XMD8-92

BMK1 (Kd = 80 nM); BMK1 (Kd = 190 nM)

XMD8-92显着增加细胞中p21的表达，并通过抑制BMK1激活来抑制癌细胞的增殖。 [1] XMD8-92除了阻断羟基红花黄A（HSYA）引起的MEF2C下调外，还显着降低HSYA对肝星状细胞（HSC）活化的抑制作用。 [2]

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BMK1被丝裂原和致癌信号激活，因此与肿瘤发生密切相关。我们发现BMK1与早幼粒细胞白血病蛋白（PML）相互作用，并通过磷酸化抑制其肿瘤抑制功能。此外，活化的BMK1显著抑制了PML依赖性p21的激活。为了进一步研究BMK介导的对肿瘤细胞中PML肿瘤抑制活性的抑制作用，我们开发了一种BMK1激酶活性的小分子抑制剂XMD8-92。XMD8-92对BMK1的抑制阻断了体外肿瘤细胞增殖[1]。

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HSYA抑制培养活化HSC中Col I和III型α-胶原的表达[2]
HSC活化的特征是ECM成分的过量表达，包括Col I和III型α-胶原（Col III）（Cho等人，引文2004）。为了评估HSYA对培养活化HSC中ECM产生的影响，对Col I和Col III的mRNA表达进行了实时PCR分析，对培养活化的HSC或HSC培养基中Col I的含量进行了酶联免疫吸附试验和Western blot分析。如图3A所示，与对照组相比，HSYA使HSC培养基中Col I的含量显著降低了55%。5无影响 μMXMD8-92对Col I含量的影响。然而，XMD8-92显著逆转了HSYA对Col I分泌的抑制作用。通过蛋白质印迹分析评估，HSYA显著抑制Col I（图3B和C）。在Col I mRNA转录物中也观察到了类似的趋势（图3D）。如图3E所示，与对照组相比，HSYA导致HSC中Col III的mRNA表达显著降低了28%。XMD 8-92倾向于逆转HSYA对Col III mRNA表达的抑制作用。然而，由于缺乏Col III抗体，无法进行检测Col III含量的实验。这些数据表明，HSYA对Col I和Col III含量的抑制作用可能涉及ERK5信号传导。

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HSYA诱导HSC活化的抑制[2]
α-SMA是活化HSC的独特标志物（Abergel等人，引文2006）。为了进一步评估HSYA对HSC活化的影响，对培养活化的HSC中α-SMA的基因表达进行了实时PCR和Western blot分析。如图4A和B所示，与对照组相比，HSYA导致α-SMA蛋白表达显著降低71%。单独使用XMD8-92也导致α-SMA蛋白表达类似降低34%。与HSYA处理的细胞相比，HSYA和XMD 8-92处理的细胞部分消除了α-SMA HSYA蛋白表达的抑制作用。与蛋白质水平的结果一致，实时PCR显示HSYA处理显著抑制了培养激活的HSC中α-SMA的mRNA表达（图4C）。这些发现支持了HSYA对HSC活化的抑制可能至少部分由ERK5信号介导的观点。

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HSYA抑制培养激活的HSC中的MEF2C[2]
MEF2作为关键的核介质参与体内纤维化的病理过程（Konno等人，引文2010）。因此，我们研究了HSYA对培养激活的HSC中MEF2C基因表达的影响。如图5A和B所示，HSYA或XMD8-92分别显著抑制了培养激活的HSC中MEF2C的蛋白表达61%和80%。XMD 8-92似乎增强了HSYA对MEF2C的抑制作用。实时PCR分析在转录水平上证实了这些观察结果（图5C）。

