CDK2 13 nM (IC50) JAK2 73 nM (IC50) FLT3 56 nM (IC50)

(E/Z)-Zotiraciclib (0-10 μM) 对 FLT3、JAK2 和 CDK2 具有强抑制作用，IC50 值分别为 13、73 和 56 nM[1]。 (E/Z)-Zotiraciclib（0–10 μM；48 小时）可抑制癌细胞生长[1]。 (E/Z)-Zotiraciclib（8-1000 nM；24 h）的 IC50 值为 0.13 μM，可有效抑制 HCT-116 细胞中的 CDK2 生物标志物 pRb，并有效对抗 MV4-11 细胞中的 pRb[1]。

(E/Z)-Zotiraciclib（50 和 75 mg/kg；口服，每日一次，持续 3 周）抑制肿瘤生长[1]。 Zotiraciclib (E/Z)（15 和 75 mg/kg；口服，每天一次，连续两天，休息五天；腹腔注射，每天一次，连续五天，休息五天）以两种方式抑制肿瘤的生长[1]。

酶活分析[1]
使用重组酶（CDK2/细胞周期蛋白A、JAK2和FLT3）。所有测定均在384孔白色微量滴定板上使用Cambrex的PKLight测定系统进行。该测定平台是一种光度测定法，用于使用萤光素酶偶联反应检测反应中的ATP。在从10μM开始的3倍或4倍连续稀释制备的8个浓度下，对Zotiraciclib等化合物进行了测试。对于CDK2/细胞周期蛋白A测定，反应混合物由25μL测定缓冲液（50 mM Hepes，pH 7.5，10 mM MgCl2，5 mM MnCl2，5 mmol BGP，1 mM DTT，0.1 mM原钒酸钠）中的以下成分组成，1.4μg/mL CDK2/细胞循环蛋白A复合物，0.5μM RbING底物和0.5μM ATP。将混合物在室温下孵育2小时。然后加入13μL PKLight ATP检测试剂，将混合物孵育10分钟。在多标记平板阅读器上检测到发光信号。其他激酶测定类似，但试剂存在以下差异：对于FLT3测定，混合物含有2.0μg/mL FLT3酶、5μM聚（Glu，Tyr）底物和4μM ATP。对于JAK2测定，反应含有0.35μg/mL JAK2酶、10μM聚（Glu、Ala、Tyr）底物和0.15μM ATP。使用分析软件Prism 5.0从数据中生成IC50值。

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高通量溶解度测定[1]
该测定以高通量模式测量化合物在PBS中的溶解度。使用96孔V形底部半透明PP微孔板和96孔UV透明微孔板进行测定。在含有20%DMSO的10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中制备化合物溶液（250μM），总体积为0.2 mL。将平板放置在转速为600 rpm的摇床上1.5小时，然后在室温下静置2小时。将平板在1500g下离心15分钟。将上清液转移到紫外透明微孔板上，在适当的最大吸收值下通过紫外分光光度法进行分析。使用校准曲线定量上清液中化合物的浓度。对于250±30μM的计算溶解度，溶解度报告为>250μM（>150μg/mL）。

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肝微粒体的代谢稳定性[1]
在含有50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）和NADPH再生系统的反应混合物中，在37°C下，在总反应体积为1 mL的条件下，将化合物（5μM）与MLM（小鼠肝微粒体）、RLM（大鼠肝微粒物）、DLM（狗肝微粒剂）和HLM（人肝微粒机）（最终微粒体浓度约为0.87 mg/mL）一起孵育。在乙腈和DMSO（80:20）的冷冻混合物中孵育0、15、30、45和60分钟后终止反应。将混合物涡旋5分钟，在4°C下以13 200 rpm离心15分钟，通过LC-MS/MS分析上清液。通过在对数线性标度上绘制母体化合物剩余百分比随时间的变化来评估稳定性，并使用一阶方程t1/2=0.693/k从对数线性曲线的线性部分估算半衰期，其中k是曲线的斜率（等于一阶消除速率常数）。

