WST-8 sodium   中文名称: 水溶性四氮唑-8

water-soluble tetrazolium dye

在48和72小时进行乳液聚合以介导G-CSF的功效。将广泛使用的基于 MTS 的测试与使用浓度为 7 × 105 个细胞/mL 的 NFS-60 细胞与 24 ℃ 浓度为 800 IU/mL 的颗粒化 G-CSF 进行的可溶性四唑染料 WST-8 的生物测定进行比较。使用优化的基于 WST-8 的染料测定法评估了几种市售聚合物介导的 G-CSF 制剂的有效性。结果表明，在使用 NFS-60 细胞系评估聚合 G-CSF 的功效时，基于 WST-8 的测试比传统的基于 MTS 的检测提供了更高的一致性 [1]。

使用NFS-60细胞的体外生物测定[1]
使用MTS测试聚乙二醇化G-CSF效力的体外生物测定基于欧洲药典（欧洲药典引文6.3）中概述的方法。按照制造商试剂盒手册的建议进行CCK-8测定。NFS-60细胞在含有10%胎牛血清（FBS）和50 µg/ml庆大霉素。在接种之前，用RPMI-1640洗涤细胞三次，并通过在1500下离心进一步从溶液中分离 rpm持续7 分钟。使用台盼蓝染料排除法对细胞进行计数（Colotta等人，引文1992；Strober，引文2001）。不同的NFS-60细胞浓度范围从4 × 105至12 × 105 在RPMI-1640中制备细胞/ml，并向细胞中加入一定范围的PEG化G-CSF稀释液 IU/ml。适当的细胞浓度（7 × 105 细胞/ml）分配到具有50 µl/孔体积。向细胞中加入适当稀释的聚乙二醇化G-CSF（即800 如欧洲药典所建议的IU/ml）加入孔中。相对于PEG化G-CSF的每个稀释度或浓度，为每个细胞浓度分配六个重复。6口阴性对照井，50口 µl的RPMI-1640代替聚乙二醇化的G-CSF也包括在研究中。在本研究中使用了内标，内标的效力被认为是100%。

测定板在37 在5–7%的CO2培养箱中培养24、48、72和96°C h个时间点。在每个时间间隔，从培养箱中取出三块平板，并进行MTS和WST-8测定以研究细胞增殖。水溶性四氮唑染料MTS/PMS（10 µl，共5个 mg/ml）或WST-8（10 µl，如试剂盒中所示）添加到每个孔中，并额外孵育4 h在37 在5–7%二氧化碳培养箱中，温度为°C。在吸光度（光密度）OD490下读取平板 MTS和OD450的nm nm的WST-8在微量滴定板读取器（Molecular Devices，Silicon Valley，CA）中。类似地，来自其他制造商的Peg化G-CSF制剂（Peg Grafeel PGAS01512、Neulastim B1029B05、NeuPEG 5010043）也用相同的基于WST-8的测定法进行测试，以确定该测定法的功效以及其他市售的Peg化的G-CSF制剂的功效。

聚乙二醇化G-CSF浓度的研究[1]
对于聚乙二醇化G-CSF对NFS-60细胞的剂量-反应关系，7 × 105 用不同浓度的聚乙二醇化G-CSF刺激细胞/ml 48 h，并因此通过基于MTS和WST-8的测定来测量增殖反应。用于刺激NFS-60细胞的PEG化G-CSF的浓度为500、600、700、800、900、1000、1100和1200 IU/ml。通过用受刺激细胞的OD减去未刺激细胞的OD来计算作为增殖反应测量的光密度变化（ΔOD）。在700–800中观察到，聚乙二醇化G-CSF刺激NFS-60细胞后，其增殖反应呈剂量依赖性增强 MTS测定中的IU/ml和600–700的窄范围 在WST-8测定中为IU/ml。[1]