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HSYA阻断ERK5的激活导致培养激活的HSC增殖减少[2]
大量证据表明，ERK5的激活刺激HSC增殖（Rovida等人，引文2008）。如图6A和B所示，与对照组相比，HSYA导致p-ERK5显著降低49%，XMD8-92强烈抑制ERK5的磷酸化。XMD8-92对ERK5磷酸化的抑制作用似乎没有被HSYA增强。p-ERK5的这种抑制模式与上述MEF2C的模式密切相关。使用MTS测定法通过活细胞的数量来确定细胞增殖。如图6C所示，正如预期的那样，HSYA显著降低了培养激活的HSC的存活率。XMD 8-92本身对培养激活的HSC的存活率没有可检测的影响。用HSYA和XMD 8-92处理的培养激活的HSC明显消除了HSYA对细胞存活率的抑制作用。因此，ERK5在HSYA对培养激活的HSC增殖的抑制作用中起着重要但并非唯一的作用。

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XMD8-92在体外抑制AsPC-1细胞中的DCLK1、c-MYC、KRAS和NOTCH1 mRNA[3]
根据之前发表的报告，已知XMD8-92能够抑制BMK1激酶活性，并与DCLK1结合。考虑到这一点，我们用高达25mM的XMD8-92剂量处理AsPC-1人胰腺癌症细胞48小时。使用标准MTT测定法评估癌症细胞的增殖。对分离的总RNA进行p53和p21、DCLK1、c-MYC、KRAS和NOTCH1的定量实时RT-PCR分析。我们观察到AsPC-1癌细胞增殖呈剂量依赖性显著下调（图1A）。经过RT-PCR分析，我们没有观察到治疗后肿瘤抑制基因p21或p53 mRNA的表达增加（补充图1A和B）。随后，我们观察到，在用10和15μM的XMD8-92处理后，DCLK1 mRNA和蛋白质的表达明显呈剂量依赖性下调（通过蛋白质印迹分析）（图1B和C）。此外，我们还观察到用XMD8-92处理的AsPC-1细胞中c-MYC、KRAS和NOTCH1 mRNA减少了近60%（图1D）。这些数据共同表明，在体外用XMD8-92处理AsPC-1细胞会导致DCLK1、c-MYC、KRAS和NOTCH1 mRNA的下调。

XMD8-92（50 mg/kg ip）通过阻止肿瘤细胞增殖和肿瘤相关血管生成，显着减缓异种移植的人类或同基因小鼠肿瘤的生长。 [1] XMD8-92 显着下调 DCLK1 及其几个下游靶标，从而阻止胰腺肿瘤异种移植物生长。 [3]

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BMK1是治疗癌症的潜在药物靶点[2]
为了评估XMD8-92在抑制肿瘤中BMK1活性方面的有效性，我们在与人类肿瘤异种移植的小鼠中测试了该化合物。XMD8-92被发现能有效抑制BMK1的激活，并诱导PML的下游效应器p21（图6A）。更重要的是，在接种肿瘤细胞后一天、几天或几周用XMD8-92治疗小鼠，都显著抑制了异种移植的人类或同基因小鼠肿瘤的生长（图6B），对动物没有明显的副作用。肿瘤切片的免疫染色显示，XMD8-92在肿瘤细胞分裂过程中有效抑制了BrdU的掺入（图6C），表明XMD892阻断了肿瘤细胞增殖，这是PML的抗癌作用之一。由于BMK1和PML都参与血管生成（Bernardi等人，2006年；Borden和Culjkovic，2009年；Hayashi等人，2005年；Hayoshi等人，2004年），我们测试了XMD8-92是否在体内阻断血管生成，发现XMD8-91显著抑制了基质胶塞中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导的血管生成（图6D）。这些结果表明，XMD8-92通过阻断肿瘤细胞增殖和肿瘤相关血管生成，并可能通过其他尚未测试或发现的BMK1依赖机制发挥其抗肿瘤作用。

我们进一步研究了XMD8-92的抗肿瘤作用是否仅限于其抗BMK1能力。XMD8-92对肿瘤生长的抑制程度与通过瘤内注射Ad-BMK1（AEF）使用显性阴性BMK1引起的抑制程度相同（图7A）。重要的是，Ad-BMK1（AEF）的额外治疗对单独用XMD8-92治疗的荷瘤小鼠没有进一步的抑制作用（图7A），表明XMD8-93的抗肿瘤能力至少部分是通过阻断BMK1的活性。

