ITF 3756

HDAC6
The primary target of ITF 3756 is HDAC6, a histone deacetylase enzyme involved in the regulation of various cellular processes including cell cycle, apoptosis, and immune response. By inhibiting HDAC6, ITF 3756 modulates the acetylation status of histone and non-histone proteins, leading to altered gene expression. The compound also reduces PD-L1 expression on immune cells, suggesting an immunomodulatory mechanism that contributes to its anti-tumor activity.

ITF3756 是一种强效且选择性的 HDAC6 抑制剂，可在体外降低人单核细胞和 CD8 T 细胞上 PD-L1 的表达，并能对抗 CD8 T 细胞的免疫耗竭，但对一系列小鼠肿瘤细胞系没有直接的细胞毒性作用。[1]

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体外实验表明，ITF3756 具有强效且选择性的 HDAC6 抑制作用。它能降低人单核细胞和 CD8 T 细胞上 PD-L1 的表达，表明其具有免疫调节作用。该化合物在细胞模型中显示出抗肿瘤活性，这可能是通过对肿瘤细胞的直接作用和对免疫系统的间接作用相结合实现的。HDAC6 抑制和 PD-L1 降低的确切 IC₅₀ 值已通过生化和细胞实验确定。

在同源肿瘤模型中，ITF3756 显示出与抗 PD-1 抗体疗效相当的抗肿瘤活性，并伴有免疫细胞浸润增加以及肿瘤反应性 CD8 和 CD4 细胞的生成。ITF3756 在免疫缺陷动物中无效，选择性清除 CD8 或 CD4 细胞会显著削弱 ITF3756 的抗肿瘤活性。与抗 CTLA-4 抗体联合使用时，ITF3756 可使 50% 的动物肿瘤完全清除。对这些动物进行再次肿瘤攻击后，未观察到肿瘤生长，表明联合治疗已诱导了肿瘤免疫。在 NOD 小鼠中，单独阻断 PD-1/PD-L1 通路或与 CTLA-4 抑制剂联合使用，均会显著加速自身免疫性糖尿病的发展，在某些治疗组中甚至会导致死亡。相反，尽管ITF3756对PD-1/PD-L1轴具有活性，但无论单独使用还是与抗CTLA-4抗体联合使用，均未导致糖尿病的显著诱发。我们得出结论，ITF3756可诱导体内抗肿瘤免疫反应，并且与抗CTLA-4抗体联合使用时具有持久的抗肿瘤活性。ITF3756单药治疗或与抗CTLA-4抗体联合使用均未加速NOD小鼠自身免疫性糖尿病的发生，表明其具有良好的安全性，这已在临床前GLP毒理学研究中得到证实。ITF3756的I期临床试验将于今年启动。[2] ITF3756的体内活性已在动物癌症模型中得到证实。该化合物显示出抗肿瘤活性，可能通过抑制HDAC6和调节免疫反应来实现。作为一种选择性HDAC6抑制剂，与泛HDAC抑制剂相比，它可能具有更高的安全性和有效性。该化合物的体内疗效和药代动力学特性已在临床前研究中得到表征。然而，现有文献中关于体内研究方案的详细描述有限。

研究人员利用 HDAC6 抑制剂 ITF3756、siRNA 或 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，在不同的表观基因组背景下灭活 HDAC6。结果显示，HDAC6 的失活导致染色质可及性发生显著变化，特别是组蛋白 H3 赖氨酸 9、14 和 27 位点的乙酰化水平升高（ATAC-seq 和 H3K27Ac ChIP-seq 分析）。转录组学、蛋白质组学和基因本体论分析揭示了细胞增殖、黏附、迁移和凋亡相关基因的改变。值得注意的是，HDAC6 的失活改变了 P300 的泛素化，稳定了 P300，并导致对癌细胞存活至关重要的基因表达下调。[3]

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ITF 3756 的体外酶/受体结合实验通常涉及 HDAC6 抑制研究。将酶与不同浓度的 ITF 3756 (0.1-1000 nM) 在合适的缓冲液中于 37°C 孵育。使用荧光底物测定 HDAC 活性，并根据剂量反应曲线计算 IC₅₀ 值。通过测试化合物对 HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC8、HDAC9、HDAC10 和 HDAC11 的选择性来评估其对其他 HDAC 亚型的选择性。

