UNC6934

NSD2-PWWP1 (Kd = 91 ± 8 nM by SPR; IC50 = 104 ± 13 nM by AlphaScreen disrupting H3K36me2 nucleosome interaction; Cellular engagement EC50 = 1.23 ± 0.25 μM by NanoBRET PPI assay). [1]
UNC6934 targets the N-terminal PWWP (PWWP1) domain of NSD2 (nuclear receptor-binding SET domain protein 2). It binds to NSD2 with a Kd of 92 nM and antagonizes the interaction between NSD2-PWWP1 and H3K36me2 nucleosomes. The compound occupies the canonical H3K36me2-binding pocket of PWWP1, selectively engages endogenous NSD2 in cells, and disrupts the NSD2-PWWP1 interaction with H3K36me2 nucleosomes.

通过表面等离子共振 (SPR) 测定，UNC6934 与 NSD2-PWWP1 结构域的结合亲和力 (Kd) 为 91 ± 8 nM。[1]
- UNC6934 以剂量依赖的方式破坏 NSD2-PWWP1 与核小体 H3K36me2 之间的相互作用，IC50 为 104 ± 13 nM。[1]
- 在存在鲑鱼精子 DNA (SSD) 以阻断非特异性 DNA 相互作用的情况下，UNC6934 能有效使全长 NSD2 从核小体 H3K36me2 上解离，IC50 为 78 ± 29 nM，其效力比阴性对照 UNC7145 (IC50 = 5.1 ± 1 μM) 高约 65 倍。在缺乏SSD的情况下，UNC6934无法置换全长NSD2。[1]
- 在荧光偏振分析中，浓度高达25 μM的UNC6934对NSD2-PWWP1 DNA结合没有显著影响。[1]
- 在细胞分级分离实验中，UNC6934处理导致染色质中全长NSD2少量释放。[1]
- 用UNC6934处理后，未观察到整体H3K36me2、H3K36me1、H3K36me3或H3K27me3水平的变化。[1]
- UNC6934不影响位点特异性H3K36me2水平或NSD2靶基因（例如黏附基因）的mRNA水平。 [1]
- UNC6934 不抑制 33 种甲基转移酶结构域中的任何一种，包括 H3K36 甲基转移酶 NSD1、NSD2、NSD3 和 SETD2。[1]
- 用浓度高达 5 μM 的 UNC6934 处理贴壁细胞系（HCT116、HEK293、HT1080、MCF7、U2OS）或造血系统恶性肿瘤细胞系（KMS-11、MM1S、RS4;11、TKO、UTMC2）3-12 天后，未观察到急性细胞毒性作用。[1]
- UNC6934 不影响在骨髓基质上生长的 KMS-11 t(4;14) 多发性骨髓瘤细胞的增殖。 [1]

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UNC6934 具有强效的体外活性，抑制 NSD2-H3K36me2 核小体相互作用的 IC50 值为 104 nM。它与 NSD2 的解离常数 Kd 为 92 nM，并且是 NSD2-PWWP1 的强效拮抗剂，Kd (SPR) 值为 80 ± 18 nM。该化合物对 NSD2-PWWP1 具有选择性，对包括 NSD3-PWWP1 在内的其他 14 种 PWWP 结构域均无选择性。在 5 µM 的浓度下，它能诱导 U2OS 细胞中 NSD2 在核仁中的积累。

由于UNC6934主要用作细胞研究的化学探针，因此针对该化合物的体内研究有限。需要利用合适的动物模型进行研究，以评估其体内疗效、药代动力学和安全性。该化合物的体内应用潜力取决于其药代动力学特性，目前正在对其进行表征。它主要用于表观遗传学研究和靶点验证研究。