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人体外CYP450抑制试验[1]
Zotiraciclib与人肝微粒体（CYP1A和CYP3A4为0.25mg/mL，CYP2C19和CYP2D6为0.5mg/mL，CYP2C9为1mg/mL）和NADPH（1mM）一起孵育（DMSO中浓度为0.05、0.25、0.5、2.5、5、25μM；DMSO终浓度为0.35%），在探针底物乙氧基间苯二酚（0.5μM）（CYP1A）、甲磺丁脲（120μM A（5μM）30分钟（CYP2D6）和咪达唑仑（2.5μM）5分钟（CYP3A4）在37°C下。选择性抑制剂α-萘黄酮、磺胺苯唑、反苯环丙胺、奎尼丁和酮康唑分别用作CYP1A、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4抑制剂的阳性对照。对于CYP1A，通过加入甲醇终止反应，并通过荧光（激发波长为535nm，发射波长为595nm）监测代谢物间苯二酚的形成。对于CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4孵育，通过加入含有内标的甲醇终止反应。将样品离心，合并上清液，通过LC-MS/MS同时分析4-羟基甲苯磺丁脲、4-羟基美苯妥英、右美沙芬、1-羟基咪达唑仑和内标。在分析前，将去离子水中的甲酸（终浓度为0.1%）加入最终样品中。与载体对照相比，代谢物形成的减少用于计算IC50值（产生50%抑制的测试化合物浓度）。

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体外血浆蛋白结合 平衡透析在腔室体积为500μL的微型平衡透析器中进行（每个腔室的体积为250μL）。使用的半透膜用Milli-Q水冲洗，并在PBS中浸泡10分钟。将Zotiraciclib加入血浆（来自小鼠、狗和人类）中，使终浓度达到1000 ng/mL。将掺入的血浆涡旋，并将250μL等分到透析器细胞的一个腔室中。另一个腔室装有250μL PBS缓冲液。将组装好的细胞放入37°C的水浴中，透析4小时。透析后，将50μL含有游离Zotiraciclib的PBS透析样品转移到2 mL Eppendorf管中，一式三份进行提取。使用混合器，在电机速度设置为60并带有脉冲的情况下，用1500μL MTBE（甲基叔丁基醚）提取样品30分钟。30分钟后，在微量离心机中以13000 rpm的速度在4°C下离心样品管10分钟。将上清液（1400μL）转移到新鲜的2 mL Eppendorf管中，在43°C的SpeedVac中干燥35分钟。用100μL甲醇/Milli-Q H2O（60:40）复溶干燥的样品，并通过LC-MS/MS进行分析。

细胞增殖测定[1]
细胞类型： HL-60、HCT-116、RAMOS、COLO205 和 DU145 细胞系
测试浓度： 0-10 μM
孵育时间： 48 h
实验结果： 抑制 HL-60、HCT-116、RAMOS、COLO205 和 DU145 细胞增殖，IC50 为 0.059 、0.079、0.033、0.072 和 0.14 μM，分别。

动物/疾病模型：雄性 balb/c（Bagg ALBino）小鼠：HCT-116 结肠癌细胞异种移植[1]
剂量：50 和 75 mg/kg
给药途径：po（灌胃）；50 和 75 mg/kg，每日一次，持续 3 周
实验结果：显著抑制肿瘤生长，平均 TGI 为 82%。

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动物/疾病模型：雄性 balb/c (Bagg ALBino) 小鼠：淋巴瘤 Ramos 细胞异种移植[1]
剂量：15 和 75 mg/kg
给药途径：口服（po）和腹腔注射（ip）；75 mg/kg，每日一次，连续给药 2 天，停药 5 天（po）；15 mg/kg，每日一次，连续给药 5 天，停药 5 天（ip）
实验结果：口服和腹腔注射给药均显著抑制肿瘤生长，平均肿瘤生长抑制率（TGI）分别为 42% 和 63%。

