WZB117

Glucose transporter 1 (Glut1)
WZB117 reduced glucose transport in cancer cells in a dose-dependent manner, according to the glucose uptake assay. The assay was completed in less than a minute, indicating that WZB117-induced reduction of glucose transport may be the result of a quick and direct mechanism. WZB117 reduced cancer cell proliferation with an IC50 of about 10 μM, according to an experiment for cell viability. The clonogenic experiment verified WZB117's inhibitory effect on cancer cell development and demonstrated the irreversible nature of this inhibition. WZB117 therapy had a far greater cell growth inhibitory effect on lung cancer A549 cells than it did on non-tumorigenic lung NL20 cells. MCF7 breast cancer cells and their non-tumorigenic MCF12A counterparts showed comparable outcomes. Greater suppression of cell development was reported when WZB117 was given to cancer cells cultivated under hypoxia settings as opposed to normoxic ones [1].

根据葡萄糖摄取测定，WZB117 以剂量依赖性方式减少癌细胞中的葡萄糖转运。该测定在不到一分钟内完成，表明 WZB117 诱导的葡萄糖转运减少可能是快速直接机制的结果。根据细胞活力实验，WZB117 减少癌细胞增殖，IC50 约为 10 μM。克隆实验验证了WZB117对癌细胞发育的抑制作用，并证明了这种抑制的不可逆性。 WZB117疗法对肺癌A549细胞的细胞生长抑制作用远大于对非致瘤性肺NL20细胞的细胞生长抑制作用。 MCF7 乳腺癌细胞和非致瘤性 MCF12A 细胞表现出类似的结果。据报道，与常氧环境相比，当将 WZB117 给予在缺氧环境下培养的癌细胞时，细胞发育受到更大的抑制 [1]。

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WZB117 以剂量依赖的方式抑制人非小细胞肺癌 A549 细胞的葡萄糖摄取。[1]
WZB117 (30 μmol/L) 在 1 分钟内迅速且完全地抑制 A549 细胞的葡萄糖转运。[1]
通过 MTT 实验测定，WZB117 在 A549 细胞中抑制癌细胞增殖的 IC50 约为 10 μmol/L。[1]
克隆形成实验表明，WZB117 处理可导致 A549、H1299 和 MCF7 癌细胞系发生不可逆的生长抑制。[1]
在处理 48 小时后，WZB117 对人肺癌 A549 细胞增殖的抑制显著强于对非致瘤性肺 NL20 细胞的抑制。在乳腺癌 MCF7 细胞与其非致瘤性对应细胞 MCF12A 的比较中也观察到类似的选择性效应。[1]
在低氧条件下，WZB117 处理对 A549 细胞的生长抑制比在常氧条件下更强。[1]
观察到 WZB117 与化疗药物顺铂或紫杉醇之间存在协同抗癌效应。[1]
WZB117 (30 μmol/L) 抑制了以 Glut1 为唯一葡萄糖转运蛋白的人红细胞的葡萄糖转运。[1]
WZB117 也抑制了由红细胞衍生的内翻外囊泡和外翻外囊泡中的葡萄糖转运。[1]
在 A549 细胞中，WZB117 (10 μmol/L) 处理最早在 12 小时就导致 Glut1 蛋白水平下降，而 Glut1 mRNA 水平在 24 小时上调。[1]
WZB117 处理最早在 6-12 小时就降低了 A549 细胞的细胞外乳酸水平和细胞内 ATP 水平，并在 24 小时进一步下降。[1]
在添加 WZB117 (30 μmol/L) 的同时添加细胞外 ATP (0.5-10 mmol/L) 能显著增加细胞内 ATP 并在 24 小时后拯救 A549 细胞活力。延迟添加 ATP（12 小时后）则丧失拯救能力。添加 ATP 不能拯救紫杉醇处理的细胞。[1]
WZB117 处理最早在处理后 6 小时诱导了细胞自噬。[1]
与单独使用 WZB117 (1 μmol/L) 相比，将其与线粒体抑制剂寡霉素 (50 nmol/L) 联合处理 A549 细胞能进一步降低细胞增殖。[1]
WZB117 处理在 6 和/或 12 小时降低了关键糖酵解酶己糖激酶 II 和 PKM2 的水平，但它们在 24 小时上调。PGAM1 水平未受影响。[1]
蛋白质印迹分析显示，WZB117 处理在 6 和 12 小时降低了磷酸化 Akt 和 mTOR 的水平，并上调了磷酸化 AMPK 的水平，这与 ATP 下降的时间点一致。[1]
WZB117 诱导内质网应激，表现为 GRP78/BiP 蛋白水平从 6 小时到 48 小时增加，以及磷酸化 eIF2α 增加，但未显著增加 CHOP 表达或诱导大量细胞凋亡（PARP 切割水平低）。[1]
流式细胞术分析显示，WZB117 处理在 48 小时导致 A549 细胞坏死约增加 8%，而凋亡仅约 2%。[1]
WZB117 处理引起 A549 细胞周期阻滞，在 24 小时，G0-G1 期细胞约增加 23%，G2-M 期细胞约增加 4%，S 期细胞减少约 30%。同时伴随 CDK2、细胞周期蛋白 E2 和磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白水平的下降。[1]
WZB117 处理在 24 小时诱导 A549 细胞衰老，证据包括细胞形态增大、衰老相关的 β-半乳糖苷酶表达、不可逆的生长抑制以及 pRb 的变化。[1]

