Gwt1 enzyme

Fosmanogepix (APX001) 的最低有效剂量为 0.008-0.25 μg/ml，可在 40-72 小时内抑制烟曲霉、白色念珠菌、新型梭菌和格特梭菌的生长[1]。

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隐球菌性脑膜炎(CM)，主要由隐球菌引起的新生，是一致致命的，如果不治疗。治疗选择有限，特别是在资源贫乏的地理区域，尽管有目前的治疗方法，死亡率仍然很高。在这里，我们评估了几种化合物的体外和体内活性，包括APX001A及其前药APX001，目前正在临床开发用于治疗侵袭性真菌感染。这些化合物靶向真菌中糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定细胞壁甘露蛋白定位所需的保守Gwt1酶。Gwt1抑制剂对新生C.和C. gatii的MIC值较低，在0.004 ~ 0.5 μg/ml之间。APX001A和APX2020与氟康唑表现出体外协同作用(分数抑制浓度指数，两者均为0.37)。[1]

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APX001A抑制烟曲霉生长，最低有效浓度为0.03 μg/ml。[2]

Fosmanogepix (APX001)（390 mg/kg，口服，每日 3 次）可降低瑞典隐球菌脑膜炎 (CM) 模型的负担 [1]。 Fosmanogepix (APX001)（100 毫克/公斤）

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在CM模型中，APX001和氟康唑单独降低脑组织真菌负荷(分别为0.78和1.04 log10 CFU/g)，而联合使用可减少3.52 log10 CFU/g脑组织。另一种Gwt1抑制剂前药APX2096也观察到通过减少脑和肺组织真菌负荷来衡量的疗效，其中真菌负荷的剂量依赖性减少范围为5.91至1.79 log10 CFU/g肺组织和7.00至0.92 log10 CFU/g脑组织，这表明在较高剂量下肺和脑组织几乎完全或完全消毒。这些数据支持这类新型抗真菌药物治疗CM的进一步临床评价。[1]

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使用50 mg/kg的1-氨基苯并三唑(ABT)，一种细胞色素P450酶的自杀抑制剂，使APX001A暴露(时间-浓度曲线下面积[AUC])增加16至18倍，并将血清半衰期从1至9小时延长，更接近于模拟人类药代动力学。我们比较了APX001(联合ABT)与泊沙康唑治疗小鼠IPA的疗效。与安慰剂相比，每天一次78 mg/kg、每天两次78 mg/kg或104 mg/kg QD的APX001治疗小鼠显著提高了中位生存时间，延长了感染后第21天的总生存期。此外，通过组织病理学检查，与未治疗的对照组相比，施用APX001导致肺部真菌负荷显著降低(4.2至7.6 log10分生孢子当量/g组织)，并解决了感染。观察到的生存和组织清除率与临床相关泊沙康唑剂量相当。这些结果保证了APX001作为一种广谱、一流的侵袭性真菌感染治疗药物的继续发展。[2]

抗真菌药敏试验。[1]
为了确定APX001A类似物的抑菌活性，根据临床与实验室标准协会(CLSI)指南M27-A3酵母和M38-A2霉菌进行肉汤微稀释药敏试验。APX001A和类似物首先在DMSO中稀释，得到中间稀释度。在微滴板中进一步稀释，最终浓度为2至0.002 μg/ml。在无药对照孔中加入DMSO 1微升。在摇板机上搅拌10 min, 35℃孵育40 ~ 48 h(白色念珠菌、烟曲霉)，72 h(新生念珠菌)。与对照组相比，导致真菌生长减少50%的最小浓度(借助阅读镜确定)被确定为白色念珠菌和新生念珠菌的MIC。与DMSO对照孔中菌丝生长相比，导致菌丝缩短的最小浓度被确定为烟曲霉的最小有效浓度(MEC)(与棘白菌素相同)。APX001A(以前的E1210)的MIC和MEC端点分别用于酵母和霉菌，前面已经描述过。对于隐球菌的协同作用研究，APX001A和APX2020的MIC值在50%的抑制下读取。

为了确定APX001A类似物的抑菌活性，按照CLSI指南M38-A2对霉菌进行肉汤微稀释药敏试验。APX001A首先用二甲亚砜(DMSO)稀释，得到中间稀释度。在微滴板中进一步稀释，最终浓度为0.002至2 μg/ml。在“无药”对照孔中加入1 μl DMSO。在平板振动筛上混合10 min，平板在35℃下孵育40 ~ 48 h。与DMSO对照孔中菌丝生长相比，导致菌丝缩短的最小浓度被确定为烟曲霉的MEC(与棘白菌素相同)。类似的方法被用来确定ABT对烟曲霉生长的影响，但由于ABT是一种水溶性分子，所以没有使用DMSO。在一项研究中，ABT浓度范围为0.016 ~ 16 μg/ml，在后续研究中，ABT浓度范围为0.25 ~ 250 μg/ml。APX001A(以前的E1210)的MIC和MEC端点分别用于酵母和霉菌，前面已经描述过。采用标准棋盘法评价ABT与APX001A对烟曲霉MYA3626的协同作用(APX001A浓度范围为0.0005 ~ 0.125 μg/ml;ABT浓度范围为0.016 ~ 16 μg/ml)。使用MEC值读取协同试验的抑制终点，作为评估APX001A抗霉菌活性的读数。[2]

