Non-muscle myosin II (NMII)[1]
Blebbistatin (racemate) targets non-muscle myosin II (NMII). [1]
Also inhibits myosin II to block cell migration. [2]

本研究利用牛角膜内皮细胞（BCEC）探讨了靶向NMII以改善角膜内皮细胞迁移的治疗潜力。肌球蛋白运动的直接抑制剂blebbistatin通过降低逆行肌动蛋白流并增强层状足突的持久性，刺激CEC的迁移和定向持久性，并加速体外伤口愈合[1]。在牛角膜内皮细胞（BCEC）中，blebbistatin（外消旋体）（10 μM）诱导的尾部回缩缺陷与Y27632类似，但与Y27632不同，它保留了肌动蛋白应力纤维，并且没有降低磷酸化调节性轻链（p-RLC）的水平。[1]通过延时成像（方向性比率和均方位移）测量，blebbistatin（外消旋体）（10 μM）显著提高了分离的BCEC的迁移速度和定向持久性。 [1]
Blebbistatin（外消旋体） (10 μM) 可加速 BCEC 单层细胞的体外伤口愈合，显著提高 16 小时内的伤口闭合率。[1]
Blebbistatin（外消旋体） (10 μM) 可降低 BCEC 细胞的肌动蛋白逆行流动，并增加伪足突起的持久性，这已通过动态图分析得到证实。[1]
Blebbistatin（外消旋体） 的促迁移作用可被 ARP2/3 抑制剂 CK666 (50 μM) 或肌动蛋白解聚剂 latrunculin B (1 μM) 的联合处理所消除，但不受非活性对照 CK689 的影响。 [1] 在融合的 BCEC 单层细胞中，blebbistatin（外消旋体） (10 μM) 保留了“鸡笼状”染色模式以及 ZO-1、连接周围肌动球蛋白环 (PJARs) 和 N-钙黏蛋白的顶端定位，而 Y27632 则破坏了这些结构。与 Y27632 相比，blebbistatin 对细胞旁通透性（FITC-葡聚糖扩散）的影响极小。[1] 在 NRK 细胞中，blebbistatin（外消旋体） 处理显著减少了迁移体（石榴样结构）的数量，并很大程度上抑制了新迁移体的形成，证实迁移体的生物发生依赖于细胞迁移。[2]

在兔角膜内皮划痕模型中，blebbistatin（0.05 mL，20 μM；前房内注射；每日一次；持续6天；新西兰白兔）治疗可改善伤口愈合[1]。

BCEC单层蛋白通透性测定[1]
将BCEC培养于对照培养基或含有10 μM Y27632或10 μM blebbistatin的培养基中，直至细胞在Transwell滤膜（0.4 μm孔径聚碳酸酯滤膜）上达到汇合。洗涤并在新鲜培养基中平衡30分钟后，向上室加入浓度为3 mg/mL的FITC标记的4K、40K和500K葡聚糖。继续孵育4小时后，取下室培养基，通过荧光法（激发波长492 nm，发射波长520 nm）测定扩散的FITC-葡聚糖。

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Blebbistatin（外消旋体）是肌球蛋白II ATPase活性的选择性抑制剂。然而，所提供的文献中并未描述详细的酶活性测定方案（例如，IC50 的测定）。[1]

免疫荧光共聚焦显微镜[1]
将BCECs培养于盖玻片上，在指定时间点用4%多聚甲醛（pH 7.4）在室温下固定30分钟，用0.5% Triton X-100透化5分钟，并用10%牛血清白蛋白封闭30分钟。然后将细胞与指定的一抗在4℃下孵育过夜。用PBS洗涤两次，每次15分钟后，将样品与Alexa Fluor标记的二抗在室温下孵育1小时。对于肌动蛋白标记，将样品与Alexa 546鬼笔环肽在室温下染色10分钟。经过多次洗涤后，所有样品均用荧光封片剂封片。使用激光扫描共聚焦显微镜获取免疫荧光图像，并用Zen软件进行分析。在 Y27632 或 blebbistatin 洗脱实验中，细胞接种后，在实验开始时同时加入 10 μM Y27632 或 10 μM blebbistatin 进行孵育。随后，在图 5f 所示的时间段内，从培养基中去除 Y27632 或 blebbistatin，之后收集细胞并进行共聚焦显微镜检查。

