2BAct   中文名称: 2BAct | Eukaryotic Initiation Factor (eIF)

eIF2; The primary target of 2BAct is eukaryotic initiation factor 2B (eIF2B), functioning by activating the guanine nucleotide exchange factor activity of eIF2B. eIF2B is a key regulatory node in the integrated stress response (ISR) pathway—when cells are exposed to various stress stimuli, phosphorylated eIF2α inhibits eIF2B activity, leading to reduced protein synthesis. In Vanishing White Matter disease (VWM), mutations in eIF2B genes reduce its activity, causing persistent ISR activation that results in impaired myelination and neurodegeneration. 2BAct binds to eIF2B and enhances its residual activity, relieving the ISR-mediated inhibition of protein synthesis and restoring cellular function. In cell-based reporter assays, 2BAct activates eIF2B with an EC₅₀ of 33 nM. Additionally, 2BAct is able to penetrate the blood-brain barrier (unbound brain/plasma ratio ~0.3), achieving target coverage in the central nervous system.

与 WT 空隙相比，R191H 初级生成的纤维空隙的 2BAct 活性增加了三倍 (EC50=7.3 nM)，而 GEF 活性较低 [1]。

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在体外实验中，2BAct表现出强效的eIF2B激活活性。在基于细胞的整合应激反应（ISR）报告基因实验中，2BAct对eIF2B的激活EC₅₀为33 nM。在从携带严重VWM突变Eif2b5ᴿ¹⁹¹ᴴ的小鼠胚胎分离的原代成纤维细胞裂解液中，2BAct可将突变的eIF2B复合物的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）活性提高三倍，EC₅₀低至7.3 nM，表明该化合物即使在严重致病突变背景下也能有效激活残余酶活性。这一体外活性数据为后续体内研究提供了剂量选择的药理学依据。

2BAct（300 μg 2BAct/g 食物；21 周）使 VWM 小鼠的体重增长正常化 [1]。 2BAct 可以保护 VWM 中的运动障碍、髓磷脂缺失和反应性神经网络失眠 [1]。近期 eIF2B 复合体中 2BAct 的残余活性消除了适应不良的近期反应 [1]。

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2BAct在VWM小鼠模型中表现出显著的体内疗效。在一项为期21周的盲法治疗研究中，携带Eif2b5ᴿ¹⁹¹ᴴ严重突变的VWM小鼠经口服给予2BAct（300 μg 2BAct/g饲料）后，体重增长恢复正常，给药开始后2周内即追上野生型小鼠的体重水平。2BAct治疗还完全预防了VWM小鼠的运动功能障碍、髓鞘脱失和反应性胶质增生等所有病理学表现。转录组和蛋白质组分析显示，长期2BAct治疗可使VWM小鼠的基因表达谱和蛋白质表达谱恢复正常。在另一个更严重的N208Y eIF2B-α基因敲入小鼠模型中，2BAct治疗挽救了新生期致死性，显著延长了模型动物的生存期。然而，撤药实验表明，持续治疗是维持疗效所必需的——一旦停药，所有组织中立即出现ISR诱导和快速恶化。

GEF测定[1]
按照前面所述进行实验。简言之，负载Bodipy FL GDP的eIF2用作WT和R191H MEFs产生的裂解物的底物。在384孔板中进行测定。在10µL/孔的最终测定体积中，以下条件保持恒定：25 nM Bodipy FL GDP负载的eIF2、3 nM磷酸-eIF2、0.1 mM GDP、1 mg/mL BSA、0.1 mg/mL MEF裂解物。2BAct是从1mM的储备中分配的。对于每次运行，对每种浓度的2BAct进行三次测量。使用以下仪器参数在SpectraMax i3x平板读取器上读取反应：平板温度=25°C；激发波长=485nm（15nm宽）；发射波长＝535nm（25nm宽度）；读取持续时间=30分钟，间隔45秒。数据在Prism中进行分析。GDP释放半衰期通过拟合单指数衰减曲线来计算。通过拟合log（抑制剂）与反应曲线来计算EC50。