接下来，我们评估PML在XMD8-92依赖性抑制肿瘤生长中的作用。我们发现，减少肿瘤细胞中的PML显著降低了XMD8-92对小鼠生长的抑制作用，但并没有完全消除这种抑制作用（图7B）。由于XMD8-92抑制肿瘤细胞增殖和新生血管形成（图6C和6D），肿瘤细胞中的PML缺失只能部分逆转XMD892的抗肿瘤作用的原因可能是肿瘤细胞中PML仅负责介导XMD8-92-介导的癌症细胞的生长停滞，而不负责XMD892依赖性的新生血管抑制。此外，增加这些PML敲除（KD）肿瘤细胞中野生型PML的表达水平，恢复了它们对XMD8-92介导的肿瘤生长抑制的敏感性（图7B）。相比之下，PML-KD细胞中PML2D的表达并没有重新建立其对XMD8-92介导的肿瘤增殖抑制的反应性（图7B）。这些数据表明，PML在XMD8-92介导的肿瘤生长抑制中起作用。

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XMD8-92抑制胰腺肿瘤异种移植物生长[3]
通过将AsPC-1细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠的下侧，产生胰腺肿瘤异种移植物。肿瘤被允许发展30天。当肿瘤可触及时，用DMSO和无菌玉米油（i.p.）中的XMD8-92（50mg/kg体重）或对照（注射DMSO和玉米油）治疗小鼠（每组n=5只动物）。连续15天每天进行治疗，每三天测量一次肿瘤体积。肿瘤在第45天被切除，肿瘤体积如图2A所示。在整个实验过程中，对照或载体治疗的肿瘤呈指数级增长，而XMD8-92治疗不仅阻止了肿瘤的生长，而且与最初没有治疗（第0天）相比，肿瘤体积减少（图2A）。与对照组肿瘤相比，XMD8-92治疗导致肿瘤体积显著减少（>80%）（p<0.01）。我们还观察到，用XMD8-92治疗后，肿瘤重量减少了2倍以上（图2B）。mRNA分析表明，与对照肿瘤相比，XMD8-92治疗的肿瘤中DCLK1 mRNA显著下调（p<0.01）（图2C）。经过免疫组织化学分析，我们观察到与对照肿瘤相比，用XMD8-92治疗的肿瘤中DCLK1蛋白显著下调（图2D和E）。与PDAC细胞系类似，在用XMD8-92治疗后的肿瘤异种移植物中，我们没有观察到BMK1下游肿瘤抑制基因p21和p53 mRNA的表达增加，这表明BMK1相关活性在胰腺癌症中不受影响（补充图1C和D）。这些数据共同表明，XMD8-92抑制AsPC-1肿瘤异种移植物的生长，并抑制DCLK1 mRNA和蛋白质。

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XMD8-92治疗抑制胰腺肿瘤异种移植物的多能性[3]
多能因子KLF4、OCT4、SOX2和NANOG在各种侵袭性癌症和癌症干细胞中上调。在我们之前的研究中，在使用siRNA敲除DCLK1后，我们观察到这些多能性因子通过miR-143/145 miRNA簇依赖机制表达降低。在这项研究中，我们想确定用XMD8-92治疗是否也会通过miR-145调节多能性因子。在XMD8-92治疗的肿瘤中，我们观察到miR-143/145簇与对照肿瘤相比显著上调（p<0.01）（图3A）。此外，与对照组肿瘤相比，我们观察到用XMD8-92治疗的肿瘤中多能性因子KLF4、OCT4、SOX2和NANOG mRNA（图3B）和蛋白质（图3C）的显著下调。Ras-反应元件结合蛋白1（RREB1）抑制miR-143/145启动子活性，这表明抑制是癌症发生和发展的早期事件。此外，KRAS和RREB1是miR-143/145的靶点，表明了一种前馈机制，可以增强RAS信号介导的PDAC肿瘤进展。最近已经证明，miR-143/145的异位表达导致胰腺癌症细胞的转移被抑制和粘附增加。早些时候，我们已经证明，敲除DCLK1后，RREB1通过miR-143/145的表达降低。同样，在这项研究中，我们观察到与对照肿瘤相比，XMD8-92治疗后RREB1 mRNA减少了50%以上（图3B）。

