GPX4-IN-3   中文名称: GPX4-IN3

Compound 26a is a potent and selective ferroptosis inducer that targets glutathione peroxidase 4 (GPX4). It inhibits GPX4 activity, leading to the accumulation of lipid peroxides and subsequent ferroptotic cell death. At a concentration of 1.0 μM, 26a exhibits a GPX4 inhibitory activity of 71.7%, compared to 45.9% for the reference compound RSL-3. [1]

GPX4-IN-3 targets glutathione peroxidase 4 (GPX4), an essential antioxidant enzyme that protects cells from lipid peroxidation and ferroptotic cell death. GPX4 reduces lipid hydroperoxides to their corresponding alcohols, preventing the accumulation of toxic lipid peroxides that trigger ferroptosis. By selectively blocking GPX4 activity, GPX4-IN-3 promotes the accumulation of lipid hydroperoxides, triggering ferroptosis. This makes GPX4 a promising therapeutic target for cancer and other diseases.

GPX4-IN-3 (26a) 对 4T1、MCF-7、HT1080 和 HT1080（含 Fer-1）细胞的 IC50 值分别为 0.78 μM、6.9 μM、0.15 μM 和 4.73 μM [1]。GPX4-IN-3 (26a) 表现出显著的 GPX4 抑制活性，在 1.0 μM 浓度下抑制率高达 71.7%，而 RSL-3 的抑制率仅为 45.9% [1]。GPX4-IN-3 (26a) 具有良好的选择性，可显著增加脂质过氧化物 (LPO) 水平，并有效促进铁死亡 [1]。GPX4-IN-3 (26a) 通过抑制 GPX4 活性，更可能通过积累细胞内超氧化物来诱导铁死亡 [1]。在 4T1 细胞中，GPX4-IN-3 (26a) 可显著提高铁死亡抑制剂 ferrostatin-1 (fer-1) 的水平并逆转活性氧 (ROS) 水平 [1]。

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26a 对多种癌细胞系表现出显著的细胞毒性，对 4T1（小鼠乳腺癌）细胞的 IC50 值为 0.78 ± 0.01 μM，对 MCF-7（人乳腺腺癌）细胞的 IC50 值为 6.90 ± 0.21 μM，对 HT1080（人纤维肉瘤）细胞的 IC50 值为 0.15 ± 0.01 μM。[1]
通过检测在铁死亡抑制剂 ferrostatin-1 (fer-1, 0.5 μM) 存在下细胞毒性的逆转情况，评估了 26a 的铁死亡选择性。在HT1080细胞中，IC50值从0.15 μM（单独使用）增加到4.73 μM（与fer-1联用），选择性值（比值）为31.5，显著高于RSL-3（选择性值为3.1）。[1]
26a有效抑制细胞内GPX4酶活性。在用5.0 μM 26a处理4T1细胞6小时后，GPX4活性降至11.8%，而RSL-3处理的细胞GPX4活性为41.8%。[1]
Western blot分析显示，26a诱导细胞内GPX4蛋白表达降低，与RSL-3类似。[1]
26a诱导脂质过氧化物（LPO）显著积累。用 2.5 μM 26a 处理 4T1 细胞 6 小时后，丙二醛 (MDA) 水平（脂质过氧化物 (LPO) 的代谢产物）显著高于未处理的细胞和 RSL-3 处理的细胞。共聚焦显微镜和流式细胞术分析的 C11-BODIPY 染色证实了 LPO 的显著增加，而 fer-1 的联合处理逆转了这一增加。[1] 26a 还增加了 4T1 细胞中总活性氧 (ROS) 的水平，这通过 DCFH-DA 染色和流式细胞术测定，而 fer-1 也逆转了这一效应。 [1]
过氧化物清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC，5 mM）和谷胱甘肽（GSH，5 mM）显著逆转了化合物26a在4T1细胞中的细胞毒性，进一步证实其作用机制涉及氧化应激和铁死亡。[1]
MCF-7细胞中GSH的水平是4T1细胞的两倍，这可能解释了化合物26a在这些细胞系中细胞毒性的差异。[1]
高效液相色谱（HPLC）分析表明，化合物26a在谷胱甘肽存在下保持稳定。 [1] 透射电镜 (TEM) 形态学分析显示，经 5.0 μM 26a 处理的 4T1 细胞表现出典型的铁死亡特征，包括线粒体体积缩小、嵴减少、线粒体外膜破裂以及膜密度增加。[1] 体外实验表明，GPX4-IN-3 (26a) 具有强效的 GPX4 抑制活性，在 1 μM 浓度下抑制率达 71.7%，高于 RSL-3 的 45.9%。它对 4T1 乳腺癌细胞 (IC50 = 0.78 μM)、MCF-7 乳腺癌细胞 (IC50 = 6.9 μM) 和 HT-1080 纤维肉瘤细胞 (IC50 = 0.15 μM) 均具有细胞毒活性。在用Fer-1（一种铁死亡抑制剂）处理的HT1080细胞中，IC50值升高至4.73 μM，证实了铁死亡介导的细胞毒性。该化合物显著升高4T1细胞中的脂质过氧化物（LPO）水平和活性氧（ROS）水平，而Ferrostatin-1可逆转这些作用。