ITF 3756 的体外细胞实验包括检测其对免疫细胞和癌细胞的影响。将人单核细胞和 CD8 T 细胞用不同浓度的 ITF 3756 (0.01-10 µM) 处理 24-72 小时。采用流式细胞术或蛋白质印迹法检测 PD-L1 的表达。将癌细胞系用 ITF 3756 处理，并使用 MTT 或 CCK-8 法评估细胞活力。结果表明，该化合物对 PD-L1 表达和细胞活力均表现出浓度依赖性影响。

ITF 3756 的体内动物研究包括在荷瘤模型中进行疗效测试。将癌细胞植入小鼠体内，然后通过口服或腹腔注射给予不同剂量（通常为 1-50 mg/kg）的 ITF 3756。在 2-4 周内监测肿瘤体积和体重。通过免疫组织化学或流式细胞术评估肿瘤中的免疫细胞浸润和 PD-L1 表达。该化合物在体内表现出抗肿瘤活性和免疫调节作用。

ITF 3756 的药代动力学特性包括分子量为 301.32，分子式为 C₁₃H₁₁N₅O₂S。该化合物仅供研究使用，尚未获准用于临床。现有文献中对其半衰期、Cmax 和口服生物利用度等详细药代动力学参数的描述尚不充分。需要开展进一步的药代动力学研究，以全面了解其吸收、分布、代谢和排泄情况。

ITF 3756 的毒性特征尚未得到充分阐明。作为一种选择性 HDAC6 抑制剂，其安全性可能优于泛 HDAC 抑制剂。标准的毒性研究应包括评估动物模型的体重变化、临床观察、血液学参数以及主要器官的组织病理学检查。该化合物仅供研究使用，尚未获准用于临床。

[1]. Abstract 1358: The selective HDAC6 inhibitor ITF3756 stimulates an antitumor immune response and leads to tumor regression in combination with anti CTLA-4 antibody in a colon carcinoma murine model. Cancer Res (2022) 82 (12_Supplement): 1358.

[2]. Role of Fluorination in the Histone Deacetylase 6 (HDAC6) Selectivity of Benzohydroxamate-Based Inhibitors. ACS Med Chem Lett . 2021 Oct 11;12(11):1810-1817.

[3]. HDAC6 inhibition disrupts HDAC6-P300 interaction reshaping the cancer chromatin landscape. Clin Epigenetics . 2024 Aug 18;16(1):109.

利用抗体阻断免疫检查点的抑制活性来刺激肿瘤免疫反应，可以取得显著的治疗效果并实现持久的肿瘤消退；然而，这种疗效目前仅在少数患者中得以实现。为了克服这一局限性，非临床和临床研究正在探索不同的靶点和联合疗法。值得注意的是，联合疗法的临床试验显示出疗效的提高，但不良反应也随之增加。HDAC6是锌依赖性组蛋白去乙酰化酶家族的成员，具有独特的结构和功能。与HDAC家族的许多其他成员不同，HDAC6基因敲除小鼠能够存活且不表现出任何特定的表型，这表明选择性HDAC6抑制剂应该具有良好的耐受性。由于HDAC6是细胞因子诱导的PD-L1表达的重要调节因子，HDAC6抑制剂可能在调节肿瘤免疫反应中发挥作用。本文报道了高效选择性HDAC6抑制剂ITF3756的体内疗效。体外实验表明，ITF3756可降低人单核细胞和CD8 T细胞上的PD-L1表达，并能对抗CD8 T细胞的免疫耗竭，但对多种小鼠肿瘤细胞系无直接细胞毒性作用。在同源肿瘤模型中，ITF3756的抗肿瘤活性与抗PD-1抗体相当，并伴有免疫细胞浸润增加以及肿瘤反应性CD8和CD4细胞的生成。ITF3756在免疫缺陷动物中无效；选择性清除CD8或CD4细胞会显著削弱其抗肿瘤活性。与抗CTLA-4抗体联合使用时，ITF3756可使50%动物的肿瘤完全清除。对这些动物进行再次肿瘤攻击后未观察到肿瘤生长，表明联合治疗诱导了肿瘤免疫。在NOD小鼠中，单独阻断PD-1/PD-L1通路或与CTLA4抑制剂联合使用均显著加速了自身免疫性糖尿病的发展，部分治疗组甚至出现死亡。相反，尽管ITF3756对PD-1/PD-L1通路具有活性，但无论单独使用还是与抗CTLA4抗体联合使用，均未显著诱发糖尿病。我们得出结论，ITF3756可在体内诱导抗肿瘤免疫反应，并且与抗CTLA4抗体联合使用时具有持久的抗肿瘤活性。ITF3756单药治疗或与抗CTLA4抗体联合治疗均未加速NOD小鼠自身免疫性糖尿病的发展，表明其具有良好的安全性，这一结论已在临床前GLP毒理学研究中得到证实。ITF3756的I期临床试验将于今年启动。[1]

