BRD4; DCAF16 (E3 ligase);

KB02-JQ1 (5-40 μM)处理24小时后，HEK293T细胞内源性BRD4呈浓度依赖性降解[1]。
低分数DCAF16参与的蛋白质降解[1]
研究人员接下来研究了DCAF16的共价修饰是否可以支持另一种核蛋白的降解。在这些研究中，研究人员选择BRD4作为核蛋白，因为它具有一个有效的、选择性的配体JQ1，已经成功地与其他E3配体偶联以促进降解13,15,45 -47。我们发现，一种KB02-JQ1(9)双功能化合物（图6a）以浓度依赖的方式促进了HEK293T细胞中BRD4的降解（图6b），而这种作用被MG132或MLN4924阻断（图6c）。BRD4在被KB02-JQ1的两个独立组分（KB02和JQ1）或fkbp12导向的双功能化合物KB02- slf处理的细胞中均未降解（图6d）。与DCAF16通过KB02-JQ1介导BRD4降解一致，研究人员发现，KB02-JQ1诱导而不是kb02 - slf诱导的DCAF16与BRD4共免疫沉淀（图6e）。KB02-JQ1诱导的BRD4降解在DCAF16−/−细胞中也被显著阻断（图6f）。

研究人员注意到，高浓度的KB02-JQ1(20-40µM；与KB02-SLF(0.5-2µM；图2e， f)。效力的降低可能反映了多种因素的结合，包括两种KB02双功能化合物的细胞摄取差异（与KB02- slf （IC50 = 14±1.1µM）相比，KB02- jq1的细胞毒性右移（IC50 > 50µM）（补充图11））以及与FKBP12相比，dcaf16介导的BRD4降解效率较低。为了探索后一种可能性，研究人员通过KB02-JQ1和KB02-SLF测量了DCAF16的相对细胞参与。具体来说，研究人员使用竞争性ABPP定量绘制了ia -alkyne修饰的半胱氨酸对HEK293T细胞内源性表达DCAF16的分数阻断，这些细胞分别被KB02-SLF（2µM）或KB02-JQ1（20µM）处理，分别支持FKBP12和BRD4降解。这些化学蛋白质组学数据显示，KB02-SLF和KB02-JQ1分别产生了含有半胱氨酸173和177-179的DCAF16肽（aa 168-184）的约10%和40%的结合（图6g，补充图12和补充数据集4）。在这些化学蛋白质组学实验中，另一种ia -炔反应性半胱氨酸C119没有显示出参与的证据（图6g，补充图12）。研究人员通过比较KB02-SLF（5µM，接合度13%）和KB02-JQ1（20µM，接合度35%）处理的HEK293T细胞中重组表达DCAF16的HMW和LMW形式，测量了类似的接合模式（补充图13）。综上所述，这些数据表明，支持FKBP12和BRD4通过各自的亲电性protac降解需要不同数量的DCAF16参与，但是，在两种情况下，DCAF16都没有大量（> 50%）转移到protac修饰状态。

最后，对KB02-JQ1处理的HEK293T细胞进行MS-based蛋白质组学分析，发现BRD4选择性降解，但BRD2或BRD3没有选择性降解（图6h和补充数据集5）。BRD2似乎被KB02-JQ1稳定，JQ1本身也被发现48。蛋白质组中另一个蛋白ACAT1在KB02-JQ1处理的细胞中丰度显著降低（图6小时和补充数据集5）。用KB02-SLF处理的对照细胞也显示ACAT1的丰度降低，但BRD4没有减少（图6小时和补充数据集5）。有趣的是，ACAT1含有高活性半胱氨酸（C126） 27,28。这些数据表明，含有kb02的化合物对C126进行共价修饰可能会导致ACAT1的降解，可能是通过破坏该酶的同质寡聚形式49。虽然BRD2是唯一在KB02-JQ1处理的细胞中丰度增加两倍以上的蛋白，但少数其他蛋白（总共9个）的丰度增加更为适度（约1.5 - 1.8倍）（补充数据集5）。这些蛋白在KB02-SLF处理的细胞中都没有改变（补充数据集5）。这些蛋白是否代表DCAF16的潜在内源性底物，这些底物是由KB02-JQ1与KB02-SLF在细胞中更高的E3连接酶参与而稳定的，或者通过直接修饰KB02-JQ1来稳定，这是未来研究的一个重要课题。