表面等离子共振 (SPR)：将生物素标记的 NSD2-PWWP1 结构域固定在 SA 传感器芯片上。测试了浓度为 2 μM 的 UNC6934，并以 0.33 的稀释倍数制备了五个浓度。实验在单循环动力学条件下进行，接触时间为 60 秒，解离时间为 120 秒，流速为 75 μl min⁻¹，使用含 0.5% DMSO 的 HBS-EP 缓冲液。[1]
- 差示扫描荧光法 (DSF)：该方法测定了 100 μM UNC6934 对 NSD2-PWWP1 和其他 15 种 PWWP 结构域热稳定性的影响。蛋白质浓度为 0.1 mg ml⁻¹，溶于含 5× Sypro Orange 的缓冲液（100 mM HEPES，pH 7.5，150 mM NaCl）中。Tm 值升高超过 2°C 被视为结合。UNC6934 不能稳定 NSD2-PWWP1 F266A 突变体。[1]
- dCyper AlphaScreen 结合实验：采用两阶段实验。A 阶段：在不同 NaCl 浓度下，用 His 标签标记的 NSD2-PWWP1 与阳性 (H3K36me2) 和阴性 (H3K36me0) 核小体进行滴定。B 阶段：使用最佳浓度的 NSD2-PWWP1 检测生物素标记的核小体。对于拮抗剂测试，将 5 μl 化合物与 5 μl NSD2-PWWP1 (40 nM) 或全长 NSD2 (10 nM) 混合，孵育 15 分钟。然后，加入 5 μl H3K36me2 dNuc (10 nM)，孵育 30 分钟。加入镍螯合受体磁珠和链霉亲和素供体磁珠的混合物，孵育 60 分钟，并测量 AlphaScreen 信号。[1]
- NanoBRET PPI 检测：将转染了 H3.3-HaloTag 和 NSD2-PWWP1-NanoLuc（野生型或 F266A）或 NSD3-PWWP1-NanoLuc 的 U2OS 细胞接种于 96 孔板中，在有或无化合物的情况下培养 20 小时。加入 NanoBRET NanoGlo 底物后，分别测量了 450 nm 处的供体发射和 618 nm 处的受体发射。用 UNC6934 处理后，观察到 BRET 信号呈剂量依赖性下降（EC50 = 1.23 ± 0.25 μM）。[1]
- 荧光偏振 DNA 结合/置换实验：将荧光素标记的双链 DNA (5 nM) 和 NSD2-PWWP1 (500 nM) 与浓度递增的 UNC6934（最高达 25 μM）孵育 30 分钟。测量荧光偏振信号。UNC6934 对双链 DNA 与 NSD2-PWWP1 的结合没有显著影响。 [1]
- 晶体学：NSD2-PWWP1 与 UNC6934 复合物的结构已解析（PDB：6XCG）。晶体采用悬滴气相扩散法在 18°C 下获得，反应体系包含 1.6 M (NH₄)₂SO₄、0.01 M MgCl₂ 和 0.1 M HEPES（pH 7.5）。[1]

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在 NSD2-PWWP1 结合实验中，采用表面等离子共振 (SPR) 技术测定 UNC6934 与 NSD2-PWWP1 结构域的结合亲和力 (Kd)。在细胞研究中，用 UNC6934 处理 U2OS 细胞，并通过免疫荧光显微镜评估 NSD2 在核仁中的积累情况。对于蛋白质-蛋白质相互作用抑制试验，测试该化合物破坏 NSD2 和 H3K36me2 核小体之间相互作用的能力，IC50 值由剂量反应曲线确定。

