JB170

Aurora A Kinase (AURKA). In MV4-11 cells, the half-maximal degradation concentration (DC₅₀) of JB170 for AURKA is 28 nM. In HEK293 cells, the half-maximal effective concentration (EC₅₀) for JB170 binding to AURKA, determined by BRET assay, is 193 nM. The dissociation constant (K_d) for JB170 binding to purified AURKA protein, measured by isothermal titration calorimetry (ITC), is 375 nM.
JB170 binds to CEREBLON with lower affinity, with a K_d of 6.88 μM as determined by ITC. However, its affinity for the binary complex of AURKA and CEREBLON is significantly enhanced, with a K_d of 183 nM. [1]
Aurora A (DC50 = 28 nM); Aurora A (Kd = 99 nM); Aurora A (EC50 = 193 nM);
Cereblon

JB170 exclusively targets Aurora kinase A (AURORA-A). Aurora A is a serine/threonine kinase that plays a critical role in mitotic spindle assembly, centrosome maturation, and chromosome segregation. By specifically inhibiting AURORA-A, JB170 disrupts mitosis and triggers apoptosis in cancer cells. It shows rapid depletion of AURORA-A at low concentrations.

JB170（1 μM；24-72 小时；MV4-11 细胞）通过介导 Aurora-A 的耗竭来降低癌细胞的存活率 [1]。JB170（0.01-10 μM；6 小时；MV4-11 细胞）可降低 Aurora-A 的水平 [1]。JB170（0.5 μM；12 小时；MV4-11 细胞）可抑制或延缓 S 期进程 [1]。JB170（0.5 μM；0-72 小时；MV4-11 细胞）特异性靶向 Aurora-A 以诱导细胞凋亡 [1]。JB170（0.1 μM；0-9 小时；IMR5 细胞）可快速耗竭 Aurora-A。与 AURORA-A 相比，JB170（0~1 μM；6 小时；MV4-11 细胞）在突变体中显著降低。在 MV4-11 细胞中，JB170（0.1 μM；18 小时）不会引起 AURORA-A 激活。JB170（0~1 μM；24 小时；IMR5 细胞）显著消除了 AURORA-AT217D 的耗竭。JB170（1 μM；4 天；IMR5 细胞）介导 Aurora-A 的减少，从而抑制癌细胞的存活。JB170（IMR5 细胞）通过降低 AURORA-A mRNA 水平来降低 AURORA-A 的表达水平 [1]。

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AURORA-A 降解：在 MV4-11 白血病细胞中，JB170 (0.1 μM) 处理可在 3 小时内降低 AURORA-A 水平，并在 6 小时达到最大降解。JB170 还能在多种癌细胞系（包括 U2OS、HLE 和 IMR5）中诱导 AURORA-A 的快速降解。JB170 处理后，AURORA-A 蛋白的半衰期从 3.8 小时缩短至 1.3 小时。[1]
降解机制和特异性：JB170 诱导的 AURORA-A 降解依赖于 CEREBLON 和蛋白酶体。与 alisertib 或 thalidomide 共孵育可阻断其降解活性；蛋白酶体抑制剂 MG132 和 neddylation 抑制剂 MLN4924 可完全抑制降解。在MV4-11细胞中，定量SILAC蛋白质组学分析显示，在检测到的4259种蛋白质中，AURORA-A是唯一显著下调（下调73%）的蛋白质，而AURORA-B或其他alisertib结合蛋白的表达未受影响。[1]
对细胞周期的影响：与alisertib诱导的G2/M期阻滞相反，用JB170（0.5 μM）处理MV4-11细胞12小时后，主要导致S期细胞中BrdU掺入减少，表明S期延迟或阻滞。在IMR5细胞中，表达JB170不敏感的AURORA-A^T217D突变体可完全逆转这种S期阻滞表型，证实该阻滞是由AURORA-A耗竭特异性介导的。 [1]
诱导细胞凋亡：在MV4-11细胞中，用JB170（0.1-1 μM）处理72小时后，活细胞数降至对照组的32%，凋亡细胞比例增至56%。在IMR5细胞中，JB170同样能诱导细胞凋亡并抑制克隆形成，而表达AURORA-A^T217D则完全逆转了这些作用。无活性类似物JB211不诱导细胞凋亡。[1]

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体外实验表明，JB170（0.5 μM；0-72小时）特异性靶向AURORA-A，从而诱导MV4-11细胞凋亡。在0.1 μM浓度下，JB170在0-9小时内可迅速耗竭IMR5细胞中的AURORA-A。它专门针对 AURORA-A，使其成为研究该激酶在有丝分裂调控和癌症中作用的高度特异性工具。

