476074-39-1 (deuterium);

72188357

White to off-white solid powder

2.7

106

2

7

6

31

582

1

O=C(C1C=CN=C2C=1C=CC=C2[C@H](C)CNC1C=C(C2=C([2H])N=C(C)N=C2[2H])N=CN=1)NC

PEACIOGDEQRHFA-KIYKJNLWSA-N

InChI=1S/C23H23N7O/c1-14(17-5-4-6-18-19(23(31)24-3)7-8-25-22(17)18)10-28-21-9-20(29-13-30-21)16-11-26-15(2)27-12-16/h4-9,11-14H,10H2,1-3H3,(H,24,31)(H,28,29,30)/t14-/m1/s1/i11D,12D

(S)-N-methyl-8-(1-((2'-methyl-[4,5'-bipyrimidin]-6-yl-4',6'-d2)amino)propan-2-yl)quinoline-4-carboxamide

VX-984; VX 984; 1476074-39-1; UNII-0C33IBK195; 0C33IBK195; VX984; 8-[(2S)-1-[[6-(4,6-dideuterio-2-methylpyrimidin-5-yl)pyrimidin-4-yl]amino]propan-2-yl]-N-methylquinoline-4-carboxamide; VX984; M9831; M-9831; M 9831

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~10 mg/mL (~24.07 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (2.41 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (2.41 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。