根据动物研究，与模拟 (PBS/DMSO) 治疗的肿瘤相比，每日腹膜内注射 10 mg/kg 体重剂量的 WZB117 后，化合物治疗的肿瘤平均大小减少了近 70%。最令人惊讶的是，治疗后，用化合物治疗的 10 个肿瘤中有 2 个停止生长，甚至在试验期间消失。与模拟处理的小鼠相比，WZB117 处理的小鼠体重减轻了 1 至 2 克，其中脂肪组织占体重减轻的大部分。这些发现基于体重的测量和分析。该研究的结论显示，虽然细胞计数保持在正常范围内，但化合物治疗的小鼠的淋巴细胞和血小板计数与载体治疗的小鼠不同。使用葡萄糖转运抑制剂引起了某些担忧，因为接受治疗的小鼠可能会出现高血糖[1]。

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每日腹腔注射 WZB117 (10 mg/kg 体重)，持续 10 周，导致裸鼠中人 A549 肺癌异种移植瘤的平均体积比 PBS/DMSO 溶剂对照组减少 70% 以上。值得注意的是，治疗组 10 个肿瘤中有 2 个在研究过程中消失。[1]

蛋白质靶点研究I：红细胞膜囊泡制备和葡萄糖摄取测定[1]
红细胞和红细胞衍生的囊泡是使用已发表的方案进行微小修改制备的。使用密封囊泡的葡萄糖摄取测定与RBC中的类似，不同之处在于在每次洗涤步骤后以18000×g离心20分钟以沉淀囊泡。

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蛋白质靶点研究II：对接研究[1]
使用Spartan 10构建WZB117的分子模型（Wavefunction股份有限公司；参考文献23）。在默克分子力场的分子力学能量最小化之后，将化合物结构导出到Macromodel，并对接到Glut1同源性建模的PDB结构1SUK蛋白质和网格制备使用默认方案的FirstDiscovery 2.7的Glide模块进行，并以传输通道的中间为中心，边界框包围整个通道。然后使用Glide对接WZB117，并根据Glide计算的Emodel值选择化合物的最佳对接结构。

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蛋白质印迹分析、RNA分离和实时聚合酶链式反应[1]
使用标准方案进行蛋白质印迹分析。Glut1（H-43）、eIF2α和环磷酰胺-阿霉素-长春新碱-泼尼松（CHOP）的抗体来自Santa Cruz；PGAM1抗体来自Novus Biologicals。p-eIF2α抗体来自Invitrogen。

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使用RNeasy总RNA提取试剂盒从处理的A549细胞中分离RNA，并使用Bio-Rad iScript Select cDNA合成试剂盒合成cDNA。使用Bio-Rad iCycler和Bio-Rad iQ SyBr Green Supermix试剂盒，使用所产生的cDNA来特异性地定量SLC2A1（Glut1）的转录物。人SLC2A1和β-肌动蛋白的RT2-PCR引物组来自SuperArray。为了量化转录水平，使用了δCt方法。β-肌动蛋白mRNA用作使Glut1 mRNA正常化的内部对照。

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乳酸和ATP测量及ATP抢救研究[1]
使用乳酸测定试剂盒II测量细胞外乳酸浓度。 使用来自Perkin-Elmer的ATPlite发光ATP检测测定系统测量细胞内ATP浓度。简言之，将细胞以50000个细胞的密度接种在96孔板的每个孔中。在治疗6、12和24小时后测量ATP水平。测定每个孔中细胞的蛋白质浓度，用于信号归一化的乳酸和ATP测量。 在细胞拯救研究中，在含有或不含有30μmol/L WZB117的96细胞板的癌症细胞的细胞培养基中加入不同浓度的ATP。在处理后24小时通过MTT测定法测量细胞内ATP水平和细胞活力。

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进行了分子对接研究以探索 WZB117 与 Glut1 的相互作用。使用了人 Glut1 的同源模型（基于 PDB 结构 1SUK）。将化合物结构进行能量最小化后，使用基于网格的对接方法将其对接到 Glut1 的转运通道中。对接中心位于通道中央，边界框覆盖整个通道。根据计算的 Glide 评分选择最佳对接构象。分析表明，WZB117 结合于 Glut1 的中央通道区域，与氨基酸残基 Asn34、Arg126 和 Trp412 形成三个氢键。[1]

