3BDO

mTOR; FKBP1A
FKBP1A (FK506-binding protein 1A, 12 kDa). 3BDO binds to the same sites (TYR82A and ILE56A) on FKBP1A as rapamycin. [1]
MTOR (mechanistic target of rapamycin). 3BDO activates MTOR signaling pathway. [1][2]

3BDO抑制人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和神经元细胞的自噬。它通过降低肿瘤蛋白TP53和NUPR1的水平、抑制TP53的核转位以及减少活性氧的产生，从而预防脂多糖诱导的HUVEC自噬损伤。3BDO的靶点FKBP1A（FK506结合蛋白1A，12 kDa）可激活mTOR。3BDO对TGFB2的表达没有影响，但显著降低了FLJ11812的水平，FLJ11812是一种源自TGFB2 3′非翻译区（3′UTR）的长链非编码RNA（lncRNA）。除了FLJ11812水平的降低外，3BDO还会导致ATG13蛋白水平的下降。在PC12神经元细胞中，3BDO抑制过量的A(25-35)肽诱导的自噬，并提高RPS6KB1的磷酸化水平[1]。3BDO可预防碱性成纤维细胞生长因子2和血清剥夺诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)衰老和凋亡。它能抑制血管平滑肌细胞(VSMC)的增殖和迁移，同时特异性地保护血管内皮细胞(VEC)[2]。 3BDO（20–60 μG/mL）能够抑制血管内皮细胞（VEC）凋亡并抑制整合素4的表达，但无法降低血清和FGF-2缺乏引起的活性氧（ROS）水平[3]。在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中，3BDO（60 μM，24 h）可增加MTOR底物RPS6KB1和EIF4EBP1的磷酸化水平。FKBP1A过表达可抑制这种作用[1]。在HUVEC中，3BDO（60 μM，预处理30 min）可拮抗雷帕霉素（10 μM，6 h）的作用，逆转雷帕霉素诱导的MTOR（Ser2448）和RPS6KB1（Thr389）磷酸化水平的降低。 [1] 3BDO（60 μM，预处理 30 分钟）抑制了雷帕霉素（10 μM，6 小时）诱导的 HUVEC 细胞中 MAP1LC3B 斑点的增加、MAP1LC3B-II 蛋白水平的升高以及 SQSTM1 蛋白水平的降低，表明其抑制了自噬。[1] 3BDO（60 μM，6 小时）增加了 HUVEC 细胞中 TIA1 蛋白丝氨酸残基的磷酸化水平，逆转了雷帕霉素（10 μM）诱导的磷酸化水平降低。[1] 在 HUVEC 细胞中，3BDO（60 μM，24 小时）显著下调了 lncRNA FLJ11812 的表达水平，微阵列分析（下调最显著的转录本，变化倍数 >2）和 RT-PCR 结果均证实了这一点。这种效应呈剂量和时间依赖性（不同浓度处理24小时；120 μM处理不同时间）。3BDO不影响TGFB2的mRNA或蛋白水平。[1]
RNA-ChIP实验表明，3BDO（120 μM，10小时）降低了TIA1与TGFB2 3'UTR的相互作用。[1]
FLJ11812的过表达逆转了3BDO在HUVECs中诱导的自噬抑制，提示3BDO对自噬的抑制作用是由FLJ11812介导的。 [1]在HUVECs细胞中，3BDO（7.5、15、30、60、120 μM，预处理30分钟）以剂量依赖的方式抑制雷帕霉素（10 μM）诱导的ATG13磷酸化（p-ATG13，Ser318）水平的降低和总ATG13蛋白水平的升高。[1]在HUVECs细胞中，3BDO（60或120 μM，处理12小时）抑制oxLDL（50 μg/ml，处理12小时）诱导的自噬，表现为：降低ATG13蛋白水平并增加其磷酸化（p-ATG13/ATG13比值）；降低MAP1LC3B-II水平并增加SQSTM1水平（60和120 μM）。 [2]在HUVECs中，3BDO（60或120 μM，12 h）抑制oxLDL（50 μg/ml）诱导的ICAM-1和VCAM-1蛋白水平上调，并抑制IL-6和IL-8的分泌。[2]在HUVECs中，3BDO（20-60 μg/ml）抑制血清剥夺和FGF-2诱导的细胞凋亡，表现为细胞形态改善、细胞活力增加（MTT法）、核DNA浓缩/断裂减少（吖啶橙染色）以及凋亡细胞百分比降低（TUNEL法，40 μg/ml处理24 h后，凋亡细胞百分比从30.89±9.29%降至9.89±5.66%）。 [3]在缺乏血清和FGF-2的血管内皮细胞(VEC)中，3BDO（40 μg/ml，24 h）显著抑制了整合素β4表达的增加，但对升高的细胞内ROS水平没有影响。[3]在RAW246.7巨噬细胞和来自apoE-/-小鼠的血管平滑肌细胞(VSMC)中，3BDO不影响oxLDL诱导的p70S6K和4EBP1磷酸化水平的变化，也不影响LC3-II和ATG13的水平，表明其对VEC具有细胞类型特异性活性。[2]