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XMD8-92通过miR-200抑制肿瘤异种移植物中的EMT和血管生成[3]
在这项研究中，我们观察到与对照肿瘤相比，用XMD8-92治疗的肿瘤中miR-200a、miR-200b和miR-200c的显著上调（>1.5倍）（图4A）。随后，我们观察到XMD8-92治疗的肿瘤中EMT转录因子ZEB1、ZEB2、SNAIL和SLUG的显著下调（图4B）。我们还观察到，与对照组肿瘤相比，XMD8-92治疗的肿瘤中VEGFR1和VEGFR2 mRNA（图4C）和蛋白质（图4D）显著下调（>60%）。这些数据共同表明，与DCLK1敲除类似，XMD8-92的治疗导致胰腺肿瘤异种移植物中EMT和通过miR-200的血管生成下调。

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XMD8-92治疗导致胰腺肿瘤异种移植物中Let-7a下游靶点c-MYC、KRAS和LIN28B的抑制[3]
先前已经证明，在siRNA介导的DCLK1敲除后，肿瘤抑制因子miRNA let-7a的表达增加，let-7下游靶点c-MYC、KRAS和LIN28B的表达下调。在这项研究中，用XMD8-92治疗后，我们观察到miRNA let-7a显著上调（p<0.01）（图5A），c-MYC mRNA（图5B）和蛋白质减少60%以上（图5B插图和5C）。我们还观察到KRAS mRNA（>50%）（图5D-左图）和LIN28B mRNA（>80%）（图5D-右图）显著下调。这些数据表明，XMD8-92治疗通过let-7a调节癌基因c-MYC、KRAS和LIN28B。这些数据还表明，这些作用是通过胰腺肿瘤异种移植物中DCLK1的下调介导的。

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XMD8-92处理的异种移植物NOTCH1较少[3]
Notch信号在各种癌症中上调，包括胰腺癌。之前的报告表明，NOTCH1位于DCLK1的下游，DCLK1通过miR-144 miRNA调节NOTCH1。siRNA介导的DCLK1敲除导致pri-miR-144上调，随后NOTCH1 mRNA下调。与上述观察结果类似，在本研究中，用XMD8-92治疗后，pri-miR-14显著上调（>2.0倍）（图6A），NOTCH1 mRNA（图6B）和蛋白质（图6C）减少60%以上。此外，我们还观察到，用XMD8-92处理后，活化的NOTCH1（切割的NOTCH1）显著下调（图6D）。这些数据表明，XMD8-92治疗通过下调胰腺肿瘤异种移植物中的DCLK1导致NOTCH1表达降低。此外，所有数据都已汇总，并以图形格式表示（图6E）。

使用 ATP 和 ADP 酰基磷酸脱硫生物素对 XMD8-92 进行 KiNativ 分析时进行了以下修改。在添加 ATP 或 ADP 酰基磷酸探针（最终探针浓度为 5 μM）之前，将 HeLa 细胞裂解物（总蛋白浓度：5 mg/mL）与 XMD8-92（50 μM、10 μM、2 μM、0.8 μM 和 0.8 μM）一起孵育。 0 μM 15 分钟。每个反应进行两次。探针反应持续 10 分钟，然后进行 MS 分析，并在添加尿素时停止。为了收集 HeLa 细胞裂解物中所有激酶肽-探针缀合物的 MS/MS 谱图，使用时间分段的“目标列表”在线性离子阱质谱仪上通过 LC-MS/MS 对样品进行分析。该目标列表是通过过去对 HeLa 裂解物的彻底分析而创建和验证的。将抑制剂处理的裂解物与对照（未处理的）裂解物进行比较，可以精确确定每个点的抑制百分比。每个激酶肽-探针缀合物最多使用四个特征片段离子来提取每个激酶的信号。目前正在撰写的一份手稿将涵盖该目标质谱策略的具体细节。