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活细胞成像[1]
在单细胞迁移研究中，将 BCEC 接种于 12 孔板中，并用对照培养基或含有 10 μM Y27632、10 μM blebbistatin 和 10 μM ML-7 的培养基孵育 2 天。随后将培养板置于配备蔡司 Axiovert 200 M 倒置显微镜和电动载物台的加湿 CO2 平衡培养箱中。使用 10×/0.3 EC Plan-Neofluar 物镜，每 30 分钟采集每种条件下 5 个视野的图像，持续 16 小时。使用 MetaMorph 软件追踪每个视野中随机选择的 10 个细胞（每种条件下 50 个细胞）的核位置。使用 Gorelik 等人慷慨提供的 DiPer 程序分析细胞迁移速度、方向性比率和均方位移。对于体外伤口愈合研究，将细胞接种于 6 孔板中，并用对照培养基培养至细胞汇合。成像前，用200 μl移液器吸头在每个孔中划痕产生伤口，并将培养基更换为分别含有载体对照、10 μM Y27632、10 μM blebbistatin或10 μM ML-7的无血清培养基。使用10×/0.3 EC Plan-Neofluar物镜每30分钟拍摄一次图像，持续16小时。使用ImageJ软件分析伤口面积的变化。

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对于BCEC原代培养：将新鲜牛眼中的牛角膜内皮细胞经胰蛋白酶消化（37°C，30分钟）后分离，并在添加了激素的上皮细胞培养基中培养。免疫荧光染色中，将盖玻片上的细胞用4%多聚甲醛固定，用0.5% Triton X-100透化，用10% BSA封闭，然后在4℃下与一抗（例如p-RLC、ZO-1、N-cadherin、ARP3、ARPC3）孵育过夜，随后与Alexa Fluor标记的二抗和Alexa 546鬼笔环肽孵育以标记肌动蛋白。使用共聚焦显微镜采集图像。[1]
单细胞迁移研究：将BCECs接种于12孔板中，并用对照培养基或含有10 μM Blebbistatin（外消旋体）的培养基孵育2天。将培养板置于带有电动载物台的加湿CO2平衡培养箱中。使用10倍物镜，每30分钟采集每种条件下5个视野的图像，持续16小时。使用 DiPer 程序追踪并分析每种条件下 50 个细胞的核位置，测定其迁移速度、方向性比率和均方位移。[1]
体外伤口愈合实验：将 BCEC 培养至 6 孔板中汇合。用 200 μl 移液器吸头划痕形成伤口，并将培养基更换为含载体对照或 10 μM Blebbistatin（外消旋体） 的无血清培养基。每 30 分钟拍摄一次图像，持续 16 小时，并使用 ImageJ 分析伤口面积。[1]
伪足突起动力学实验：将 BCEC 接种于 8 孔载玻片中培养 2 天。使用 63× 物镜每 3 秒拍摄一次图像，持续 10 分钟。使用 ImageJ 的 Multi Kymograph 插件，根据穿过伪足前缘的线条生成动态图，并量化伪足突起的持续时间和长度。 [1]
肌动蛋白逆行流动：将 rLVUbi-LifeAct-TagGFP2 转染至 BCECs 细胞中，用嘌呤霉素（1 μg/mL，3 天）筛选，然后进行铺板。使用 100 倍物镜，每 1 秒拍摄一次荧光图像，持续 3 分钟。构建动态图谱以测量肌动蛋白逆行流动速度。[1]
蛋白质通透性测定：将 BCECs 细胞培养于 Transwell 小室（孔径 0.4 μm）中，直至在对照培养基或含有 10 μM Blebbistatin（外消旋体） 的培养基中达到汇合。平衡后，向上室加入浓度为 3 mg/mL 的 FITC 标记的葡聚糖（4K、40K、500K）。孵育4小时后，通过荧光法（激发波长492 nm，发射波长520 nm）测定下室中扩散的FITC-葡聚糖。[1]
对于Western blot：用含有蛋白酶抑制剂混合物和0.1% SDS的RIPA缓冲液裂解BCEC细胞。蛋白质经SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜，封闭后，用一抗（例如p-RLC、RLC、ZO-1、N-钙黏蛋白、GAPDH）孵育，再用HRP标记的二抗孵育，最后通过化学发光法检测。[1]
对于迁移体研究：培养稳定表达TSPAN4-GFP或TSPAN4-mCherry的NRK细胞。对于活细胞成像，将细胞培养在纤连蛋白包被的玻璃底培养皿中，并使用共聚焦显微镜成像。为了测试迁移抑制剂，用Blebbistatin（外消旋体）处理细胞，并通过延时共聚焦显微镜观察。对迁移体（PLS）的形成进行定量分析。[2]