体内试验表明，3BDO具有较高的安全性。在App和Psen1转基因小鼠中，3BDO治疗可显著降低自噬体的数量并增强神经元功能[1]。在apoE-/-小鼠的斑块内皮细胞中，3BDO可降低ATG13蛋白水平，同时在体内激活mTOR。虽然3BDO对apoE-/-小鼠血管平滑肌细胞或巨噬细胞系RAW246.7中的mTOR活性或自噬没有影响，但它确实抑制了斑块内皮细胞死亡，并抑制了小鼠动脉粥样硬化的发展。在apoE-/-小鼠中，3BDO通过激活mTOR保护血管内皮细胞（VECs）来稳定动脉粥样硬化病变[2]。在App和Psen1转基因小鼠中，3BDO治疗显著降低了自噬体的数量并改善了神经元功能。 [1] 在喂食致动脉粥样硬化饮食的 apoE-/- 小鼠中，注射 3BDO（50 或 100 mg/kg/d，持续 8 周）可激活内皮细胞 mTOR，表现为斑块内皮细胞中 p-p70S6K 水平升高。[2] 在 apoE-/- 小鼠中，注射 3BDO（50 或 100 mg/kg/d，持续 8 周）可降低斑块内皮细胞中 ATG13 的蛋白水平，证实了内皮细胞自噬受到抑制。[2] 在 apoE-/- 小鼠中，注射 3BDO（100 mg/kg/d）可降低斑块内皮细胞的自噬（通过表面染色观察到的 LC3 点减少）和凋亡（TUNEL 阳性细胞减少）。 [2] 在 apoE-/- 小鼠中，3BDO（100 mg/kg/d，8 周）显著减少了动脉粥样硬化病变面积（主动脉全层油红 O 染色和主动脉根部 H&E 染色），促进了斑块稳定性（脂质沉积减少、平滑肌细胞增多、巨噬细胞面积和 MMP-2/9 活性降低），并降低了血清 IL-6 和 IL-8 水平。[2]

使用 IP 裂解缓冲液，从暴露于雷帕霉素 (10 μM)、3BDO (60 μM) 或两者共同作用 6 小时的 HUVEC 细胞中提取总蛋白。4°C 离心后收集上清液，并将其与蛋白 A/G 琼脂糖珠、TIA1 抗体或作为对照的常规小鼠 IgG 在 4°C 孵育过夜。用 IP 裂解缓冲液清洗琼脂糖珠三次，然后用 4×SDS 上样缓冲液洗脱。使用丝氨酸磷酸化抗体和蛋白质印迹法检测丝氨酸磷酸化。使用 SYBYL 软件进行分子对接。FKBP1A 结构的三维坐标（PBD ID：2PPN；1FAP）来自蛋白质数据库 (PDB)。将 3BDO 对接至 FKBP1A 的结合口袋位点，以研究可能的结合模式。对接构象根据CScore进行排序，并对排名最高的结果（CScore 5）进行目视检查。结果预测3BDO可以与FKBP1A中的TYR82A和ILE56A位点形成氢键，这两个位点是雷帕霉素结合的两个氨基酸位点。[1]

