YK11 ^{DEA controlled substance}

Androgen receptor

YK11（雄激素获取的部分激动剂）通过 AR 在 500 nM 上调 Fst mRNA，引起 C2C12 细胞中的肌源性分泌。尽管需要高剂量（100 nM 或 500 nM），YK11 仍会增加 Myf5 和肌细胞生成素 mRNA 的表达 [1]。 YK11 (0.5 μM) 刺激成骨细胞 MC3T3-E1 细胞增殖并通过 AR 放大 ALP 活性。此外，YK11 还能增强骨钙素 mRNA (0.1-1.0 μM) 和骨保护素 mRNA (0.5 μM) 的定量表达。此外，YK11 使用快速非基因组信号传导来增加 Akt 蛋白的磷酸化 [2]。

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YK11和DHT诱导C2C12细胞向肌源性分化[1]
首先，我们研究了AR是否在C2C12成肌细胞中表达。通过免疫印迹法在C2C12细胞分化过程中检测到AR表达（图1A）。为了研究YK11对C2C12细胞的影响，检测了分化标志物肌球蛋白重链（MyHC）的表达。在分化培养基中用YK11、DHT或溶剂培养C2C12细胞。YK11和DHT处理均提高了第7天的MyHC蛋白水平（图1B），表明与DHT一样，YK11可以诱导C2C12细胞的肌源性分化。

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YK11和DHT上调MRFs的mRNA表达[1]
接下来，我们分析了MRFs、Myf5、MyoD和肌细胞生成素的mRNA表达。用YK11、DHT或溶剂处理细胞，在第2天和第4天通过qRT-PCR分析Myf5、MyoD和肌细胞生成素的表达。YK11治疗比DHT治疗在第4天更显著地增强了Myf5和肌细胞生成素mRNA的表达（图1C、E）。有趣的是，YK11治疗在第4天上调Myf5和肌细胞生成素mRNA需要高浓度的YK11（100 nM或500 nM；图1F-H），而DHT在较低浓度下增加了这些基因的表达。 与AR拮抗剂FLU的联合治疗抑制了这种上调，表明YK11诱导的MRFs表达可能是由AR介导的（图2A-C）。

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YK11通过AR上调Fst mRNA诱导Myf5 mRNA表达[1]
据报道，雄激素诱导的肌源性分化受Fst的调节，Fst刺激Myf5的表达。23,24）Fst通过直接与TGF-β家族成员结合来调节许多成员的功能，如肌原性分化的负调节因子肌生长抑制素。我们推测AR依赖性Fst诱导可能是YK11和DHT之间功能差异的原因。为了验证这一假设，在添加YK11或DHT后的第2天和第4天测量Fst表达。YK11处理显著诱导了Fst mRNA的表达，而DHT处理不影响其表达（图3A）。与FLU共处理后，YK11诱导的Fst mRNA上调显著减少，支持YK11介导的Fst表达上调的AR依赖性（图3B）。此外，我们还进行了AR敲除实验。与FLU治疗类似，YK11诱导的Fst mRNA上调通过敲除AR而显著减少（图3C）。

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YK11对成骨细胞增殖的影响[2]
成骨细胞分化的第一步是细胞增殖。因此，为了研究YK11是否加速成骨细胞的生长，我们进行了MTS测定。用YK11 0.5µM和DHT 0.01µM处理成骨细胞MC3T3-E1 96小时。结果表明，YK11和DHT处理可促进细胞生长。此外，这些观察结果被AR拮抗剂HF的联合治疗所逆转（图1）。这些结果表明，YK11通过类似于DHT的AR加速成骨细胞增殖。

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YK11对成骨细胞碱性磷酸酶活性和矿化的影响[2]
膜结合外酶ALP活性的增加是成骨细胞分化早期的关键指标。MC3T3-E1细胞在分化培养基中培养，用YK11或DHT处理10天。与溶剂处理的细胞相比，YK11和DHT处理的细胞的ALP活性增加（图2A）。与HF共处理抑制了ALP活性的增加（图2A）。