在小鼠4T1乳腺癌异种移植模型中，化合物26a以剂量依赖的方式显著抑制肿瘤生长。每两天静脉注射一次，共注射五次，15 mg/kg剂量组的肿瘤生长抑制率（TGI）为33.2%，30 mg/kg剂量组的TGI为55.1%。[1] 与对照组相比，26a治疗组的肿瘤重量显著降低，这与肿瘤体积测量结果一致。[1] 在治疗期间，26a治疗组的体重与对照组相比没有显著变化，表明其具有良好的耐受性。[1] 体内实验表明，GPX4-IN-3 (26a) 具有强大的抗肿瘤功效和良好的生物安全性。[1]尽管公开资料中关于体内研究的具体细节有限，但该化合物已显示出治疗某些需要诱导铁死亡的癌症的潜力。该化合物选择性诱导铁死亡的能力使其成为一种很有前景的癌症治疗候选药物。需要开展进一步的研究来全面评估其体内疗效和安全性。

GPX4抑制活性测定：通过测定NADPH水平来确定化合物对GPX4活性的影响。收集4T1细胞并裂解。将细胞上清液与终浓度为1.0 μM的测试化合物（例如26a或RSL-3）孵育1小时。然后使用商业化的GPX4活性测定试剂盒，按照制造商的说明书评估GPX4活性。[1]

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GPX4-IN-3的体外GPX4抑制测定使用重组GPX4酶和脂质氢过氧化物底物。通过监测底物的还原来测定酶活性，通常使用偶联测定或直接检测产物的生成。将不同浓度的化合物与酶孵育，并根据剂量反应曲线计算IC50值或抑制百分比。通过证明该化合物不抑制其他谷胱甘肽过氧化物酶，证实了该化合物对 GPX4 的特异性。

细胞活力检测（MTT法）：将细胞（4T1、MCF-7、HT1080）以5 × 10³ 个细胞/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时。然后用一系列浓度的测试化合物处理细胞48小时。随后，向每个孔中加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL）。孵育4小时后，移除培养基，并加入200 μL DMSO溶解甲臜晶体。使用酶标仪记录490 nm处的吸光度。IC50值由剂量反应曲线计算得出。[1]
铁死亡选择性检测：将HT1080细胞接种，并用不同浓度的测试化合物单独处理，或与终浓度为0.5 μM的铁死亡抑制剂ferrostatin-1 (fer-1)联合处理。 48 小时后，采用 MTT 法检测细胞活力。测定化合物单独作用和化合物与 Fer-1 联用时的 IC50 值，并将 IC50（与 Fer-1 联用）与 IC50（单独作用）的比值计算为选择性值。[1]
细胞内 GPX4 活性检测：将 4T1 细胞以 5 × 10⁵ 个细胞/孔的密度接种于 6 孔板中，培养 24 小时。然后用 5.0 μM 的 26a 或 RSL-3 处理细胞 6 小时。用 PBS 洗涤细胞，收集细胞，并在冰上裂解 10 分钟。4°C 离心后，收集上清液，并根据制造商的说明使用 GPX4 活性检测试剂盒测定 GPX4 活性。 [1]
蛋白质印迹分析：将4T1细胞（2 × 10⁶ 个细胞/孔）用指定浓度的26a或RSL-3处理8小时。收集细胞，并用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解。将20 μg裂解液上样至12% SDS-PAGE凝胶的每个泳道，然后转移至PVDF膜。用抗GPX4（1:500稀释）和β-肌动蛋白（1:1000稀释）的一抗进行膜孵育。[1]
细胞内ROS测定：将4T1细胞以5 × 10⁴ 个细胞/孔的密度接种于12孔板中，培养12小时。用2.5 μM的26a或RSL-3处理细胞6小时。移除培养基后，将细胞与 DCFH-DA 探针 (10 μM) 孵育 20 分钟。洗涤细胞，收集细胞，并通过流式细胞术进行分析。对于共聚焦显微镜观察，将细胞接种于玻璃盖玻片上，按上述方法处理，用 4% 多聚甲醛固定，用 DAPI 染色，然后进行观察。[1]
细胞内 LPO 测定：将 4T1 细胞以 5 × 10⁴ 个细胞/孔的密度接种于 12 孔板中，培养 24 小时。用 2.5 μM 26a、2.5 μM RSL-3 或 2.5 μM 26a + 0.5 μM fer-1 处理细胞 6 小时。然后用 C11-BODIPY581/591 探针 (1.0 μM) 染色 20 分钟，收集细胞，并通过流式细胞术进行分析。对于共聚焦显微镜观察，将细胞接种于玻璃盖玻片上，按上述方法处理，用 C11-BODIPY581/591 染色，用 4% 多聚甲醛固定，用 DAPI 染色，然后进行观察。[1]
MDA 检测：将 4T1 细胞以 5 × 10⁶ 个细胞/皿的密度接种于 5 cm 培养皿中，培养 24 小时，然后用 2.5 μM 26a 或 RSL-3 处理 6 小时。裂解细胞，并使用 MDA 检测试剂盒测定 MDA 含量。[1]
透射电镜 (TEM) 细胞形态分析：将 4T1 细胞以 5 × 10⁶ 个细胞/皿的密度接种于 10 cm 培养皿中，并用 5.0 μM 26a 处理 6 小时。用 2.5% 戊二醛固定细胞，收集细胞，并进行透射电镜处理。切片在观察前用醋酸铀和柠檬酸铅染色。[1]