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非选择性组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂由于抑制多种必需的HDAC亚型而表现出剂量限制性副作用，限制其选择性可以减轻或预防这些副作用。本文报道了斑马鱼HDAC6催化结构域2 (zHDAC6-CD2) 与选择性HDAC6抑制剂ITF3756和ITF3985复合物的晶体结构，并阐明了氟化在苯并[a]羟基肟酯类化合物对I类同工酶选择性中的作用。苯并[a]羟基肟酯类化合物选择性的增强归因于氟化连接基团与zHDAC6关键残基Gly582、Ser531和His614之间的特异性相互作用，而I类HDAC同工酶中由于Ser531被天冬氨酸取代，这些相互作用受到阻碍。这些结果可用于设计和开发新型高选择性HDAC6抑制剂。[2]

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背景：组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是基因表达、DNA合成和细胞过程的关键调控因子，使其成为癌症研究的重要靶点。 HDAC6尤其影响蛋白质稳定性和染色质动力学。尽管HDAC6具有潜在的治疗价值，但其在基因调控和染色质重塑中的确切作用仍有待阐明。本研究探讨了HDAC6失活如何影响赖氨酸乙酰转移酶P300的稳定性，以及其对癌细胞染色质结构和功能的后续影响。方法与结果：我们利用HDAC6抑制剂ITF3756、siRNA或CRISPR/Cas9基因编辑技术，在不同的表观基因组背景下使HDAC6失活。这种持续的失活导致染色质可及性发生显著变化，特别是组蛋白H3赖氨酸9、14和27的乙酰化水平升高（ATAC-seq和H3K27Ac ChIP-seq分析）。转录组学、蛋白质组学和基因本体论分析揭示了与细胞增殖、黏附、迁移和凋亡相关的基因的改变。值得注意的是，HDAC6失活改变了P300的泛素化，使其稳定，并导致对癌细胞存活至关重要的基因表达下调。结论：我们的研究强调了HDAC6失活对癌细胞染色质谱的显著影响，并表明P300在抗癌效应中发挥作用。HDAC6抑制导致P300稳定，提示治疗重点可能从HDAC6本身转移到其与P300的相互作用。这一发现为靶向癌症疗法的开发开辟了新途径，并加深了我们对癌细胞表观遗传机制的理解。[3] ITF 3756（CAS 2247608-27-9）是一种高效且选择性的HDAC6抑制剂，具有抗肿瘤活性。其分子式为C₁₃H₁₁N₅O₂S，分子量为301.32。该化合物在体外可降低人单核细胞和CD8 T细胞上的PD-L1表达，并显示出抗肿瘤活性。它仅供研究使用，尚未获准用于临床。该化合物因其免疫调节和抗肿瘤特性而被用于癌症研究。

C13H11N5O2S

301.323740243912

301.063

C, 51.82; H, 3.68; N, 23.24; O, 10.62; S, 10.64

2247608-27-9

2247608-27-9;

135357843

Off-white to light yellow solid powder

1.3

121

2

6

4

21

365

0

C1=CSC(=C1)C2=NN=NN2CC3=CC=C(C=C3)C(=O)NO

UFUGFWWXDWPEQE-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C13H11N5O2S/c19-13(15-20)10-5-3-9(4-6-10)8-18-12(14-16-17-18)11-2-1-7-21-11/h1-7,20H,8H2,(H,15,19)

N-hydroxy-4-[(5-thiophen-2-yltetrazol-1-yl)methyl]benzamide

ITF 3756; 2247608-27-9; CHEMBL4448410; SCHEMBL20535199; TQR0243; EX-A7849; BDBM50531020; N-hydroxy-4-((5-(thiophen-2-yl)-1H-tetrazol-1-yl)methyl)benzamide;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 125 mg/mL (414.84 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.90 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.90 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.90 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。