动物/疾病模型： CD-1 小鼠 [1]
剂量： 100 mg/kg
给药途径： 腹腔注射 (ip)
实验结果： 活性成分 APX001A 的半衰期从 1.3 小时延长至 8.8 小时，曲线下面积 (AUC) 增加了 9 倍。

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药代动力学分析。[1]
在健康雄性 CD-1 小鼠中，分别腹腔注射或口服 26 mg/kg 的前药 APX001、APX2096、APX2097 和 APX2104，进行单剂量药代动力学实验。在半数组中，小鼠在给予前药前2小时单次口服100 mg/kg ABT。分别于给药后0.083、0.5、2、4、8和24小时采集血浆样本（每个时间点n=3）。曲线下面积（AUC）的计算方法为从零时点到最后一次可测得浓度的时间点。采用液相色谱-串联质谱法测定血浆中活性代谢物（APX001A、APX2039、APX2020和APX2041）的浓度。使用Phoenix WinNonlin（v7.0）软件和非房室模型确定药代动力学参数。浓度低于定量限（0.5或1 ng/ml）的样本不用于平均值的计算。

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IPA模型。[2]
IPA模型的构建方法如前所述。简而言之，将免疫抑制小鼠置于吸入室中，用压缩空气驱动的小颗粒雾化器将12 ml浓度为1 × 10⁹ ml的烟曲霉分生孢子悬液雾化吸入。所有实验均采用1小时的标准暴露时间。感染后立即处死部分小鼠，取出肺组织进行定量培养。在感染前2天和感染后第3天，使用200 mg/kg环磷酰胺和500 mg/kg醋酸可的松的方案使小鼠中性粒细胞减少。为预防细菌感染，从第-3天到第0天，在饮用水中添加拜有利（50 μg/ml恩诺沙星；拜耳公司），给小鼠饮用。第0天，用头孢他啶（5 μg/剂/0.2 ml）替代拜有利，并从第0天到第8天每天皮下注射给药。在给予APX001前2小时，口服给予小鼠50 mg/kg ABT，持续7天。口服给予泊沙康唑（20 mg/kg，每日一次；或30 mg/kg，每日两次），持续7天。监测小鼠存活情况至第21天。小鼠可自由饮水和食用标准实验室饲料。所有药物治疗均在感染后16小时开始，并连续8天通过灌胃给药。

分析AUC值与每克组织中log10 CFU数变化的关系。在疗效模型中评估的三种化合物对感染菌株（新型隐球菌H99）的MIC值相差8至32倍：APX001A为0.25 μg/ml；APX2020为0.031 μg/ml；APX2039为0.008 μg/ml（表1）。表3的数据显示，腹腔注射（加ABT）后的AUC值范围为24.3至97.3 μg·h/ml，相差4倍。为了解 AUC 与 MIC 差异的影响，我们评估了三个实验中组织中 log10 CFU/g 数的变化幅度。[1]
三个实验中 APX001（无论是否联合 ABT）的 AUC 值范围为 7.0 μg·h/ml（7.5 mg/kg APX001 QD 联合 ABT）至 196.3 μg·h/ml（390 mg/kg TID）。当 AUC 为 196.3 μg·h/ml 时，观察到肺部菌负荷有轻微但显著的降低（1.5 log10 CFU/g）。较低的 AUC 值无效。APX2097 的 AUC 值范围为 10.0 至 116.4 μg·h/ml，APX2096 的 AUC 值范围为 27 至 224.3 μg·h/ml。我们比较了三种化合物在AUC值约为80 µg·h/ml的剂量下的疗效。在ABT存在的情况下，20 mg/kg APX2096、60 mg/kg APX2097和80 mg/kg APX001的剂量分别产生了非常相似的AUC值，分别为74.8、82.1和79.4 μg·h/ml。然而，在脑组织中，菌落形成单位（CFU）分别降低了2.95、1.45和0.85 log10 CFU/g；在肺组织中，菌落形成单位分别降低了3.69、1.55和0.9 log10 CFU/g。因此，尽管这三种化合物的AUC值相同，但MIC值越低（分别为0.008 μg/ml、0.031 μg/ml和0.25 μg/ml），疗效越好，这表明微生物活性的提高是疗效提高的主要原因。[1]