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GPX4-IN-3 的细胞活性检测在包括 4T1、MCF-7 和 HT-1080 细胞在内的癌细胞系中进行。细胞用不同浓度的化合物处理 48-72 小时。使用 MTT 或 CellTiter-Glo 等标准方法检测细胞活力。通过检测脂质过氧化物水平、活性氧 (ROS) 以及使用铁死亡抑制剂（如 Ferrostatin-1 或 liproxstatin-1）来确认铁死亡。IC50 值根据剂量反应曲线计算。

动物/疾病模型：小鼠4T1异种移植模型[1]。
剂量：15和30 mg/kg。
给药途径：静脉注射，每两天一次，共五次。
实验结果：在15和30 mg/kg剂量下，肿瘤生长抑制率（TGI）分别为33.2%和55.1%，均能显著抑制肿瘤生长。

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动物和肿瘤模型：将100 μL 4T1细胞悬液（5 × 10⁴ 个细胞/mL）皮下注射到BALB/c小鼠（18-22 g）体内，建立异种移植模型。 [1]
给药：当肿瘤体积达到约 100 mm³ 时，将小鼠随机分为三组（每组 n=5）：生理盐水对照组、低剂量 26a 组（15 mg/kg）和高剂量 26a 组（30 mg/kg）。每两天静脉注射一次 26a，共注射五次。每两天记录一次肿瘤体积和体重。肿瘤体积的计算公式为：V = (长 × 宽²)/2。肿瘤生长抑制率 (TGI) 的计算公式为：[1 - RTV (治疗组)/RTV (对照组)] × 100%。20 天后，处死小鼠，收集肿瘤，称重并拍照。 [1]
安全性评价：将健康的BALB/c小鼠分为三组，分别给予生理盐水、15 mg/kg的26a或30 mg/kg的26a，每两天给药一次，共给药三次。采集血样，分离血清，检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、血尿素氮（BUN）和肌酐水平，作为肝肾功能的指标。取出主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏），用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，并用苏木精-伊红（H&E）染色进行组织学检查。[1]

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GPX4-IN-3的体内研究通常采用肿瘤异种移植小鼠模型。该化合物将通过腹腔注射或静脉注射给药，剂量根据药代动力学研究确定。疗效将通过测量肿瘤生长抑制情况来评估，并评估肿瘤组织中的药效学标志物，例如脂质过氧化物水平和铁死亡标志物。然而，现有文献中并未详细描述GPX4-IN-3的具体体内实验方案。

公开资料中关于GPX4-IN-3的药代动力学数据报道较少。该化合物分子量为530.04 g/mol，在DMSO中的溶解度为67.5 mg/mL (127.35 mM)。作为一种小分子GPX4抑制剂，预计其生物利用度中等。目前文献中尚无关于该研究化合物的详细药代动力学参数，例如半衰期、清除率和分布容积。