动物/疾病模型：新西兰白兔（16-20周龄；3-3.5 kg）[1]
剂量：0.05 mL；20 μM
给药途径：前房内注射；每日一次；持续6天
实验结果：显著改善了角膜透明度并消退了角膜水肿，表明完整的角膜内皮单层得以恢复。

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兔角膜内皮损伤模型[1]
兔角膜内皮损伤模型的操作方法参照先前描述的方法并稍作修改。16至20周龄、体重3至3.5 kg的新西兰白兔，采用肌内注射5 mg/kg盐酸赛拉嗪和40 mg/kg氯胺酮进行麻醉。为进一步减轻眼部疼痛，滴入0.5%的阿卡因眼用溶液。用8.0 mm标记器标出需要去除的内皮细胞区域。使用2.75 mm刀片切开角膜后，用后囊膜抛光器轻轻去除8.0 mm标记范围内的角膜内皮细胞（CEC），并用0.06%台盼蓝染色确认后弹力层裸露区域。对遗漏区域进行再次清创，以彻底清除细胞。损伤后，立即向不同组别的动物进行前房内注射0.05 mL的溶剂对照、20 μM Y27632或20 μM的blebbistatin，之后每日一次。术后滴用0.3%硫酸庆大霉素滴眼液以控制感染。在随访评估期间，使用手术显微镜观察并拍摄角膜。采用超声生物显微镜测量角膜厚度。简而言之，在肌内和局部麻醉后，将超声凝胶涂抹于角膜上。使用垂直于角膜表面的50 MHz换能器探头采集前房图像。仅采集中央角膜图像，该区域在未散瞳的情况下可清晰观察到晶状体。采集图像后，通过绘制一条垂直于角膜顶点的直线来测量角膜厚度。整个操作由一位事先不知晓实验条件的独立技术人员完成，并由作者（WTH）对图像中得到的角膜厚度进行进一步分析。在指定时间点处死动物，并取出角膜。为了量化损伤程度，用0.2%台盼蓝染色1分钟，以显示裸露的后弹力层。在手术显微镜下采集图像后，使用ImageJ软件量化损伤程度。免疫荧光染色时，将角膜在室温下用4%多聚甲醛（pH 7.4）固定5分钟，然后进行放射状切开以便平铺，并按上述方法进行免疫染色和观察。

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兔角膜内皮损伤模型：新西兰白兔（16-20周龄，3-3.5 kg）用肌注盐酸赛拉嗪（5 mg/kg）和氯胺酮（40 mg/kg）麻醉。局部麻醉后，标记一个直径为8.0 mm的角膜内皮区域。用2.75 mm刀片切开角膜，并用后囊膜抛光器轻轻去除标记区域内的角膜内皮细胞（CEC）。用0.06%台盼蓝染色确认后弹力层已剥脱。受伤后，立即进行前房内注射，注射液分别为0.05 mL的载体对照、20 μM Y27632或20 μM的Blebbistatin（外消旋体），之后每日一次。局部应用0.3%硫酸庆大霉素滴眼液控制感染。使用50 MHz超声换能器垂直于角膜表面，通过超声生物显微镜测量角膜厚度。在指定时间点，处死动物，取出角膜，并用0.2%台盼蓝染色以量化伤口范围。对于免疫荧光染色，将角膜固定于4%多聚甲醛溶液中，沿放射状切开以进行平铺包埋，然后进行免疫染色。[1]

外消旋体已知具有荧光性、水溶性差、细胞毒性和光降解性。然而，相关文献中并未提供具体的毒性数据（例如，LD50、器官毒性）。[1]

[1]. Targeting non-muscle myosin II promotes corneal endothelial migration through regulating lamellipodial dynamics. J Mol Med (Berl). 2019 Sep;97(9):1345-1357.