癌症细胞和人红细胞葡萄糖摄取测定[1]
如前所述，通过测量2-脱氧-d-[3H]葡萄糖的细胞摄取来分析化合物对葡萄糖转运的抑制活性。
类似的程序用于人红细胞（RBC）的葡萄糖摄取测定，不同之处在于通过以2000×g离心5分钟来洗涤和收集RBC，因为它们是悬浮细胞，并且在测量放射性之前，将处理过的RBC溶解在0.1%SDS中。

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细胞增殖（MTT）和克隆形成测定[1]
使用MTT增殖测定试剂盒（Cayman）或克隆原测定法测量细胞增殖和存活率。

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缺氧研究[1]
癌症细胞缺氧研究是使用Anaerobe气体生成袋系统和指示剂进行的。该袋形成无氧环境，在该无氧环境中将化合物处理的细胞孵育24小时。缺氧孵育后，通过MTT测定法测量处理的细胞的生存能力。

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癌细胞葡萄糖摄取实验：用 WZB117 或溶剂处理细胞，然后测量 2-脱氧-D-[³H] 葡萄糖的摄取。洗涤、裂解细胞后计数放射性以确定葡萄糖转运抑制情况。[1]
人红细胞及红细胞衍生囊泡的葡萄糖摄取实验：洗涤红细胞并通过离心收集。对于囊泡，使用更高转速离心洗涤后的囊泡。处理后的红细胞或囊泡在测量放射性前被溶解。[1]
细胞增殖/活力实验：使用 MTT 实验试剂盒测量细胞增殖和活力。将细胞接种于板中，用 WZB117 处理，孵育后加入 MTT 试剂。溶解形成的甲臜晶体，测量吸光度。[1]
克隆形成实验：用 WZB117 处理细胞，然后将有限数量的细胞重新接种到培养皿中，使其生长成集落一段时间（例如 10-14 天）。固定、染色并计数集落以评估不可逆的生长抑制。[1]
低氧研究：用 WZB117 处理细胞后立即转移到厌氧袋系统中以创建无氧环境。细胞在低氧下孵育 24 小时，然后通过 MTT 实验测量活力。[1]
蛋白质印迹分析：用 WZB117 处理后裂解细胞。裂解物进行 SDS-PAGE，转膜，并用特异性一抗（例如针对 Glut1、磷酸化 Akt、磷酸化 mTOR、磷酸化 AMPK、GRP78/BiP、磷酸化 eIF2α、CHOP、PARP、CDK2、细胞周期蛋白 E2、磷酸化 Rb、己糖激酶 II、PKM2、PGAM1）进行孵育。与二抗孵育后检测信号。使用 β-肌动蛋白或 β-微管蛋白作为上样对照。[1]
Glut1 mRNA 的实时荧光定量 PCR：从处理过的 A549 细胞中提取总 RNA，逆转录成 cDNA，然后使用针对人 SLC2A1 (Glut1) 和 β-肌动蛋白（作为内参）的特异性引物进行定量实时 PCR。使用 δCt 法进行定量。[1]
乳酸测量：使用商业乳酸检测试剂盒测量处理细胞培养上清液中的细胞外乳酸浓度。[1]
细胞内 ATP 测量：使用基于化学发光的 ATP 检测系统测量处理细胞内的 ATP 水平。[1]
ATP 拯救实验：在存在或不存在 WZB117 的情况下，将不同浓度的 ATP 添加到癌细胞的培养基中。24 小时后，测量细胞内 ATP 水平和细胞活力（通过 MTT 实验）。[1]
细胞周期分析：固定处理过的细胞，用碘化丙啶染色，并通过流式细胞术分析以确定细胞在不同细胞周期时相（G0-G1、S、G2-M）的分布。[1]
流式细胞术检测凋亡/坏死：根据说明书用 Annexin V-FITC 和碘化丙啶对处理细胞进行染色，然后通过流式细胞术分析以区分凋亡细胞和坏死细胞。[1]
衰老相关 β-半乳糖苷酶实验：使用商业衰老 β-半乳糖苷酶检测试剂盒固定和染色处理细胞。在显微镜下观察蓝色显色（表明 β-半乳糖苷酶活性）和增大的形态，这些是细胞衰老的标志。[1]