细胞治疗[2]
将HSYA以1 × 10–4 M.将这些溶液高压灭菌15分钟 min。半融合HSC血清饥饿24小时 h在含有0.4%FBS的DMEM中。在有或没有指定浓度的HSYA的情况下，将细胞在含有10%FBS的DMEM中维持指定时间。为了确定ERK5信号通路是否参与HSYA对HSC活化的抑制作用，使用ERK5的选择性抑制剂XMD8-92（5μM），将其添加到细胞培养物中30 在用HSYA治疗前至少分钟（Yang等人，引文2010）。对照HSC用适量无菌无热原水处理。治疗结束时，用冷磷酸盐缓冲溶液洗涤细胞，并在无菌无热原水中刮除。

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细胞增殖试验[3]
将细胞（每孔104个细胞）接种到96孔组织培养板中，一式三份。细胞在XMD8-92存在下培养，DMSO作为载体，浓度为0、0.78、1.56、3.13、6.25、12.50和25μM。处理48小时后，向每个孔中加入10μl TACS MTT试剂，并在37°C下孵育细胞，直至细胞中可见深色结晶沉淀。然后将100μl 266 mM NH4OH的DMSO溶液加入孔中，并低速放置在摇床上1分钟。摇床后，在避光条件下孵育10分钟，并使用微孔板读数器读取每个孔的OD550。将结果取平均值，并计算为DMSO（载体）对照的百分比+/-平均值的标准误差。

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IC50是使用DRC主电子表格计算的。用EGF和DMSO处理的细胞获得的值被定义为最大对照，而用EGF和10μMXMD8-92（SN12C-MEF2-luc）或1μM Staurosporine（SN12C CMV-luc）处理的细胞的值被确定为最小对照（即最大抑制）[5]。

携带 HeLa 异种移植瘤的 Nod/Scid 小鼠，携带 LL/2 异种移植瘤的 C57Bl/6 小鼠
~50 mg/kg，每日两次
i.p.

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HeLa 异种移植瘤模型 [1]
将 5 × 10⁵ 个 HeLa 细胞重悬于 DMEM 培养基中，并皮下注射到 6 周龄 Nod/Scid 小鼠（第 0 天）的右侧腹部。肿瘤细胞注射后第二天（第 1 天），将小鼠随机分为两组{6 只动物 [XMD8-92 组（1–28 天）] 和 18 只动物 [对照组]}。XMD8-92 组（1–28 天）以 50 mg/kg 的剂量腹腔注射 XMD8-92，每日两次。对照组每日注射载体溶液作为对照。在第7天，对照组被随机分为两组{6只动物[XMD8-92（7-28天）]和12只动物[对照组]}。在第14天，剩余的对照组被随机分为两组{6只动物[XMD8-92（14-28天）]和6只动物[对照组]}。XMD8-92（7-28天）组和XMD8-92（14-28天）组分别于第7天和第14天开始接受XMD8-92治疗。使用游标卡尺测量肿瘤大小，并使用公式 L × W² × 0.5² 计算肿瘤体积，其中 L 为最长直径，W 为最短直径。

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LL/2 异种移植模型 [1]
将 1 × 10⁶ 个 LL/2 细胞重悬于 DMEM 培养基中，并皮下注射到 6 周龄 C57Bl/6 小鼠右侧腹部（第 0 天）。在肿瘤细胞注射后的第二天（第 1 天），将小鼠随机分为两组：6 只动物 [XMD8-92 组（1–17 天）] 和 18 只动物 [对照组]]。XMD8-92 组（1–17 天）每天两次腹腔注射 50 mg/kg 的 XMD8-92 进行治疗。对照组每天注射载体溶液作为对照。第7天，对照组被随机分为两组{6只动物[XMD8-92（7-17天）]和12只动物[对照组]}。第14天，剩余的对照组被随机分为两组{6只动物[XMD8-92（10-17天）]和6只动物[对照组]}。XMD8-92（7-17天）组和XMD8-92（10-17天）组分别于第7天和第10天开始接受XMD8-92治疗。