[2]. Discovery of the migrasome, an organelle mediating release of cytoplasmic contents during cell migration. Cell Res. 2015 Jan;25(1):24-38.

布比司他汀是一种吡咯喹啉类化合物，化学名称为1,2,3,3a-四氢-H-吡咯并[2,3-b]喹啉-4-酮，其3a位、6位和1位分别被羟基、甲基和苯基取代。它是一种非肌肉肌球蛋白II ATPase活性抑制剂。它是一种吡咯喹啉类化合物，同时也是一种环状酮、叔醇和叔α-羟基酮。角膜内皮细胞（CEC）功能障碍可导致角膜水肿，甚至可能导致失明。除了角膜移植外，对于周边细胞储备充足的中央型病变，也提出了后弹力层剥离术，但促进CEC向中心迁移是该策略的关键。本研究表明，使用 ROCK 抑制剂 Y27632 或选择性 NMII 抑制剂 blebbistatin 靶向非肌肉肌球蛋白 II (NMII) 活性，可促进角膜内皮细胞 (CEC) 的定向迁移，并加速体外伤口愈合。NMII 抑制后，伪足的持续时间增加，肌动蛋白的逆行流动减少。使用肌动蛋白相关蛋白 2/3 (ARP2/3) 抑制剂拮抗伪足可消除这种促进迁移的作用。虽然 Y27632 和 blebbistatin 均能加速伤口愈合，但 blebbistatin 治疗能更好地维持细胞连接的完整性和屏障功能，从而在兔角膜内皮损伤模型中更快地消退角膜肿胀。我们的结果表明，NMII 是治疗 CEC 功能障碍的一个有前景的治疗靶点。关键信息：NMII 抑制可促进 CEC 的定向迁移和体外伤口愈合。NMII 抑制后，片状伪足的持续时间增加。选择性NMII抑制剂比ROCK抑制剂更能维持细胞连接的完整性。选择性NMII抑制剂在体内损伤后会加速角膜脱水。[1]

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Blebbistatin（外消旋体）是一种选择性非肌肉肌球蛋白II (NMII) 马达ATPase活性抑制剂。它已被用于研究NMII在细胞迁移、伤口愈合和细胞连接完整性中的作用。与ROCK抑制剂不同，blebbistatin在促进定向迁移的同时，还能维持细胞连接的完整性和屏障功能。[1]
Blebbistatin（外消旋体）已被用作迁移抑制剂，以验证迁移小体的形成依赖于细胞迁移。在NRK细胞中，blebbistatin处理显著减少了迁移小体的数量。[2]
blebbistatin的局限性包括其荧光性、水溶性差、细胞毒性和光降解性，这些因素可能会影响其在临床应用中的使用。已经开发出光稳定性衍生物，例如 (S)-3'-羟基blebbistatin。[1]

C18H16N2O2

292.33

292.121

C, 73.95; H, 5.52; N, 9.58; O, 10.95

674289-55-5

(-)-Blebbistatin;856925-71-8

3476986

Light yellow to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

507.3±60.0 °C at 760 mmHg

210-212ºC

260.6±32.9 °C

0.0±1.4 mmHg at 25°C

1.681

1.62

52.9

1

3

1

22

497

0

LZAXPYOBKSJSEX-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C18H16N2O2/c1-12-7-8-15-14(11-12)16(21)18(22)9-10-20(17(18)19-15)13-5-3-2-4-6-13/h2-8,11,22H,9-10H2,1H3

3a-hydroxy-6-methyl-1-phenyl-2,3-dihydropyrrolo[2,3-b]quinolin-4-one

Blebbistatin; (+/-)-Blebbistatin; 674289-55-5; (+-)-Blebbistatin; CHEBI:75379; UNII-20WC4J7CQ6; 3a-hydroxy-6-methyl-1-phenyl-2,3-dihydropyrrolo[2,3-b]quinolin-4-one; 20WC4J7CQ6;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 25 mg/mL (85.52 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (8.55 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 +5% Tween-80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80+，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。