从脐带中分离出人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)，并在含 20% 胎牛血清和 10 IU/mL 成纤维细胞生长因子 2 的 M199 培养基中培养。实验中使用传代至第 10 代的细胞。细胞培养至 80% 汇合度后进行处理。[1][2]
对于蛋白质印迹分析，将 HUVECs 裂解于裂解缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 6.8、2% SDS、6% 甘油、1% 2-巯基乙醇、2 mM PMSF、0.2% 溴酚蓝和蛋白酶抑制剂混合物）中。取等量蛋白 (15 μg) 进行 15% SDS-PAGE 电泳分离，然后转移至 PVDF 膜，用 5% 脱脂奶粉封闭，再与一抗 (1:1000) 孵育，最后与 HRP 标记的二抗 (1:5000) 孵育。采用增强化学发光法检测条带。[1]
免疫荧光分析中，HUVECs细胞用4%多聚甲醛固定，用3%正常山羊血清封闭，与一抗（例如抗MAP1LC3B抗体）于4℃孵育过夜，再与FITC标记的二抗（1:200）孵育。细胞通过共聚焦显微镜进行评估。[1][2]
TIA1磷酸化检测中，使用IP裂解缓冲液提取总蛋白。离心后，将上清液与Protein A/G琼脂糖珠和TIA1抗体于4℃孵育过夜。洗涤并洗脱琼脂糖珠。使用丝氨酸磷酸化抗体通过Western blot检测丝氨酸磷酸化。 [1]
对于RNA干扰（TIA1或FLJ11812 siRNA），将汇合度达到80%的细胞用转染试剂转染siRNA（40 nM）。24小时后，更换为正常培养基，继续培养24小时进行检测。[1]
对于瞬时过表达，使用Lipofectamine 2000将pCMV6-FLJ11812、pCMV6-XL5（对照）或FKBP1A-GFP载体转染至HUVEC细胞4-6小时，然后培养24或48小时后进行后续处理。[1]
对于荧光素酶报告基因检测，将HEK293细胞接种于96孔板中。使用 Lipofectamine 2000 将细胞与荧光素酶报告基因构建体（例如 Luc-FLJ11812-WT 或 Luc-ATG13-WT）和 MIR4459 模拟物（10 或 40 nM）共转染。24 小时后，使用发光仪测量萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。[1]
为了测量细胞活力（MTT 法），处理血管内皮细胞 (VEC) 后加入 MTT 溶液。溶解甲臜晶体后，测量吸光度。[3]
通过 TUNEL 法定量细胞凋亡。固定细胞并用 TUNEL 试剂盒染色，计数凋亡细胞的百分比。使用吖啶橙染色评估细胞核形态。[3]
为了检测活性氧 (ROS)，将细胞加载荧光探针 DCHF，DCHF 可被细胞内 ROS 氧化为荧光 DCF。测量荧光强度。 [3]

本研究使用8周龄的雄性apoE-/-小鼠。apoE-/-小鼠饲喂含21%脂肪和0.15%胆固醇的致动脉粥样硬化饮食。为避免不同批次饮食差异可能造成的混淆效应，实验全程使用同一批次的饮食。20周龄的小鼠被分为3组进行为期8周的治疗（每组n=8只）：对照组（DMSO）、低剂量组（3BDO；50 mg/kg/d；3BDO-L）和高剂量组（3BDO；100 mg/kg/d；3BDO-H）。每周给小鼠注射3BDO时，记录其体重。动物通过放血处死，并从下腔静脉采集血样[2]。