公开资料中关于JB170的体内数据报道并不多。作为一种高效且特异性的AURORA-A抑制剂，该化合物在癌症动物模型中具有潜在的应用价值，尤其适用于依赖Aurora A增殖的肿瘤。然而，目前文献中尚未详细报道已发表的体内疗效研究。JB170主要用作研究有丝分裂调控和癌症生物学的研究工具。

等温滴定量热法[1]
所有滴定均在25 °C下使用Nano ITC量热仪进行。二元复合物（AURORA-A滴入JB170以及CEREBLON-TBD滴入JB170）的滴定采用反向滴定法。蛋白质浓度采用Thermo Scientific NanoDrop分光光度计，在280 nm处通过分光光度法测定，使用计算得到的消光系数，并采用25 mM HEPES（pH 7.5）、200 mM NaCl、0.5 mM TCEP和5%甘油的缓冲液。由于蛋白质稳定性问题，AURORA-A的进样口浓度（57至110 µM）需要进行优化，以匹配JB170的浓度（1.0至10.0 µM）。所有数值均由四次滴定计算得出。最佳条件为 110 µM AURORA-A 和 10 µM JB170。对于 CEREBLON (TBD)，滴定实验中蛋白质浓度范围为 88 至 100 µM，JB170 浓度范围为 2.0 至 3.5 µM。解离常数由三次独立滴定计算得出。三元复合物的滴定方法如前所述⁴¹。简而言之，0.1 µM CEREBLON(TBD) 的滴定方法如上所述。二元复合物保留在量热仪中，滴定后用注射器移除过量溶液。在两次独立的滴定实验中，将 110 µM AURORA-A 滴入 JB170 浓度分别为 3.2 µM 和 2.8 µM 的二元复合物中。所有数据均使用NanoAnalyse软件中的单一位点结合模型进行拟合，以获得Kd值和热力学结合参数。

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等温滴定量热法测定结合亲和力：使用等温滴定量热仪测定JB170与AURORA-A、CEREBLON及其复合物的结合亲和力。将纯化的AURORA-A蛋白（57-110 μM）滴定到JB170溶液（1.0-10.0 μM）中，以确定二元复合物的解离常数（K_d）。类似地，将纯化的CEREBLON蛋白（88-100 μM）滴定到JB170溶液（2.0-3.5 μM）中。对于三元复合物，CEREBLON-TBD 与 JB170 (3.2 μM) 预孵育形成二元复合物，随后用 AURORA-A (110 μM) 进行滴定。所有数据均采用单结合位点模型进行拟合。[1]
Kinobeads 选择性分析：使用固定化的广谱激酶抑制剂（Kinobeads epsilon）在 MV4-11 细胞裂解液中进行竞争性结合实验。裂解液在与磁珠孵育前，先与浓度递增的 JB170 (3 nM 至 30 μM) 预孵育。洗脱结合的蛋白质，进行酶解，并通过 LC-MS/MS 分析。测定每种蛋白质的半数抑制浓度 (EC₅₀)，并校正以计算表观结合常数 (K_d^app)。 [1]
热稳定性变化分析：将纯化的重组AURORA-A蛋白（2 μM）与10 μM JB170在室温下孵育约10分钟。加入SYPRO Orange染料后，使用实时荧光定量PCR仪监测温度依赖性的蛋白质展开情况，并通过测量荧光变化来评估化合物结合对蛋白质热稳定性的影响。[1]

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JB170的体外Aurora激酶抑制实验使用重组AURORA-A激酶和肽底物。激酶活性采用放射性或发光检测方法测定，IC50值由剂量反应曲线计算得出。选择性分析证实该化合物对AURORA-A的特异性高于其他Aurora激酶和其他激酶。细胞实验评估AURORA-A的消耗和细胞凋亡的诱导。

细胞活力检测[1]
细胞类型： MV4-11 细胞
测试浓度： 1 µM
孵育时间： 24-72 小时
实验结果： 72 小时后，活细胞数量为对照组的 32%。

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蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： MV4-11 细胞
测试浓度： 0.01~10 μM
孵育时间： 6 小时
实验结果： 在 100 nM 和 1 µM 浓度下观察到明显的降解。

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细胞凋亡分析[1]
细胞类型： MV4-11 细胞
测试浓度： 0.5 µM
孵育时间： 0~72 小时
实验结果： 细胞凋亡完全由靶向 AURORA-A 引起。