Male NU/J nude mice of 6 to 8 weeks of age were purchased from The Jackson Laboratory and were fed with the Irradiated Teklad Global 19% protein rodent diet from Harlan Laboratories. To determine the in vivo anticancer efficacy of compound WZB117 on human tumor xenograft growth, NSCLC A549 cells in exponential growth phase were harvested, washed, precipitated, and resuspended in PBS. Each mouse was injected subcutaneously with 5 × 106 cancer cells in the flank. Compound treatment started 3 days after the cancer cells injection and when all tumors became palpable. Tumor cell–injected mice were randomly divided into 2 groups: control group (n = 10) treated with PBS/DMSO (1:1, v/v) and WZB117 treatment group (n = 10) treated with WZB117 (10 mg/kg body weight) dissolved in PBS/DMSO solution (1:1, v/v). Mice were given intraperitoneal injection with either PBS/DMSO vehicle or compound WZB117 (10 mg/kg) daily for 10 weeks. Tumor sizes were measured every 7 days with calipers, and tumor volume (L × W2/2) was calculated and presented as means ± SEM. All of the procedures involved in animal study were conducted in conformation with the guidelines of both Ohio University and NIH.[1]

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To evaluate in vivo anticancer efficacy, male NU/j nude mice (6-8 weeks old) were subcutaneously injected with 5 x 10⁶ human NSCLC A549 cells in the flank. Treatment started 3 days after cell inoculation when tumors were palpable. Mice were randomly divided into two groups: a control group (n=10) receiving daily intraperitoneal injections of PBS/DMSO (1:1, v/v) vehicle, and a treatment group (n=10) receiving daily intraperitoneal injections of WZB117 at 10 mg/kg body weight, dissolved in PBS/DMSO solution (1:1, v/v). Injections were administered daily for 10 weeks. Tumor sizes were measured weekly with calipers, and tumor volume was calculated. [1]

A single intraperitoneal injection of WZB117 produced mild and temporary hyperglycemia in mice, which disappeared 1 to 2 hours after injection without causing persistent hyperglycemia. [1]
No other ADME/PK parameters (e.g., absorption, distribution, metabolism, excretion, half-life, bioavailability) are provided in this publication. [1]

In the 10-week animal study, mice treated with WZB117 (10 mg/kg/day, i.p.) lost about 1 to 2 grams of body weight compared to vehicle-treated mice, with most weight loss attributed to fat tissue. [1]
Blood cell counts at the end of the study showed changes in lymphocytes and platelets in compound-treated mice compared to controls, but all counts remained within normal ranges. [1]

[1]. A small-molecule inhibitor of glucose transporter 1 downregulates glycolysis, induces cell-cycle arrest, and inhibits cancer cell growth in vitro and in vivo. Mol Cancer Ther. 2012 Aug;11(8):1672-82.

WZB-117 is a diester resulting from the formal condensation of the two hydroxy groups of 3-fluorocatechol with the carboxy groups of 3-hydroxybenzoic acid. It is an inhibitor of glucose transporter 1 (GLUT1) that suppresses tumour growth in mouse xenograft models. It has a role as an antineoplastic agent, a glucose transporter 1 inhibitor and a radiosensitizing agent. It is a diester, a member of phenols, a benzoate ester and a member of monofluorobenzenes. It is functionally related to a 3-hydroxybenzoic acid and a 3-fluorocatechol.

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WZB117 is a structural and functional analogue derived from a previously identified group of glucose transport inhibitory compounds, with higher potency. [1]
The proposed anticancer mechanism involves immediate inhibition of Glut1-mediated glucose transport, leading to reduced glycolysis (decreased ATP and lactate), which activates energy-sensing pathways (e.g., AMPK) and downregulates cell growth signaling (Akt, mTOR). This culminates in cell-cycle arrest (mediated by decreased cyclin E2 and pRb), followed by senescence and necrosis. Reduced intracellular ATP plays an essential role in the early inhibitory effect. [1]
WZB117 demonstrated synergistic effects with standard chemotherapeutic agents and was more effective under hypoxic conditions and against cancer cells compared to their non-tumorigenic counterparts. [1]
The study suggests WZB117 serves as a prototype for further development of anticancer therapeutics targeting Glut1-mediated glucose transport and metabolism. [1]

C20H13FO6

368.32

368.069

C, 65.22; H, 3.56; F, 5.16; O, 26.06

1223397-11-2

46830365

Typically exists as white to off-white solids at room temperature

1.4±0.1 g/cm3

628.4±55.0 °C at 760 mmHg

333.9±31.5 °C

0.0±1.9 mmHg at 25°C

1.645

4.67

93.1

2

7

6

27

527

0

FC1C=CC=C(C=1OC(C1C=CC=C(C=1)O)=O)OC(C1C=CC=C(C=1)O)=O

FRSWCCBXIHFKKY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H13FO6/c21-16-8-3-9-17(26-19(24)12-4-1-6-14(22)10-12)18(16)27-20(25)13-5-2-7-15(23)11-13/h1-11,22-23H

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.79 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.79 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.79 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。