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重组腺病毒治疗[1]
将1 × 10⁶个LL/2细胞皮下注射到C57Bl/6小鼠体内（第0天）。重组腺病毒颗粒的制备方法如我们之前的研究所述（Hayashi等，2001）。在第7天，将小鼠随机分为4组[Ad-EV组、Ad-BMK1(AEF)组、Ad-EV+XMD8-92组和Ad-BMK1(AEF)+XMD8-92组]（每组6只）。分别于第7、11、15和19天，按照先前描述的方法（Kim等，2004），将空载腺病毒（Ad-EV）或编码BMK1(AEF)的重组腺病毒[Ad-BMK1(AEF)]瘤内注射到小鼠体内。Ad-EV+XMD8-92组和Ad-BMK1(AEF)+XMD8-92组则按照LL/2异种移植模型中描述的方法，从第8天到第20天接受XMD8-92治疗。另外两组[Ad-EV 和 Ad-BMK1(AEF)]注射了载体溶液作为对照。

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PML 重建[1]
使用来自 Openbiosystems 的 pGIPZ-shRNAmir-PML（慢病毒）和 pGIPZ（慢病毒）质粒构建了 PML shRNAi 敲低和对照细胞系。将 1 × 10⁶ 个敲低（48 只动物）或对照（12 只动物）LL/2 细胞皮下注射到 C57Bl/6 小鼠体内（第 0 天）。在肿瘤细胞注射后的第二天（第 1 天），将小鼠随机分为 10 组（每组 6 只动物）[KD、Ctrl、KD+XMD8-92 和 Ctrl+XMD8-92； KD+Ad-EV、KD+Ad-PML、KD+Ad-PML2D(S403D/T409D)、KD+Ad-EV+XMD8-92、KD+Ad-PML+XMD8-92 和 KD+Ad-PML2D(S403D/T409D)+XMD8-92]。KD+XMD8-92 组和 Ctrl+XMD8-92 组均以 50 mg/kg 的剂量腹腔注射 XMD8-92，每日两次，连续 16 天。KD 组和 Ctrl 组作为对照，每日注射载体溶液，连续 16 天。 KD+Ad-EV、KD+Ad-PML、KD+Ad-PML2D、KD+Ad-EV+XMD8-92、KD+Ad-PML+XMD8-92 和 KD+Ad-PML2D+XMD8-92 组分别于第 7、11、15 和 19 天进行瘤内注射，注射物为编码 PML 或 PML2D 的空腺病毒 (Ad-EV)、Ad-PML 或 Ad-PML2D 重组腺病毒，注射方法参照先前文献 (Kim et al., 2004)。KD+Ad-EV+XMD8-92、KD+Ad-PML+XMD8-92 和 KD+Ad-PML2D+XMD8-92 组于第 8 至 20 天接受 XMD8-92 治疗，治疗方法参照 LL/2 异种移植模型。 KD+Ad-EV、KD+Ad-PML 和 KD+Ad-PML2D 组注射载体溶液作为对照。

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A549 异种移植模型 [1]
为了确定XMD8-92能否在体内阻断 BMK1，将 1 × 10⁶ 个 A549 细胞（其内源性 BMK1 自磷酸化可通过蛋白质印迹法检测）重悬于 DMEM 培养基中，并皮下注射到 6 周龄 Nod/Scid 小鼠的右侧腹部。注射后第 21 天，将小鼠随机分为两组（每组 2 只）。一组小鼠接受 XMD8-92 治疗，剂量为 50 mg/kg，每日两次。另一组小鼠接受载体溶液治疗作为对照。 2天后，将A549肿瘤在E1A缓冲液中匀浆，然后进行Western blot分析。