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对于动脉粥样硬化模型，8周龄雄性apoE-/-小鼠（C57BL/6J背景）喂以致动脉粥样硬化饮食（21%脂肪，0.15%胆固醇）。20周龄时，将小鼠分为若干组（每组n=8），进行为期8周的治疗：对照组（DMSO）、低剂量3BDO组（50 mg/kg/d）和高剂量3BDO组（100 mg/kg/d）。药物通过注射给药。[2]
对于阿尔茨海默病模型，使用App和Psen1转基因小鼠。给予3BDO，并评估其对自噬体和神经元功能的影响（具体方案未在正文中说明）。 [1]
治疗后，动物被放血处死。从下腔静脉采集血液以获得血清。取出心脏和完整的主动脉。将主动脉根部包埋于OCT化合物中用于组织学检查。将剩余的主动脉纵向切开，固定，并用油红O染色，用于表面病变分析。[2]

3BDO在体内（App和Psen1转基因小鼠）具有良好的安全性。[1]
在用3BDO（50或100 mg/kg/d，持续8周）治疗的apoE-/-小鼠中，对照组和治疗组在体重或各器官（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、脑）的重量方面均无显著差异。[2]
3BDO抑制了oxLDL处理的HUVECs和apoE-/-小鼠的炎症反应（降低了血清IL-6和IL-8水平）。[2]

[1]. Autophagy. 2014 Jun;10(6):957-71.

[2]. Sci Rep. 2014 Jul 1;4:5519. doi: 10.1038/srep05519.

[3]. Bioorg Med Chem Lett. 2007 Jan 15;17(2):482-5.

3BDO（3-苄基-5-((2-硝基苯氧基)甲基)-二氢呋喃-2(3H)-酮）是一种丁内酯衍生物。在此项研究之前，尚未发现任何mTOR的化学激活剂。3BDO被鉴定为一种新型mTOR激活剂，其作用类似于雷帕霉素的拮抗剂。[1] 研究发现，3BDO能够抑制氯喹和脂多糖诱导的HUVECs细胞自噬损伤，并抑制PC12神经元细胞中过量Aβ肽诱导的自噬。 [1]
该研究发现，3BDO可降低源自TGFB2 3'UTR的lncRNA（FLJ11812）的水平，该lncRNA作为MIR4459的竞争性内源RNA（ceRNA），从而调节ATG13的表达和自噬。[1]
在动脉粥样硬化的背景下，该研究提出，使用3BDO激活VEC mTOR是一种新的治疗策略。3BDO通过调节mTOR依赖性自噬选择性地保护内皮细胞，而不影响巨噬细胞或平滑肌细胞。[2]
3BDO抑制血清和FGF-2剥夺诱导的VEC凋亡，这种作用与整合素β4表达的下调有关。其抗凋亡作用与ROS水平无关。 [3]

C18H17NO5

327.3313

327.11

C, 62.60; H, 5.55; N, 4.06; O, 27.80

890405-51-3

890405-51-3

16216349

Off-white to light yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

540.0±20.0 °C at 760 mmHg

233.2±23.8 °C

0.0±1.4 mmHg at 25°C

1.594

2.56

81.4

0

5

5

24

443

0

C1(=C(C=CC=C1)OCC1CC(CC2C=CC=CC=2)C(=O)O1)N(=O)=O

AXPZIVKEZRHGAS-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C18H17NO5/c20-18-14(10-13-6-2-1-3-7-13)11-15(24-18)12-23-17-9-5-4-8-16(17)19(21)22/h1-9,14-15H,10-12H2

3-benzyl-5-[(2-nitrophenoxy)methyl]oxolan-2-one

3BDO

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 65~100 mg/mL (198.6~305.5 mM)
Ethanol: ~19.7 mg/mL (~60.2 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.64 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (7.64 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.64 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。