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关于2BAct的无细胞酶/受体结合实验流程，现有公开文献中未检索到详细信息。目前eIF2B激活剂的活性评估主要依赖基于细胞的报告基因实验，而非传统的无细胞酶学方法。典型的报告基因实验流程如下：将带有ISR响应元件（如ATF4启动子驱动的荧光素酶报告基因）的细胞接种于96孔板中，加入不同浓度的2BAct（0.1 nM-10 μM），在37°C、5% CO₂条件下孵育16-24小时以诱发ISR。裂解细胞后，加入荧光素酶底物，通过化学发光检测仪测定荧光素酶活性，计算EC₅₀值。此外，原代成纤维细胞裂解液中的GEF活性检测可用于评估2BAct对突变eIF2B复合物的激活作用，该方法通过检测eIF2B催化[³H]-GDP从eIF2上交换的速率来量化酶活性。

蛋白质印迹[1]
在RIPA缓冲液+蛋白酶/磷酸酶抑制剂中制备小脑裂解物。在Qiagen TissueLyser II中以30Hz的频率裂解组织2×2分钟。将裂解物在冰上孵育10分钟，然后离心（21000 x g，10分钟，4°C）以去除细胞碎片。使用Pierce BCA测定法测定蛋白质浓度，并使用RIPA缓冲液调整至2 mg/mL。将裂解物等分，快速冷冻并在−80°C下储存。对于蛋白质印迹，样品在Mini-PROTEAN TGX 4–20%梯度凝胶上运行，并在Trans-Blot Turbo设备上使用Trans-Blot Turbo-Mini-PVDF转移包转移。用TBS-T中5%的牛奶封闭膜，并在4°C下与一级抗体在相同的封闭缓冲液中孵育过夜。在TBS-T中洗涤三次，每次15分钟后，施加HRP缀合的第二抗体1小时。如前所述，在TBS-T中洗涤膜。将Advansta WesternBright化学发光基质应用于膜，并在Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统上以信号累积模式获得图像<小时> ATF4萤光素酶报告基因测定[1]
该实验如前所述进行（Wong等人，2018）。简言之，将表达ATF4萤光素酶报告基因的HEK293T细胞（Sidrauski等人，2013）接种到96孔板中，并用100nM thapsigargin处理7小时以诱导ER应激。在剂量反应中用2BAct或ISRIB共同处理细胞。使用ONE Glo萤光素酶测定试剂（Promega）和Molecular Devices SpectraMax i3x平板读取器测量发光。数据在Prism中进行分析。

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2BAct的体外细胞活性主要通过原代成纤维细胞GEF活性测定和基于报告基因的ISR抑制实验进行评估。在原代成纤维细胞实验中，从Eif2b5ᴿ¹⁹¹ᴴ突变小鼠胚胎中分离成纤维细胞，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养至80-90%融合。裂解细胞制备细胞裂解液，与不同浓度的2BAct（例如0.1-1000 nM）和[³H]-GDP标记的eIF2共同孵育，通过检测[³H]-GDP与eIF2结合量的变化计算GDP交换速率和EC₅₀值。在报告基因实验中，将转染了ISR响应元件报告质粒的细胞接种于96孔板（每孔约1×10⁴细胞），培养过夜后加入递增浓度的2BAct（0.1 nM-10 μM）处理16-24小时，裂解后测定荧光素酶活性，计算EC₅₀为33 nM。

2BAct 微悬浮液的制备 [1]

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将 2BAct 悬浮于 0.5% 羟丙基甲基纤维素 (HPMC; Hypromellose 2910, 4000 mPa) 水溶液中，制备 2BAct 水悬浮液。首先，将 5 g HPMC 加入 500 mL 加热至 60°C 的超纯水中，制备悬浮液。搅拌至 HPMC 完全分散。然后用原容器冲洗两次，并将溶液转移至容量瓶中。加入足量的水，定容至 1 L，并搅拌过夜，直至得到澄清的悬浮液。将悬浮液冷藏保存，每次使用前使其恢复至室温。每月制备一次新的悬浮液。制备 2BAct 水悬浮液时，称取适量 2BAct 放入合适大小的研钵中，加入少量悬浮液，用研杵研磨。然后将其收集到预先标记有 qs 线的合适大小的玻璃小瓶中。研钵冲洗五次，每次冲洗液都加入到玻璃小瓶中。向玻璃小瓶中加入额外的溶剂，直至达到 qs 线，并通过涡旋振荡 10 秒来混合所有悬浮液。[1]