Zotiraciclib/26h 的广泛 ADME 分析 [1]
在 Caco-2 双向渗透性试验中，26h 在顶端至基底外侧方向 (Papp,A→B) 和基底外侧至顶端方向 (Papp,B→A) 的渗透率 (Papp) 分别为 28.0 × 10–6 和 27.4 × 10–6 cm/s。外排比率（定义为 Papp,B→A 与 Papp,A→B 的比值）小于 3 (1.0)，表明 26h 不是肠道 P-gp 转运蛋白的外排底物，提示其在人体内具有较高的肠道吸收率（表 6）。在人肝微粒体 (HLM) 中，化合物 26h 稳定性良好，半衰期为 45 分钟；在二聚体肝微粒体 (DLM) 中稳定性中等 (t1/2 = 33 分钟)；在单聚体肝微粒体 (MLM) (t1/2 = 12 分钟) 和重组肝微粒体 (RLM) (t1/2 = 11 分钟) 中清除速度较快。在最高测试浓度 25 μM 下，化合物 26h 未抑制人 CYP1A2、3A4、2C9 和 2C19 同工酶，但该化合物抑制 CYP2D6，IC50 = 0.95 μM，与最大耐受剂量下观察到的血浆 Cmax 值大致相同。化合物 26h 与人、小鼠和犬血浆蛋白的结合率很高，血浆蛋白结合率 (PPB) 为 99.4% 至 99.9%。

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佐替拉西利/26h 在小鼠体内的药代动力学[1]
佐替拉西利/26h 在小鼠体内的药代动力学特征总结于表 7。佐替拉西利/26h 相对于肝血流量具有较高的全身清除率和稳态分布容积，末端半衰期约为 5.0 小时。单次口服 75 mg/kg 后，佐替拉西利/26h 吸收迅速（tmax = 0.5 小时），平均 Cmax 和 AUC 分别为 1029 ng/mL 和 2523 ng·h/mL，平均末端半衰期为 6.1 小时。其口服生物利用度为 24%，可接受。在小鼠体内，75 mg/kg 剂量下的药物暴露量远高于酶抑制浓度（CDK2 IC50 = 0.013 μM，JAK2 IC50 = 0.073 μM，FLT3 IC50 = 0.056 μM）和 HCT-116 (IC50 = 0.079 μM) 及 HL-60 (IC50 = 0.059 μM) 细胞增殖浓度，与临床前药理学模型中类似剂量下观察到的 26 小时疗效相符。

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Zotiraciclib/SB1317 (TG02) 是一种新型强效小分子 CDK/JAK2/FLT3 抑制剂。为了评估该候选药物的全部潜力，我们对其进行了药物代谢和药代动力学研究。 SB1317 可溶，在 Caco-2 细胞中具有高渗透性，在小鼠、犬和人血浆中的结合率均 > 99%。与小鼠和大鼠相比，SB1317 在人和犬肝微粒体中代谢稳定。体外实验表明，SB1317 主要由 CYP3A4 和 CYP1A2 代谢。除 CYP2D6 (IC50=1 μM) 外，SB1317 在体外对任何主要的人类 CYP 均无抑制作用。体外实验表明，SB1317 对人肝细胞中 CYP1A 和 CYP3A4 的诱导作用不显著。临床前动物肝微粒体中的代谢谱与人类的代谢谱在性质上相似。药代动力学研究表明，SB1317 具有中等至较高的全身清除率（相对于肝血流量），分布容积大（> 0.6 L/kg），小鼠、大鼠和犬的口服生物利用度分别为 24%、约 4% 和 37%。 SB1317 在小鼠体内具有广泛的组织分布。其良好的 ADME 特性支持了其作为口服候选药物的临床前开发。[2]

[1]. Discovery of kinase spectrum selective macrocycle (16E)-14-methyl-20-oxa-5,7,14,26-tetraazatetracyclo[19.3.1.1(2,6).1(8,12)]heptacosa-1(25),2(26),3,5,8(27),9,11,16,21,23-decaene (SB1317/TG02), a potent inhibitor of cyclin dependent kina.

[2]. Preclinical metabolism and pharmacokinetics of SB1317 (TG02), a potent CDK/JAK2/FLT3 inhibitor. Drug Metab Lett. 2012 Mar;6(1):33-42.