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口服26 mg/kg前药APX001（相当于20 mg/kg活性部分APX001A，转换因子为1.3，以考虑甲基磷酸基团）后，比较了APX001A的药代动力学，并比较了在APX001给药前2小时给予ABT和不给予ABT两种情况下的药代动力学。ABT的剂量分别为每日一次（QD）25、50和100 mg/kg，以及每日两次（BID）50 mg/kg。与我们之前的研究结果 (17) 一致，在雄性 CD-1 小鼠中，当前药 APX001 的剂量为 26 mg/kg 时，每日一次 (QD) 给予 100 mg/kg ABT 可使 APX001A 的平均 AUClast（血浆浓度-时间曲线下面积，从零时点到最后一次可测浓度的时间点）增加 15 倍（表 1）。有趣的是，当 ABT 的剂量为每日一次 (QD) 或每日两次 (BID) 时，AUClast 的增加仍然得以维持（与未给予 ABT 的对照组相比，分别增加 16.3 倍或 15 倍，所有 ABT 比较方案的 P > 0.62）（表 1），这表明较低剂量的 ABT 与 100 mg/kg 剂量的 ABT 在提高 APX001A AUClast 方面具有相同的疗效。相比之下，每日一次（QD）给予25 mg/kg剂量的ABT导致APX001A的AUC值显著低于每日一次（QD）给予50 mg/kg剂量的ABT（P = 0.02），尽管与未给予ABT的对照组相比，AUC值增加了12.8倍（P = 0.0002）（表1）[2]。由于在疗效模型中可能使用更高剂量的APX001，因此了解使用ABT时AUC值的线性关系至关重要。因此，在不同剂量ABT存在的情况下，评估了给予52 mg/kg APX001前药（相当于40 mg/kg活性成分APX001A）后APX001A的药代动力学。表 1 中的数据显示，以 50 mg/kg BID 和 50 mg/kg QD 给药 ABT 导致 APX001A AUC 值相似（分别为 92.41 ± 7.70 和 94.29 ± 12.43），与未给予 ABT 的对照组（5.30 ± 0.98）相比，AUC 增加了 17.4 至 17.8 倍（P < 0.0003）。相比之下，每日一次（QD）25 mg/kg ABT 剂量组的 APX001A AUC 值较低（52.00 ± 35.46），与未接受 ABT 治疗的对照组相比，AUC 值增加了 9.8 倍（表 1）。[1]
给予 52 mg/kg APX001 联合 50 mg/kg ABT（每日一次或每日两次）后获得的 AUC 值比给予 26 mg/kg APX001 时获得的 AUC 值高约 2 倍（P > 0.14），这与剂量线性关系一致，至少在该剂量范围内如此。在后续的烟曲霉小鼠模型实验中，我们选择使用最低有效剂量的 ABT（每日一次，50 mg/kg），并联合口服 APX001。[2]

[1]. In Vitro and In Vivo Evaluation of APX001A/APX001 and Other Gwt1 Inhibitors against Cryptococcus. Antimicrob Agents Chemother. 2018 Jul 27;62(8). pii: e00523-18.

[2]. APX001 Is Effective in the Treatment of Murine Invasive Pulmonary Aspergillosis. Antimicrob Agents Chemother. 2019 Jan 29;63(2). pii: e01713-18.

[3]. In Vitro and In Vivo Evaluation of APX001A/APX001 and Other Gwt1 Inhibitors against Cryptococcus. Antimicrob Agents Chemother. 2018 Jul 27;62(8):e00523-18.

Fosmanogepix 正在进行临床试验 NCT03604705（APX001 在非中性粒细胞减少症念珠菌血症患者中的疗效和安全性研究）。
Fosmanogepix 是一种口服小分子 Gwt1 真菌酶抑制剂，具有潜在的抗真菌活性。Fosmanogepix 是一种 N-膦酰氧甲基前药，给药后会被全身碱性磷酸酶快速且完全代谢为活性部分 APX001A (E1210)。该活性前药靶向 Gwt1，Gwt1 是一种高度保守的肌醇酰化酶，催化糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 锚定生物合成途径中的关键步骤。抑制 Gwt1 可阻止细胞壁甘露糖蛋白的定位，从而破坏细胞壁完整性，抑制生物膜形成、芽管形成和真菌生长。

C22H21N4O6P

468.3991

468.119

C, 56.41; H, 4.52; N, 11.96; O, 20.49; P, 6.61

2091769-17-2

Manogepix;936339-60-5

44123754

White to yellow solid powder

1.6

148

2

9

9

33

644

0

P(=O)([O-])(O[H])OC([H])([H])[N+]1=C([H])C([H])=C([H])C(=C1N([H])[H])C1=C([H])C(C([H])([H])C2C([H])=C([H])C(C([H])([H])OC3=C([H])C([H])=C([H])C([H])=N3)=C([H])C=2[H])=NO1

JQONJQKKVAHONF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H21N4O6P/c23-22-19(4-3-11-26(22)15-31-33(27,28)29)20-13-18(25-32-20)12-16-6-8-17(9-7-16)14-30-21-5-1-2-10-24-21/h1-11,13,23H,12,14-15H2,(H2,27,28,29)

[2-amino-3-[3-[[4-(pyridin-2-yloxymethyl)phenyl]methyl]-1,2-oxazol-5-yl]pyridin-1-ium-1-yl]methyl hydrogen phosphate

Fosmanogepix; 2091769-17-2; APX001; Fosmanogepix [INN]; Fosmanogepix [USAN]; APX-001; 1XQ871489P; E1211;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~5 mg/mL (~10.67 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.34 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。