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YK11对成骨标志物表达的影响[2]
骨保护素（OPG）和骨钙素（OC）分别是成骨细胞分化的早期和晚期标志物。为了检测这些成骨标志物在YK11处理的细胞中的表达，通过RT-qPCR测量了它们的mRNA表达。YK11在第4天（图3A）和第14天（图3B）的OPG mRNA表达增加，与DHT相似。YK11在第14天增加了OC mRNA的表达，与DHT相似（图3D），但在第4天没有增加（图3C）。此外，YK11在第14天以剂量依赖的方式增加了OC mRNA的表达（图3E）。

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YK11对非基因组信号传导的影响[2]
据报道，AR直接激活磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/Akt通路，这是成骨细胞增殖和分化的关键调节因子。26）在这项研究中，我们证明YK11通过AR促进成骨细胞的增殖和分化（图1-3）。为了确定YK11活性的分子机制，我们研究了YK11是否以类似于DHT的方式激活Akt信号传导。用YK11或DHT处理细胞15分钟，并研究磷酸化Akt蛋白的水平。与DHT相似，YK11处理后Akt蛋白的磷酸化增加。这一观察表明，YK11可以通过类似于DHT的快速非基因组信号传导激活Akt信号通路（图4）。

肌肉生长抑制素抑制剂YK11 可阻止革兰氏阴性菌引发的肌肉萎缩。尽管脓毒症小鼠的肌肉蛋白降解得到了很好的观察，但肌生长抑制素的表达和活性尚不清楚。因此，我们分析了肌肉萎缩及其与肌肉生长抑制素的关系。为了解决这个问题，我们在相同的检查点时间对小鼠口服肌肉生长抑制素抑制剂YK11 10天（6小时/3次/天）。随后，我们在最后一天通过腹腔注射大肠杆菌K1诱导败血症（图1A）。在实验的第10天，估计了总体重和恢复的肌肉和脂肪的比例（占总体重的百分比）。对照组的小鼠也没有服用任何YK11。发现YK11以浓度依赖的方式减少小鼠的体重减轻，即随着YK-11浓度的增加，小鼠的总体重增加或恢复得更好（图1B）。然而，YK11治疗组的脂肪比例（占总体重的百分比）趋于降低。这些结果与研究论文一致，即肌肉生长抑制素缺乏会增加骨骼肌质量并减少体脂质量[15]。此外，摄入YK11有助于恢复小鼠背部和大腿的肌肉质量损失，这是由大肠杆菌K1引发的（图1C）。此外，H&E染色分析证实YK11减少了肌肉细胞萎缩（图1D）。YK11对CRAB的潜在效率也显示出来（图S1）。YK11增加了总体重（图S1B），逆转了肌肉质量损失（图S1C）和肌细胞萎缩（图S1D）。这表明，通过YK11抑制肌肉生长抑制素有助于逆转由标准和耐药菌株中的革兰氏阴性菌引发的败血症小鼠的肌肉萎缩。[3]

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YK11减弱接种革兰氏阴性菌的脓毒症小鼠的病理生理学。之前的研究清楚地表明，YK11 从整体上影响先天免疫反应。因此，我们试图测试其对败血症病理生理学的影响。将1×108CFU/只的大肠杆菌K1腹腔注射到每天摄入YK11的小鼠体内（6小时/3次/天），诱导败血症。在72小时内，注射350和700 mg/kg的YK11分别使脓毒症小鼠的存活率提高了20%和40%（图2A）。YK11还显著降低了血清中的内毒素水平（图2B），以及小鼠肺部炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12p70和IL-10的水平（图2C）。此外，YK11减轻了器官损伤生物标志物的水平——肝脏中的天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）和肾脏中的血尿素氮（BUN）（图2D）。此外，YK11促进了脓毒症小鼠器官中的细菌清除（图2E）。YK11效应也对CRAB产生了影响（图S2）。这些数据表明，YK11通过调节炎症细胞因子水平来预防革兰氏阴性菌引起的小鼠败血症。[3]