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细胞周期分析[1]
细胞类型：MV4-11细胞
测试浓度：0.5 µM
孵育时间：12小时
实验结果：S期进程延迟或停滞。

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靶标结合分析（BRET）：将HEK293细胞转染表达与NanoLuc荧光素酶融合的AURORA-A或AURORA-B。将细胞与不同浓度的JB170和荧光示踪剂孵育2小时。测量BRET信号，并计算化合物竞争的EC₅₀值。 [1] HiBiT 降解实验：将稳定表达 HiBiT 标签 AURORA-A 的 MV4-11 细胞接种于 96 孔板中，并用 JB170 系列稀释液处理 6 小时。裂解后，加入互补的 LargeBiT 片段，并测量发光值以定量 AURORA-A 蛋白水平，用于计算 DC₅₀。[1] Western 印迹实验：用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 RIPA 缓冲液裂解经化合物处理的细胞。蛋白定量后，通过 SDS-PAGE 电泳分离样品，并将蛋白转移至 PVDF 膜。使用针对 AURORA-A、AURORA-B、CEREBLON、cleaved caspase-3、cyclin B1 等的特异性抗体进行免疫印迹分析，并以 vinculin 作为上样对照。 [1]
免疫沉淀：将稳定表达HA标签AURORA-A的MV4-11细胞裂解液与HA偶联磁珠孵育3小时。洗脱结合的蛋白复合物，并通过免疫印迹检测共沉淀的蛋白，例如CEREBLON。[1]
流式细胞术细胞周期分析：用JB170处理的细胞用10 μM BrdU标记1小时。固定后，用2M HCl处理细胞以使DNA变性，用抗BrdU-FITC抗体染色，并用碘化丙啶(PI)复染以检测DNA含量。通过流式细胞术分析BrdU掺入和DNA含量。 [1]
流式细胞术检测细胞凋亡：收集的细胞重悬于Annexin V结合缓冲液中，并用Annexin V/Pacific Blue和碘化丙啶(PI)染色。通过流式细胞术区分活细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡/坏死细胞。[1]
细胞活力检测(AlamarBlue)：将MV4-11细胞接种于96孔板中，并用JB170处理不同时间（每24小时更换一次培养基）。加入AlamarBlue HS细胞活力检测试剂，并测量荧光强度（激发波长550 nm，发射波长600 nm）以评估细胞活力。 [1]
克隆形成实验：将IMR5细胞用JB170处理4天（每24小时更换一次培养基），然后用结晶紫溶液染色30分钟，洗涤并干燥以观察克隆形成。[1]
实时细胞凋亡监测（IncuCyte）：将NCI-H446细胞接种于96孔板中，并用JB170和Caspase-3/7试剂处理。使用IncuCyte Zoom活细胞成像系统每2小时采集一次绿色荧光图像，以实时监测Caspase-3/7的激活情况。 [1]
定量SILAC质谱分析：分别用DMSO、100 nM JB170或100 nM alisertib处理轻、中、重SILAC标记的MV4-11细胞6小时。将各组等量细胞混合，裂解，并通过SDS-PAGE分离蛋白质，进行胶内酶解，然后用LC-MS/MS进行分析。使用MaxQuant软件进行蛋白质鉴定和定量。[1]
AURORA-A相互作用组的IP-MS分析：将稳定表达HA-AURORA-A或空载体的MV4-11细胞裂解液用HA磁珠进行免疫沉淀。将洗脱的蛋白质复合物进行酶解，然后用LC-MS/MS进行分析。使用MaxQuant软件鉴定和定量蛋白质，以确定AURORA-A的相互作用蛋白。 [1]

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JB170 的细胞活性检测在 MV4-11 和 IMR5 等癌细胞系中进行。细胞用浓度为 0.5 μM 的 JB170 处理长达 72 小时，或用浓度为 0.1 μM 的 JB170 处理长达 9 小时。通过蛋白质印迹法确认 AURORA-A 的耗竭。使用 Annexin V/PI 双染和 caspase 活性检测，通过流式细胞术评估细胞凋亡。通过流式细胞术进行细胞周期分析，以评估有丝分裂阻滞。

JB170的体内研究通常会采用异种移植小鼠肿瘤模型。该化合物将通过口服或腹腔注射给药，剂量根据药代动力学研究确定。疗效评估将通过测量肿瘤生长抑制率进行，并评估肿瘤组织中的药效学标志物，例如AURORA-A水平和细胞凋亡。然而，目前文献中尚未发表JB170的具体体内研究方案。