在4T1异种移植疗效研究中，与对照组相比，26a治疗组未观察到明显的体重下降，表明在测试剂量（15和30 mg/kg，每两天一次，共五次）下具有良好的体内耐受性。[1]
肝功能（ALT、AST）和肾功能（BUN、肌酐）的生化分析显示，26a治疗组与对照组之间无显著差异，表明在测试剂量下未观察到明显的肝毒性或肾毒性。[1]
对26a治疗小鼠的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏）进行H&E染色，结果显示与对照组织相比无明显的形态学差异，进一步支持了26a的安全性。[1]

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公开资料中关于GPX4-IN-3毒性的数据有限。该化合物在体内研究中显示出良好的生物安全性。与所有研究用化合物一样，GPX4-IN-3 仅供研究使用，不得用于人体治疗。完整的毒性评估需要进行标准体外细胞毒性试验（针对正常细胞系）和体内耐受性研究。目前尚未有具体的毒性数据报告。

[1]. Discovery of a Potent Glutathione Peroxidase 4 Inhibitor as a Selective Ferroptosis Inducer. J Med Chem. 2021 Sep 23;64(18):13312-13326.

背景：化合物 26a 是通过基于 RSL-3 骨架跃迁策略的逐步结构优化发现的。它包含三个结构片段：吲哚乙酰胺、苯甲酸酯和氯乙酰胺，其中噁唑部分有助于提高其活性和选择性。[1] 作用机制：化合物 26a 通过抑制 GPX4（一种修复脂质过氧化物的关键抗氧化酶）诱导铁死亡。GPX4 的抑制会导致脂质过氧化物的积累、氧化应激，最终导致铁死亡。氯乙酰胺部分被认为是一种亲电基团，可与 GPX4 的催化硒代半胱氨酸残基相互作用。 [1]
选择性：26a与参考化合物RSL-3（选择性值为3.1）相比，表现出优异的铁死亡选择性（选择性值为31.5），使其成为研究铁死亡的宝贵工具。[1]
抗肿瘤活性：26a在4T1乳腺癌异种移植模型中显示出显著的体内抗肿瘤疗效，在30 mg/kg剂量下肿瘤生长抑制率达55.1%，且安全性良好。[1]
潜在应用：鉴于其高效且选择性的铁死亡诱导活性，26a有望成为一种有前景的癌症治疗先导化合物，尤其适用于对铁死亡敏感或对传统疗法耐药的肿瘤。 [1]

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GPX4-IN-3 (26a) 是一种强效的 GPX4 抑制剂，在 1 μM 浓度下可选择性地诱导铁死亡，抑制率达 71.7%。它对 4T1 (IC50 = 0.78 μM)、MCF-7 (IC50 = 6.9 μM) 和 HT-1080 (IC50 = 0.15 μM) 癌细胞均显示出细胞毒活性。该化合物可显著提高脂质过氧化物和活性氧 (ROS) 水平，并在体内表现出抗肿瘤活性。GPX4-IN-3 是研究癌症及其他疾病中氧化应激、脂质代谢和铁死亡的宝贵工具。

C29H24CLN3O3S

530.03716468811

529.122

2761004-85-5

162395709

White to off-white solid powder

6

104

1

5

9

37

759

0

ClCC(N(C1C=CC(C2=CN=CO2)=CC=1)C(C(NCCC1C=CC=CC=1)=O)C1=CSC2C=CC=CC1=2)=O

ZLCPSXKEQBUXRJ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C29H24ClN3O3S/c30-16-27(34)33(22-12-10-21(11-13-22)25-17-31-19-36-25)28(24-18-37-26-9-5-4-8-23(24)26)29(35)32-15-14-20-6-2-1-3-7-20/h1-13,17-19,28H,14-16H2,(H,32,35)

2-(1-benzothiophen-3-yl)-2-[N-(2-chloroacetyl)-4-(1,3-oxazol-5-yl)anilino]-N-(2-phenylethyl)acetamide

GPX4-IN-3; 2761004-85-5; 2-(1-benzothiophen-3-yl)-2-[N-(2-chloroacetyl)-4-(1,3-oxazol-5-yl)anilino]-N-(2-phenylethyl)acetamide; NSC-835419; GPX4 Inhibitor 26a;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 67.5 mg/mL (127.35 mM)

配方 1 中的溶解度: 6.75 mg/mL (12.73 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 67.5 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 6.75 mg/mL (12.73 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 67.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。