Zotiraciclib 正在临床试验 NCT02942264 中进行研究（Zotiraciclib (TG02) 联合高剂量或节拍式替莫唑胺，随后进行 Zotiraciclib (TG02) 联合替莫唑胺与单用替莫唑胺治疗复发性间变性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤成人患者的随机 II 期试验）。

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ZOTIRACICLIB 是一种小分子药物，目前已完成 II 期临床试验（涵盖所有适应症），并有 7 个在研适应症。

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本文描述了一系列独特的小分子大环化合物的设计、合成和构效关系，这些化合物对 CDK、JAK2 和 FLT3 激酶具有谱选择性抑制作用。我们对最有前景的先导化合物进行了体外评估，考察了其对癌细胞增殖的抑制作用、溶解度、CYP450 抑制作用和微粒体稳定性。该筛选级联结果显示，化合物 26h 为优选化合物，其对 CDK2、JAK2 和 FLT3 的 IC50 值分别为 13、73 和 56 nM。在临床前动物模型中进行的药代动力学 (PK) 研究显示，26h 具有良好的口服暴露量。在结肠癌 (HCT-116) 和淋巴瘤 (Ramos) 异种移植模型研究中观察到了口服疗效，这与观察到的 PK/PD 相关性一致。26h (SB1317/TG02) 于 2010 年进入研发阶段，目前正在进行针对晚期白血病和多发性骨髓瘤的 I 期临床试验。[1]

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我们描述了一系列小分子大环化合物的发现，这些化合物是 CDK、JAK2 和 FLT3 的强效抑制剂，具有此前未报道的谱选择性。基于构象限制假设，我们利用 RCM 策略合成了这些大环化合物。通过对初始化合物进行针对 CDK2、JAK2 和 FLT3 激酶的功能性生化分析筛选，最终选定了一种含有酚醚、反式双键和烯丙基/苄基 N-甲基的优选连接基团。构效关系研究和更广泛的体外分析，特别是细胞实验，确定了具有独特激酶抑制谱的小分子激酶抑制剂 26h 为首选先导化合物。进一步评估显示，26h 具有优异的药代动力学性质，并在包括结肠癌 HCT-116 模型和淋巴瘤 Ramos 模型在内的多种小鼠癌症模型中表现出剂量依赖性疗效。基于其良好的药学和药理学特性，26h (SB1317/TG02) 进入研发阶段，目前正在白血病患者中进行 I 期临床试验。[1]

C23H24N4O

372.46

372.195

C, 74.17; H, 6.49; N, 15.04; O, 4.30

937270-47-8

(E/Z)-Zotiraciclib hydrochloride;1321626-25-8;Zotiraciclib;1204918-72-8; 1354567-82-0 (HCl);1204918-73-9 (citrate); 937270-47-8;(E/Z)-Zotiraciclib; 937270-47-8

16739650

Off-white to light yellow solid powder

1.1±0.1 g/cm3

577.1±60.0 °C at 760 mmHg

302.8±32.9 °C

0.0±1.6 mmHg at 25°C

1.577

4.76

50.28

1

5

0

28

499

0

CN1C/C=C/CCOC2=CC=CC(=C2)C3=NC(=NC=C3)NC4=CC=CC(=C4)C1

VXBAJLGYBMTJCY-NSCUHMNNSA-N

InChI=1S/C23H24N4O/c1-27-13-3-2-4-14-28-21-10-6-8-19(16-21)22-11-12-24-23(26-22)25-20-9-5-7-18(15-20)17-27/h2-3,5-12,15-16H,4,13-14,17H2,1H3,(H,24,25,26)/b3-2+

(16E)-14-methyl-20-oxa-5,7,14,27-tetrazatetracyclo[19.3.1.12,6.18,12]heptacosa-1(25),2(27),3,5,8,10,12(26),16,21,23-decaene

(E/Z)-Zotiraciclib;(E/Z)-TG02; (E/Z)-SB1317; (E/Z)-TG-02; (E/Z)-SB-1317;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 26.5 mg/mL (71.15 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.58 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.58 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.58 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。