公开资料中关于JB170的药代动力学数据报道较少。该化合物的分子量为963.36 g/mol，分子式为C48H44ClFN8O11。由于其分子较大，口服生物利用度可能有限，因此在体内研究中可能需要肠外给药。目前文献中尚无该研究化合物的详细药代动力学参数，例如半衰期和生物利用度。

公开资料中关于JB170的毒性数据有限。与所有研究化合物一样，JB170仅供研究用途，不得用于人体治疗。需要进行常规细胞系的标准体外细胞毒性试验和体内耐受性研究才能进行完整的毒性评估。该化合物对AURORA-A的特异性靶向作用表明其具有良好的脱靶效应。

[1]. PROTAC-mediated degradation reveals a non-catalytic function of AURORA-A kinase. Nat Chem Biol. 2020;16(11):1179-1188.

有丝分裂激酶AURORA-A对细胞周期进程至关重要，被认为是癌症治疗的重要靶点。尽管AURORA-A的催化活性对其有丝分裂功能必不可少，但近期研究表明，它还具有一些非催化功能，而这些功能难以用传统的小分子药物进行靶向治疗。因此，我们通过将AURORA-A的临床激酶抑制剂与E3泛素连接酶结合分子（例如沙利度胺）连接，开发了一系列化学降解剂（PROTACs）。其中一种降解剂能够快速、持久且高度特异性地降解AURORA-A。此外，我们发现AURORA-A与CEREBLON之间的协同结合可以稳定降解剂复合物。降解剂介导的 AURORA-A 耗竭会导致 S 期缺陷，这与激酶抑制剂观察到的细胞周期效应不同，表明 AURORA-A 在 DNA 复制中具有重要的非催化功能。AURORA-A 降解可诱导癌细胞系发生大量凋亡，从而为开发对抗 AURORA-A 在癌症中作用的新疗法提供了一个多功能的切入点。[1] JB170 (CAS 2705844-82-0) 是一种强效的 Aurora 激酶 A (AURORA-A) 抑制剂，它特异性地靶向该激酶以触发细胞凋亡。低浓度下即可快速耗竭 AURORA-A。其分子式为 C48H44ClFN8O11，分子量为 963.36 g/mol。 JB170 是研究有丝分裂调控、Aurora 激酶生物学以及开发癌症疗法的宝贵研究工具。

C48H44CLFN8O11

963.361373901367

962.28

C, 59.84; H, 4.60; Cl, 3.68; F, 1.97; N, 11.63; O, 18.27

2705844-82-0

153835264

Light yellow to yellow solid powder

1.49±0.1 g/cm3(Predicted)

3.7

238

4

16

19

69

1870

0

C(NCCOCCOCCNC(COC1=CC=CC2=C1C(=O)N(C1CCC(=O)NC1=O)C2=O)=O)(=O)C1=CC=C(NC2=NC=C3C(=N2)C2=CC=C(Cl)C=C2C(C2=C(OC)C=CC=C2F)=NC3)C=C1OC

GYKNPXCQINZRLL-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C48H44ClFN8O11/c1-65-35-7-4-6-33(50)41(35)43-32-21-27(49)9-11-29(32)42-26(23-53-43)24-54-48(57-42)55-28-10-12-30(37(22-28)66-2)44(61)52-16-18-68-20-19-67-17-15-51-39(60)25-69-36-8-3-5-31-40(36)47(64)58(46(31)63)34-13-14-38(59)56-45(34)62/h3-12,21-22,24,34H,13-20,23,25H2,1-2H3,(H,51,60)(H,52,61)(H,54,55,57)(H,56,59,62)

4-[[9-chloro-7-(2-fluoro-6-methoxyphenyl)-5H-pyrimido[5,4-d][2]benzazepin-2-yl]amino]-N-[2-[2-[2-[[2-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindol-4-yl]oxyacetyl]amino]ethoxy]ethoxy]ethyl]-2-methoxybenzamide

2705844-82-0; CHEMBL5278315; 4-((9-chloro-7-(2-fluoro-6-methoxyphenyl)-5H-benzo[c]pyrimido[4,5-e]azepin-2-yl)amino)-N-(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)oxy)acetamido)ethoxy)ethoxy)ethyl)-2-methoxybenzamide; SCHEMBL25163855; EX-A7164; BDBM50609429; 4-[[9-chloro-7-(2-fluoro-6-methoxyphenyl)-5H-pyrimido[5,4-d][2]benzazepin-2-yl]amino]-N-[2-[2-[2-[[2-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindol-4-yl]oxyacetyl]amino]ethoxy]ethoxy]ethyl]-2-methoxybenzamide;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 100 mg/mL (103.80 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (2.60 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。