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2BAct 药代动力学[1]
6 至 8 周龄的 CD1 雄性小鼠分别以 1 mg/kg 或 30 mg/kg 的剂量口服 2BAct，给药体积为 10 mL/kg。给药时，将 2BAct 微粉化并悬浮于 0.5% 羟丙基甲基纤维素 (HPMC) 中（参见上文“微悬浮液制备”）。在以下时间点，通过尾静脉抽取血液至EDTA抗凝毛细管中：0.25、0.5、1、3、6、9、12和24小时（每个时间点重复3次测量，每次抽取3只小鼠的血液，并将两两合并用于提取）。血液以3000 rpm离心，收集血浆。血浆样品和标准品采用含内标的乙腈进行蛋白质沉淀提取。上清液用0.1%甲酸水溶液稀释后，注入HPLC-MS/MS系统进行分离和定量。采用反相色谱法（30 × 2.1 mm，5 µm Fortis Pace C18）以0.8 mL/min的流速进行梯度洗脱，将分析物与基质组分分离。采用配备电喷雾电离接口的SCIEX三重四极杆质谱仪，在正离子模式下进行串联质谱分析。数据采集和分析使用Analyst软件（SCIEX）完成。[1]

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2BAct在饲料中的制备[1]
将2BAct添加到啮齿动物饲料（2014，Teklad Global 14%蛋白质啮齿动物维持饲料）中，通过口服方式给予小鼠。具体操作为：称取一定量的2BAct，加入少量饲料粉末，用研钵研磨至均匀。然后将研磨后的混合物与更多的饲料粉末混合，置于HDPE瓶中。混合方法有两种：一种是手动搅拌进行几何混合；另一种是使用Turbula混合器，以48 rpm的转速搅拌15分钟；或者使用Envigo公司代工生产的混合器，最终使2BAct的浓度达到300 ppm（300 µg 2BAct/g饲料）。未添加任何化合物的Teklad 2014被用作安慰剂饮食。[1]

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小鼠模型的构建[1]
Eif2b5R191H/R191H敲入突变小鼠模型由genOway公司在C57BL/6J背景品系中构建。简而言之，针对Eif2b5基因座设计了一个靶向载体，同时插入：(1) 在第2和第3外显子之间插入一个Flp可切除的新霉素抗性盒；(2) 在第4外显子中插入一个CGC→CAC密码子替换（将Arg191残基替换为His）；(3) 在第3和第7外显子两侧插入loxP位点（图1—图补充2）。通过PCR和Southern印迹验证了ES细胞中同源重组的成功。通过囊胚注射法构建嵌合体，然后将其与野生型C57BL/6J小鼠交配，以鉴定F1代杂合子Eif2b5+/R191H;FRT-neo (flox)子代。通过将杂合子小鼠与Flp基因敲除小鼠交配，去除新霉素抗性基因盒。所得Eif2b5+/R191H (flox)小鼠用作种群建立者。实验采用纯合突变小鼠及其野生型同窝小鼠作为对照。Eif2b5R132H/R132H小鼠模型以类似方式构建。

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2BAct的体内药效主要通过基因工程小鼠模型进行评估。以Eif2b5ᴿ¹⁹¹ᴴ VWM小鼠模型为例：将6-11周龄的R191H小鼠随机分为治疗组和对照组。2BAct以300 μg/g饲料的比例掺入啮齿动物饲料中口服给药，这种给药方式确保在整个研究期间实现持续的药物暴露。在21周的治疗期间，每周监测体重变化、运动功能和临床评分。终点评估包括：通过转棒实验评估运动协调能力；处死后取脑组织进行Luxol固蓝染色评估髓鞘完整性；通过GFAP和Iba-1免疫组化染色评估星形胶质细胞和小胶质细胞活化（反应性胶质增生）；通过转录组和蛋白质组分析评估基因和蛋白表达谱的正常化程度。在更严重的N208Y eIF2B-α基因敲入小鼠模型中，2BAct同样以饲料掺入方式给药，评估指标包括新生期生存率、体重增长和整体生存期。撤药实验显示，停止2BAct给药后，所有组织中迅速出现ISR诱导和快速恶化，提示持续治疗对各组织维持蛋白稳态至关重要。