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异种移植瘤模型[3]
NOD/SCID小鼠饲养于无特定病原体（SPF）条件下。将AsPC-1细胞（1 × 10⁷）皮下注射到4至6周龄小鼠（n = 5）的侧腹部。使用游标卡尺测量肿瘤大小，并按（长 × 宽²）× 0.5计算肿瘤体积。注射细胞30天后，肿瘤可触及。将XMD8-92溶于无菌玉米油中，并腹腔注射（50 mg/kg体重）。每只荷瘤动物在第30-44天注射XMD8-92或玉米油（载体对照）（共15次，每天1次）。所有小鼠均在第 45 天被处死。

在Sprague-Dawley大鼠中评估了XMD8-92的药代动力学，分别采用单次静脉注射或口服给药。结果显示，XMD8-92的半衰期为2.0小时，清除率为26 mL/min/kg。该化合物具有中等的组织分布，计算分布容积为3.4 L/kg。XMD8-92具有较高的口服生物利用度，吸收率为69%。单次口服2 mg/kg后，30分钟内血浆药物浓度达到峰值约500 nM，给药后8小时仍维持在34 nM（图S1）。在耐受性实验中（表S3、S4和S5），腹腔注射50 mg/kg后，血浆药物浓度在14天内维持在较高水平（约10 μM）。[1]

XMD8-92耐受性良好，小鼠健康状况良好，未见任何不适症状。XMD8-92治疗组小鼠未观察到血管不稳定（表S4、S5和图1F）。综上所述，这些结果表明XMD8-92是体外和体内BMK1的有效且特异性抑制剂。[1]

[1]. Cancer Cell . 2010 Sep 14;18(3):258-67.

[2]. Pharm Biol . 2013 Nov 5.

[3]. Cancer Lett . 2014 Aug 28;351(1):151-61.

[4]. Proc Natl Acad Sci U S A . 2016 Oct 18;113(42):11865-11870.

[5]. J Med Chem . 2019 Jan 24;62(2):928-940.

XMD8-92 是一种二甲基嘧啶并[4,5-b][1,4]苯并二氮杂卓-6-酮，其嘧啶环 C-2 位连接有 [2-乙氧基-4-(4-羟基哌啶-1-基)苯基]氨基取代基。它是 BMK1 激酶通路抑制剂，具有蛋白激酶抑制剂的作用。

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摘要 背景：肝纤维化若不及时有效治疗，最终会导致肝硬化。肝星状细胞 (HSC) 通过细胞外基质蛋白的积累，是肝纤维化的主要介质。抑制传代 HSC 的活化已被认为是治疗和预防肝纤维化的策略之一。目的：评估从红花 (Carthamus tinctorius L.，菊科) 花朵中提取的活性化合物羟基红花黄 A (HSYA) 对 HSC 抑制作用的影响，并初步阐明其潜在机制。材料与方法：采用原位蛋白酶/胶原酶灌注法从大鼠中分离原代造血干细胞（HSC）。将培养激活的HSC在有或无PD98059的情况下，用30 μM的HSYA处理48小时，然后通过MTS法检测细胞增殖。采用聚合酶链式反应（PCR）定量mRNA表达，并通过Western blot或酶联免疫吸附试验（ELISA）定量蛋白表达。结果：HSYA以剂量依赖性和时间依赖性方式显著抑制培养激活的HSC增殖，IC50值为112.79 μM。HSYA（30 μM）可抑制HSC活化，表现为HSC培养基中I型α胶原含量降低55%，培养激活的HSC中α-平滑肌肌动蛋白表达降低71%。 HSYA (30 μM) 还导致 HSC 中 III 型 α 胶原 mRNA 表达显著降低 28%。HSYA (30 μM) 分别抑制肌细胞增强因子 2C (MEF2C) 的 mRNA 和蛋白表达 60% 和 61%。进一步研究表明，HSYA (30 μM) 导致 p-ERK5 显著降低 49%。使用 ERK5 抑制剂 XMD 8-92 阻断 ERK5 活性后，HSYA 对 HSC 活化的抑制作用显著消失，并且 HSYA 介导的 MEF2C 下调也被阻断。结论：HSYA通过ERK5介导的MEF2C下调抑制HSC活化，使其成为预防和治疗肝纤维化的潜在候选药物。[2] XMD8-92是一种激酶抑制剂，对肺癌和宫颈癌具有抗癌活性，但其对胰腺导管腺癌（PDAC）的作用尚不清楚。双皮质素样激酶1（DCLK1）在包括PDAC在内的多种癌症中表达上调。本研究表明，XMD8-92可抑制AsPC-1癌细胞增殖和肿瘤异种移植瘤生长。 XMD8-92 处理的肿瘤表现出 DCLK1 及其几个下游靶点（包括 c-MYC、KRAS、NOTCH1、ZEB1、ZEB2、SNAIL、SLUG、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、VEGFR1 和 VEGFR2）的显著下调，这是通过上调肿瘤抑制 miRNA let-7a、miR-144、miR-200a-c 和 miR-143/145 实现的；然而，它并没有影响 BMK1 下游基因 p21 和 p53。综合这些数据表明，XMD8-92 治疗可抑制 DCLK1 及其下游致癌通路（EMT、多能性、血管生成和抗凋亡），是一种有前景的胰腺导管腺癌 (PDAC) 化疗药物。[3]