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肌生成抑制素抑制可改善接种革兰氏阴性菌的败血症小鼠的肌肉蛋白质代谢。上述结果（图2）证实，YK11可预防小鼠严重的败血症休克。为了进一步研究YK-11在脓毒症小鼠中的潜在作用，我们试图通过细菌LPS诱导NF-κB活化和TGF-β信号传导来鉴定其机制。肌生成抑制素抑制改善了接种大肠杆菌K1的脓毒症小鼠的肌肉蛋白质代谢。我们后来在同一动物模型中研究了FST的表达，FST对肌生成抑制物具有天然的抑制作用。有趣的是，在YK11治疗组中，被大肠杆菌K1降低的FST水平完全恢复（图3A）。YK11口服摄取抑制了肌肉调节因子肌肉生长抑制素、肌细胞生成素和MyoD的蛋白质水平，这些蛋白质水平因大肠杆菌K1细菌诱导而增加（图3B）。除了肌肉生长抑制素，TGF-β超家族的几个成员还可以通过肌肉生长抑制物样途径发出信号，这会影响FOXO3a和Smad2转录因子的下游磷酸化。YK11治疗组的这两个因素都有所下降（图3B）。YK11效应也对CRAB产生了影响（图S3）。这些结果表明，YK11可以通过干扰肌肉生长抑制素的表达来阻止肌肉萎缩，从而缓解革兰氏阴性菌引起的败血症。基于这些集体数据，我们提出了革兰氏阴性菌在体内抑制肌生成的机制模型[3]。

茜素红S染色[2]
通过茜素红S染色研究了成骨细胞分化过程中的矿化（钙沉积（离子））。 对于茜素红S染色，用磷酸缓冲盐水（PBS）冲洗三次后，用4°C的冷甲醇固定细胞20分钟，然后用H2O冲洗三次，在第10天完全去除甲醇。然后用40mM茜素红S染色溶液（pH 6.38）对细胞染色15分钟，以对钙沉积物进行染色。接下来，用H2O冲洗染色的细胞五次，以去除未结合的茜素红S，并对染色的培养物进行成像。

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ALP活动[2]
使用Lab Assay™ALP测量ALP活性。在指定的实验终点，去除培养基后，用PBS冲洗细胞层三次，并用0.05%Triton X-100裂解。将细胞裂解物与含有2mM MgCl2和6.7mM对硝基苯磷酸盐的0.1M碳酸盐缓冲液（pH 9.8）混合。将反应混合物在37°C下孵育15分钟，并通过加入NaOH停止反应。在多模检测器中在405nm处测量吸光度。

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实时RT定量（q）PCR[2]
使用ISOGEN II分离总RNA。使用ReverTra-Ace®qPCR RT试剂盒合成cDNA。根据制造商的方案，使用KOD SYBR qPCR Mix进行实时qPCR，最终体积为25µL，并使用Applied Biosystems 7500 Fast System SDS软件对结果进行分析。使用的底漆对如表1所示。

细胞培养[1]
小鼠成肌细胞C2C12细胞在37°C、5%CO2的加湿气氛中，在添加了10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。将C2C12细胞接种在平板上并在培养基中保持24小时。为了诱导肌源性分化，在第0天向细胞中加入添加了2%马血清（分化培养基）的DMEM中的YK11或DHT。对于Fst（也称为激活素结合蛋白）的中和试验，C2C12细胞在抗Fst抗体存在的情况下保持在分化培养基中。