2BAct的药代动力学性质已在啮齿动物中进行表征。该化合物具有良好的口服生物利用度，可使用水性溶媒进行剂量依赖性口服给药。2BAct能够穿透血脑屏障进入中枢神经系统（未结合脑/血浆比约0.3），确保在脑内达到治疗浓度。在VWM小鼠21周治疗研究中，通过饲料掺入给药2BAct所达到的未结合脑暴露量超过体外EC₅₀的15倍，确保了对靶点的饱和覆盖。相较于第一代eIF2B激活剂ISRIB，2BAct显示出更优的溶解性和药代动力学特征。在犬心血管安全性研究中观察到了显著异常，这限制了该化合物用于人体给药的可行性。

2BAct在啮齿动物研究中总体耐受性良好，但跨物种安全性差异限制了其临床转化潜力。在VWM小鼠长达21周的长期治疗中，2BAct未引起体重异常变化，动物整体表现良好。根据材料安全数据表（MSDS），2BAct未被归类为危险物质或混合物，仅供研究使用，不用于人体诊断或治疗。然而，关键的安全性问题出现在犬心血管安全研究中——在该模型中观察到了显著异常，这使得该特定分子不适合用于人体给药。这一发现提示，尽管2BAct在啮齿动物中具有良好的安全性和药效，但存在显著的物种依赖性毒性差异。

[1]. eIF2B activator prevents neurological defects caused by a chronic integrated stress response. Elife. 2019;8:e42940.

整合应激反应 (ISR) 会降低蛋白质合成速率，同时诱导细胞内应激蛋白的表达。多种损伤会激活激酶，这些激酶会磷酸化 GTP 酶 eIF2，从而抑制其交换因子 eIF2B。消失性白质 (VWM) 是一种由 eIF2B 突变引起的神经系统疾病，这些突变与磷酸化的 eIF2 一样，会降低 eIF2B 的活性。我们发现，将人类 VWM 突变引入小鼠体内会导致中枢神经系统持续性 ISR 诱导。ISR 激活先于髓鞘丢失和运动功能障碍的发生。值得注意的是，长期使用小分子 eIF2B 激活剂 2BAct 治疗可预防所有病理指标的改变，并使 VWM 小鼠的转录组和蛋白质组恢复正常。2BAct 可在体内刺激突变 eIF2B 复合物的残余活性，从而消除适应不良的应激反应。因此，2BAct 样分子可能为 VWM 提供一种有前景的治疗方法，并可在多种疾病情况下缓解慢性 ISR 诱导。[1]

C19H16CLF3N4O3

440.803553581238

440.09

C, 51.77; H, 3.66; Cl, 8.04; F, 12.93; N, 12.71; O, 10.89

2143542-28-1

2143542-28-1

132091799

Light yellow to light brown solid powder

2.2

93.2Ų

ClC1C=CC(=CC=1F)OCC(NC12CC(C1)(C2)NC(C1C=NC(C(F)F)=CN=1)=O)=O

HYQJXXCYOYRNMP-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H16ClF3N4O3/c20-11-2-1-10(3-12(11)21)30-6-15(28)26-18-7-19(8-18,9-18)27-17(29)14-5-24-13(4-25-14)16(22)23/h1-5,16H,6-9H2,(H,26,28)(H,27,29)

N-[3-[[2-(4-chloro-3-fluorophenoxy)acetyl]amino]-1-bicyclo[1.1.1]pentanyl]-5-(difluoromethyl)pyrazine-2-carboxamide

2BAct; 2B Act; 2143542-28-1; N-(3-(2-(4-Chloro-3-fluorophenoxy)acetamido)bicyclo[1.1.1]pentan-1-yl)-5-(difluoromethyl)pyrazine-2-carboxamide; N-{3-[2-(4-chloro-3-fluorophenoxy)acetamido]bicyclo[1.1.1]pentan-1-yl}-5-(difluoromethyl)pyrazine-2-carboxamide; 2BAct?; SCHEMBL19556524; SCHEMBL22956678; HYQJXXCYOYRNMP-UHFFFAOYSA-N; 2B-Act

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~250 mg/mL (~567.2 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.72 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.72 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。