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细胞浓度研究[1]
为了优化细胞浓度以用于聚乙二醇化G-CSF的基于细胞的生物测定，不同浓度的NFS-60细胞从4 × 105至12 × 105 将细胞/ml接种在96孔细胞培养板中，随后用800 IU/ml聚乙二醇化G-CSF 48 h.在培养期结束时，通过MTS和WST-8测定来测定平板的增殖反应。[1]

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潜伏期研究[1]
为了测量评估NFS-60细胞增殖反应的最佳孵育时间，7 × 用800刺激105个NFS-60细胞/ml IU/ml聚乙二醇化G-CSF，并在不同的时间间隔（24、48、72和96 h） 通过MTS和WST-8测定。

[1]. A sensitive WST-8-based bioassay for PEGylated granulocyte colony stimulating factor using the NFS-60 cell line. Pharm Biol. 2015 Jun;53(6):849-54.

In the present study, the WST-8-based assay was found superior than the MTS-based assay for the quantification of the proliferative responses of the NFS-60 cells to PEGylated G-CSF. Further, our study demonstrates the potential application of WST-8-based bioassays for other biotherapeutic proteins of human and veterinary interest.[1]

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Context: Granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) has been commonly used to treat neutropenia caused by chemotherapy, radiotherapy, and organ transplants. Improved in vitro efficacy of G-CSF has already been observed by conjugating it to polyethylene glycol (PEG). Objective: The in vivo bioassay using tetrazolium dye with the NFS-60 cell line has been recommended for G-CSF but no such monographs are available for PEGylated G-CSF in pharmacopeias. In the present study, the assay recommended for G-CSF was evaluated for its suitability to PEGylated G-CSF. Materials and methods: The generally used MTS [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium]-based assay was compared with a bioassay employing a water-soluble tetrazolium dye, WST-8 [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium], using NFS-60 cells at a concentration of 7 × 10(5) cells/ml against 800 IU/ml of PEGylated G-CSF at 24, 48, 72, and 72 h time points to determine the efficacy of PEGylated G-CSF. Further, the optimized WST-8 dye-based assay was used to test the potency of various commercially available PEGylated G-CSF preparations. Results: The results demonstrated enhanced sensitivity of the WST-8-based assay over the conventional MTS-based assay for determining the potency of PEGylated G-CSF using the NFS-60 cell line. Conclusion: Our study demonstrates the potential application of WST-8-based bioassays for other biotherapeutic proteins of human and veterinary interest.[1]

C20H13N6NAO11S2

600.4706

599.9981

C, 40.01; H, 2.18; N, 14.00; Na, 3.83; O, 29.31; S, 10.68

193149-74-5

193149-74-5 (sodium);755734-51-1 (free acid);

9894947

White to yellow or light yellow crystalline powder

4.052

266.62

0

13

4

40

1080

0

S(C1C([H])=C(C([H])=C([H])C=1C1=NN(C2C([H])=C([H])C(=C([H])C=2[H])[N+](=O)[O-])[N+](C2C([H])=C([H])C(=C([H])C=2OC([H])([H])[H])[N+](=O)[O-])=N1)S(=O)(=O)[O-])(=O)(=O)[O-].[Na+]

YCAKCISJXLQUEQ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H13N6O11S2.Na/c1-37-18-10-14(26(29)30)6-9-17(18)24-22-20(21-23(24)12-2-4-13(5-3-12)25(27)28)16-8-7-15(38(31,32)33)11-19(16)39(34,35)36/h2-11H,1H3/q-1+1

4-(3-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-tetrazol-3-ium-5-yl)-3-sulfobenzenesulfonate, sodium salt

WST-8; WST 8; 270078-53-0; MFCD09264687; sodium 4-(3-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-tetrazol-3-ium-5-yl)benzene-1,3-disulfonate; sodium;4-[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate; WST-8 Sodium; WST8.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮和光照。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

H2O : ~83.33 mg/mL (~138.77 mM)
DMSO : ~10 mg/mL (~16.65 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (1.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (1.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (1.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 100 mg/mL (166.54 mM) in PBS (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。