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免疫印迹[1]
收获细胞并在十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液中裂解，该缓冲液含有125 mM Tris-HCl，pH 6.8，4%SDS，10%蔗糖，10mM二硫苏糖醇和0.01%溴酚蓝。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）解析全细胞裂解物，并使用抗肌球蛋白重链、抗雄激素受体和抗微管蛋白抗体作为第一抗体进行免疫印迹。使用辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠或兔免疫球蛋白G（IgG）抗体作为第二抗体。

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细胞培养[2]
小鼠成骨细胞MC3T3-E1在37°C、5%CO2的加湿气氛中，在添加了10%胎牛血清（FBS）的最低必需培养基（MEM）α中培养。将MC3T3-E1细胞接种在平板上，并在添加了10%炭剥离FBS（csFBS）的MEMα中维持24小时 h.在添加10%csFBS的MEMα中诱导成骨细胞分化，在第0天向细胞中加入50µg/mL抗坏血酸和5mMβ-甘油磷酸盐（分化培养基）。每3或4天更换一次培养基。

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MTS细胞增殖试验[2]
将MC3T3-E1细胞以每孔5000个细胞的密度用csFBS接种在96孔微孔板中24小时，并用溶剂对照、DHT或如所示的YK11 处理。孵育96小时后，根据制造商的说明，使用MTS检测试剂盒评估细胞存活率。活细胞的数量与活细胞从MTS还原的甲赞产物在490nm处的吸光度成正比。在多模检测器中测量490 nm处的吸光度。

细菌诱导脓毒症小鼠模型[3]
8周龄雄性BALB/c小鼠饲喂YK11（350、700 mg/kg）10天，每日进行评估。另一组野生型（WT）小鼠也饲喂YK11（350和700 mg/kg/天）。每日评估体重和食物摄入量，持续10天。10天后，部分WT小鼠腹腔注射大肠杆菌K1（1 × 10⁸ CFU/只）和鲍曼不动杆菌（1 × 10⁷ CFU/只）以诱导脓毒症。测量体重和股肌重量，并用多聚甲醛（PFA）固定一侧股肌。为了进行存活率分析，在注射YK11 30分钟后，分别向注射了1 × 10⁹ CFU/只小鼠的大肠杆菌K1（每组5只小鼠）和1 × 10⁹ CFU/只小鼠的鲍曼不动杆菌（CRAB，每组5只小鼠）。观察存活率72小时。为了进行其他分析，在注射YK11 30分钟后，分别向注射了1 × 10⁸ CFU/只小鼠的大肠杆菌K1（每组5只小鼠）和1 × 10⁷ CFU/只小鼠的鲍曼不动杆菌（CRAB，每组5只小鼠）。这些小鼠的使用均遵循动物伦理规范。使用Bullet Blender匀浆器匀浆肺、肝、肾和脾脏。采用ELISA法检测肺组织匀浆液中的促炎细胞因子。将组织裂解液中剩余的细菌用PBS稀释，并在LB琼脂平板上过夜培养。采用全自动化实验室系统（日本日立公司）和TBA-200FR NEO系统测定血清中的AST、ALT和BUN水平。采用LAL法测定血清内毒素水平，并在405 nm处测量反应颜色。

[1]. Selective androgen receptor modulator, YK11, regulates myogenic differentiation of C2C12 myoblasts by follistatin expression. Biol Pharm Bull. 2013;36(9):1460-5.

[2]. Selective Androgen Receptor Modulator, YK11, Up-Regulates Osteoblastic Proliferation and Differentiation in MC3T3-E1 Cells. Biol Pharm Bull. 2018;41(3):394-398.

[3]. Myostatin inhibitor YK11 as a preventative health supplement for bacterial sepsis. Biochem Biophys Res Commun. 2021 Mar 5:543:1-7.