KB02-JQ1-或kb02 - slf诱导的蛋白降解的全蛋白质组鉴定[1]
HEK293T轻、重SILAC细胞分别用DMSO和KB02-JQ1（20µM）或KB02-SLF（2µM）处理24 h。收集轻、重细胞，用cOmplete蛋白酶抑制剂鸡尾酒在1% NP-40裂解缓冲液中裂解。对细胞进行涡旋和超声处理5次脉冲（40%,4）。在4°C下，16000 g离心10分钟后收集上清。DC法测定蛋白浓度。将轻重样蛋白组各50µg混合，甲醇/氯仿沉淀。蛋白球在65℃下用8 M尿素在PBS中加热10 min，然后在65℃下用12.5 mM DTT还原15 min，在37℃下用25 mM碘乙酰胺烷基化30 min。蛋白溶液用PBS稀释至2 M尿素，在37℃下用2µg胰蛋白酶酶切6 h。5µg肽被加载到填充3cm C18树脂的硅胶毛细管柱（250µm）上。采用上述相同的MudPIT方法和CIMAGE软件对多肽进行分析。定量肽的中间SILAC比率被用作蛋白质丰度的测量。进一步应用以下质量过滤器生成图6h中的图：(1)蛋白质必须至少有两个定量肽；(2)蛋白质必须在两个复制中都存在；(3)对于每种蛋白质，所测多肽比值的标准差必须小于1.0。

蛋白质印迹分析[1]
细胞类型： HEK293T 细胞
测试浓度： 5 μM、10 μM、20 μm 或 40 μM
孵育持续时间：24 小时
实验结果：HEK293T 细胞中内源 BRD4 的浓度依赖性降解。

[1]. Electrophilic PROTACs that degrade nuclear proteins by engaging DCAF16. Nat Chem Biol. 2019 Jul;15(7):737-746.

Ligand-dependent protein degradation has emerged as a compelling strategy to pharmacologically control the protein content of cells. So far, however, only a limited number of E3 ligases have been found to support this process. Here, we use a chemical proteomic strategy that leverages broadly reactive, cysteine-directed electrophilic fragments coupled to selective ligands for intracellular proteins (for example, SLF for FKBP12, JQ1 for BRD4) to screen for heterobifunctional degrader compounds (or proteolysis targeting chimeras, PROTACs) that operate by covalent adduction of E3 ligases. This approach identified DCAF16-a poorly characterized substrate recognition component of CUL4-DDB1 E3 ubiquitin ligases-as a target of electrophilic PROTACs that promote the nuclear-restricted degradation of proteins. We find that only a modest fraction (~10-40%) of DCAF16 needs to be modified to support protein degradation, pointing to the potential for electrophilic PROTACs to induce neosubstrate degradation without substantially perturbing the function of the participating E3 ligase.[1]

C38H43CL2N7O6S

796.7623

795.237

C, 57.28; H, 5.44; Cl, 8.90; N, 12.31; O, 12.05; S, 4.02

2384184-44-3

KB02-COOH;2375196-30-6

137347731

White to off-white solid powder

4.4

178

2

10

16

54

1300

1

ClC([H])([H])C(N1C2C([H])=C([H])C(=C([H])C=2C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H])OC([H])([H])C(N([H])C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])N([H])C(C([H])([H])[C@@]1([H])C2=NN=C(C([H])([H])[H])N2C2=C(C(C([H])([H])[H])=C(C([H])([H])[H])S2)C(C2C([H])=C([H])C(=C([H])C=2[H])Cl)=N1)=O)=O)=O

XIYYDTXOEVAZGI-PMERELPUSA-N

InChI=1S/C38H43Cl2N7O6S/c1-23-24(2)54-38-35(23)36(26-6-8-28(40)9-7-26)43-30(37-45-44-25(3)47(37)38)20-32(48)41-12-15-51-17-18-52-16-13-42-33(49)22-53-29-10-11-31-27(19-29)5-4-14-46(31)34(50)21-39/h6-11,19,30H,4-5,12-18,20-22H2,1-3H3,(H,41,48)(H,42,49)/t30-/m0/s1

N-[2-[2-[2-[[2-[[1-(2-chloroacetyl)-3,4-dihydro-2H-quinolin-6-yl]oxy]acetyl]amino]ethoxy]ethoxy]ethyl]-2-[(9S)-7-(4-chlorophenyl)-4,5,13-trimethyl-3-thia-1,8,11,12-tetrazatricyclo[8.3.0.02,6]trideca-2(6),4,7,10,12-pentaen-9-yl]acetamide

KB02-JQ1; 2384184-44-3; N-[2-[2-[2-[[2-[[1-(2-Chloroacetyl)-3,4-dihydro-2H-quinolin-6-yl]oxy]acetyl]amino]ethoxy]ethoxy]ethyl]-2-[(9S)-7-(4-chlorophenyl)-4,5,13-trimethyl-3-thia-1,8,11,12-tetrazatricyclo[8.3.0.02,6]trideca-2(6),4,7,10,12-pentaen-9-yl]acetamide; SCHEMBL22075929;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 200 mg/mL (251.02 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (6.28 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 50.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 5 mg/mL (6.28 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 50.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (6.28 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 50.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。