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与其他 MAPK 家族成员不同，ERK5 除了具有 N 端经典激酶结构域外，还包含一个具有转录激活能力的大型 C 端结构域。ERK5 基因缺失会导致胚胎致死，而组织特异性缺失会对红系发育、心脏功能和神经发生产生显著影响。此外，ERK5 的缺失具有抗炎和抗肿瘤作用。小分子 ERK5 抑制剂在炎症和肿瘤的细胞及动物模型中均显示出良好的活性。本文报道了高效、选择性 ERK5 抑制剂的合成及其生物学特性。与ERK5基因缺失/敲除以及先前报道的化合物抑制相比，使用选择性最高的新型抑制剂抑制该激酶并未表现出抗炎或抗增殖活性。先前报道的ERK5抑制剂的疗效来源被证实是对溴结构域的脱靶活性，溴结构域是参与转录过程中乙酰赖氨酸残基识别的保守蛋白模块。ERK5基因缺失或敲除所报道的表型很可能是由于ERK5非催化功能的丧失所致。新报道的抑制剂将有助于确定众多已报道的表型中哪些是由激酶活性引起的，并明确哪些表型可以作为药物靶点。[4] 能够以浓度和时间依赖的方式研究蛋白质特定结构域的作用，具有很高的价值。本文报道了通过高通量筛选和后续基于结构的优化，鉴定出一种高效且选择性极高的ERK5抑制剂BAY-885。ERK5是细胞信号转导的关键整合因子，已被证实参与多种细胞过程，例如增殖、分化、凋亡和细胞存活。我们发现，使用小分子抑制ERK5激酶和转录活性并未转化为在不同的细胞模型中表现出的抗增殖活性，这与RNAi技术[5]获得的结果相反。

C26H30N6O3

474.55

474.237

C, 65.80; H, 6.37; N, 17.71; O, 10.11

1234480-50-2

46843772

White to beige solid powder.

1.3±0.1 g/cm3

741.8±70.0 °C at 760 mmHg

402.4±35.7 °C

0.0±2.6 mmHg at 25°C

1.655

1.14

97.44

2

8

5

35

719

0

O([H])C1([H])C([H])([H])C([H])([H])N(C2C([H])=C([H])C(=C(C=2[H])OC([H])([H])C([H])([H])[H])N([H])C2=NC([H])=C3C(=N2)N(C([H])([H])[H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C2C(N3C([H])([H])[H])=O)C([H])([H])C1([H])[H]

QAPAJIZPZGWAND-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C26H30N6O3/c1-4-35-23-15-17(32-13-11-18(33)12-14-32)9-10-20(23)28-26-27-16-22-24(29-26)30(2)21-8-6-5-7-19(21)25(34)31(22)3/h5-10,15-16,18,33H,4,11-14H2,1-3H3,(H,27,28,29)

2-[2-ethoxy-4-(4-hydroxypiperidin-1-yl)anilino]-5,11-dimethylpyrimido[4,5-b][1,4]benzodiazepin-6-one

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.27 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.27 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。