新型雄激素受体（AR）部分激动剂(17α,20E)-17,20-[(1-甲氧基亚乙基)双-(氧)]-3-氧代-19-去甲孕甾-4,20-二烯-21-羧酸甲酯（YK11）以及二氢睾酮（DHT）均可诱导C2C12成肌细胞的肌源性分化。YK11是一种选择性雄激素受体调节剂（SARM），它无需核/壳相互作用即可激活AR。本研究进一步探讨了YK11诱导C2C12细胞肌源性分化的机制。与DHT相比，YK11能更显著地诱导关键肌源性调节因子（MRFs）的表达，例如肌源性分化因子（MyoD）、肌源性因子5（Myf5）和肌生成素。 YK11处理C2C12细胞（而非DHT）可诱导卵泡抑素（Fst）的表达，而抗Fst抗体可逆转YK11介导的成肌分化。这些结果表明，Fst的诱导对于YK11的合成代谢作用至关重要。[1]

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雄激素是男性生殖系统中的关键调节因子，对骨矿物质密度和骨骼肌质量具有合成代谢作用。我们此前报道过，YK11是一种新型选择性雄激素受体调节剂（SARM），可诱导成肌分化和选择性基因调控。在本研究中，我们发现YK11和二氢睾酮（DHT）处理可加速MC3T3-E1小鼠成骨细胞的增殖和矿化。此外，与未处理的细胞相比，YK11处理的细胞中成骨细胞特异性分化标志物（如骨保护素和骨钙素）的表达增加。雄激素受体 (AR) 拮抗剂治疗减弱了这些观察结果。为了阐明 YK11 的作用，我们研究了 AR 的快速非基因组信号传导。YK11 和 DHT 处理均可增加磷酸化 Akt 蛋白水平，表明 YK11 通过 AR 的非基因组信号传导激活 Akt 信号通路。由于已知 Akt 信号通路是雄激素介导的成骨细胞分化的关键调节因子，因此 YK11 具有与雄激素类似的成骨活性。[2] 脓毒症患者常出现由骨骼肌分解代谢反应引起的肌肉萎缩。肌肉生长抑制素是肌肉质量的负调节因子，据报道在与肌肉萎缩相关的疾病中表达上调。然而，肌肉生长抑制素在脓毒症期间的行为尚不清楚。在此，我们旨在研究接种革兰氏阴性菌的小鼠骨骼肌中肌肉生长抑制素的表达和调控。有趣的是，研究发现脓毒症小鼠肌肉中肌生长抑制素的蛋白水平与卵泡抑素、NF-κB、肌生成素、MyoD、p-FOXO3a 和 p-Smad2 的水平同时升高。此外，YK11 对肌生长抑制素的抑制作用降低了小鼠血液和主要器官中促炎细胞因子和器官损伤标志物的水平（这些指标在脓毒症中原本升高）；因此，YK11 对肌生长抑制素的抑制作用降低了脓毒症的死亡率。这项研究的结果表明，YK11 可能有助于逆转脓毒症期间的肌肉萎缩并抑制炎症环境，从而凸显了其作为预防脓毒症相关肌肉萎缩药物的潜力。[3]

C25H34O6

430.54

430.236

C, 69.74; H, 7.96; O, 22.30

1370003-76-1

119058028

White to off-white solid powder

3.1

71.1

0

6

3

31

860

6

O1C(C)(OC)O/C(=C/C(=O)OC)/[C@]21CC[C@H]1[C@@H]3CCC4=CC(CC[C@@H]4[C@H]3CC[C@@]12C)=O

KCQHQCDHFVGNMK-PQUNLUOYSA-N

InChI=1S/C25H34O6/c1-23-11-9-18-17-8-6-16(26)13-15(17)5-7-19(18)20(23)10-12-25(23)21(14-22(27)28-3)30-24(2,29-4)31-25/h13-14,17-20H,5-12H2,1-4H3/b21-14+/t17-,18+,19+,20-,23-,24?,25+/m0/s1

methyl (2E)-2-[(8R,9S,10R,13S,14S,17S)-2'-methoxy-2',13-dimethyl-3-oxospiro[1,2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthrene-17,5'-1,3-dioxolane]-4'-ylidene]acetate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.81 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.81 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.81 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。