细胞培养：HCT116、HEK293、HT1080、MCF7 和 U2OS 细胞培养于含 10% FBS 和青霉素/链霉素的 DMEM 培养基中。OP9 骨髓基质细胞培养于含 GlutaMAX、20% FBS 和 55 μmol/L β-巯基乙醇的 α-MEM 培养基中。KMS-11 和 TKO2 细胞培养于含 10% FBS 和青霉素/链霉素的 RPMI 培养基中。[1]
- 化学蛋白质组学：将 KMS-11 全细胞裂解物 (3 mg) 与 DMSO、20 μM UNC7145 或 20 μM UNC6934 预孵育 1 小时。加入 UNC7096 结合的磁珠，继续孵育 1 小时。将磁珠洗涤后，用胰蛋白酶在磁珠上进行过夜消化。所得肽段通过LC-MS/MS进行分析。使用MaxQuant搜索无标记定量MS数据，并使用R语言中的DEP包进行分析。[1]
- 荧光显微镜（免疫荧光）：细胞用2%甲醛固定，用0.25% Triton X-100透化，并用1% BSA封闭。细胞与NSD2（1:500）和纤维蛋白（1:1000）的一抗在4℃孵育过夜，随后与荧光二抗（1:1000）孵育。DNA用Hoechst 33342染色。使用共聚焦显微镜采集图像。使用CellProfiler流程计算Pearson相关系数（PCC）来量化共定位。 [1]
- 荧光显微镜（融合蛋白）：将 0.125 μg NSD2-GFP 和 0.125 μg fibrillarin-RFP 转染至 U2OS 细胞。24 小时后，用化合物处理细胞 4 小时或直接固定。细胞用 2% 甲醛固定，并用 Hoechst 33342 染色。使用 EVOS FL Auto 2 成像系统采集图像。[1]
- 全球 H3K36me2 的蛋白质印迹分析：用化合物处理细胞 72 小时后收集并裂解细胞。将样品在 SDS 上样缓冲液中煮沸，并在 NuPAGE 凝胶上进行电泳。免疫印迹实验采用 H3K36me2 (1:2,000)、组蛋白 H3 (1:5,000)、α-微管蛋白 (1:5,000) 和 NSD2 (1:1,000) 抗体进行检测，随后进行近红外光谱检测。[1]
- 细胞活力/增殖评估（贴壁细胞）：将细胞（HCT116、HEK293、HT1080、MCF7、U2OS）用 3、5 或 10 μM 的 UNC6934 或 UNC7145 处理 72 小时。使用 IncuCyte 活细胞分析系统对细胞核进行染色和成像。 [1]
- 细胞活力/增殖评估（悬浮细胞）：将细胞（KMS-11、MM1S、RS4;11、TKO、UTMC2）用 3、5 或 10 μM 的 UNC6934 或 UNC7145 处理 6-12 天。使用 CellTiter-Glo 发光细胞活力检测试剂盒测定细胞活力。[1]
- KMS-11/OP9 共培养增殖实验：将表达 GFP 的 KMS-11 和 TKO 细胞用 5 μM 的 UNC6934 或 UNC7145 预处理 10 天，然后接种于 OP9 骨髓基质细胞的融合单层上。使用 IncuCyte 活细胞成像平台，通过计数 GFP+ 细胞，持续 7 天监测细胞增殖。 [1]
- 5-乙炔基尿苷 (5-EU) 掺入实验：细胞用 5 μM UNC6934 或 UNC7145 预处理 30 分钟，然后用 5-EU 处理 45 分钟。细胞固定后进行核仁蛋白染色。使用 Click-iT 试剂盒标记新生 RNA。使用 CellProfiler 流程采集和分析图像。[1]
- 逆转录定量 PCR (RT-qPCR)：分离总 RNA 并进行逆转录。使用 SYBR Green Master Mix 进行 qPCR。采用 Cₜ 法测定相对转录水平，并以 B2M 或 TBP 管家基因进行标准化。[1]
- 染色质免疫沉淀定量 PCR (ChIP-qPCR)：用 1% 多聚甲醛固定细胞 (1 x 10⁷)。裂解的细胞核用微球菌核酸酶处理并进行超声破碎。将抗H3K36me2抗体加入染色质中，并孵育过夜。纯化DNA并通过qPCR进行分析。计算输入百分比。[1]
- 细胞分级分离：将KMS-11细胞沉淀重悬于低渗缓冲液A中。收集上清液（胞质组分）。将沉淀重悬于不含NaCl的缓冲液B中，随后用含150 mM NaCl的缓冲液B提取核质组分。将剩余的染色质结合沉淀重悬于组蛋白缓冲液中。通过Western blot分析各组分中的NSD2。[1]

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对于细胞研究，将U2OS细胞或其他合适的细胞系培养于合适的培养基中，并用不同浓度（通常为1-10 µM）的UNC6934处理。采用抗NSD2抗体，通过免疫荧光显微镜评估NSD2的定位。通过染色质免疫沉淀（ChIP）或其他蛋白质-蛋白质相互作用实验评估化合物对NSD2-H3K36me2相互作用的影响。采用标准细胞毒性检测方法评估细胞活力。通过筛选针对相关PWWP结构域的化合物来评估脱靶效应。

对于体内研究，将使用合适的动物模型来评估UNC6934。该化合物将通过适当的途径以不同剂量给药。将测定包括半衰期、清除率和组织分布在内的药代动力学参数。疗效将通过测量靶点结合情况和对基因表达的下游效应来评估。然而，文献中尚未广泛报道UNC6934的详细体内研究方案。

UNC6934 的分子式为 C24H21N5O4，分子量为 443.45。它是一种纯度≥98%的固体。该化合物微溶于 DMSO（1-10 mg/ml）。应储存于 -20°C，并在室温下运输。如果储存得当，保质期≥12 个月。储备液可在 0-4°C 下保存长达 1 个月。

在浓度高达 5 μM 的情况下，UNC6934 在贴壁细胞系（HCT116、HEK293、HT1080、MCF7、U2OS）或造血系统恶性肿瘤细胞系（KMS-11、MM1S、RS4;11、TKO、UTMC2）中均未显示出急性细胞毒性作用，作用时间为 3-12 天。[1] - 在包含 90 种中枢神经系统受体、通道和转运蛋白的检测中，UNC6934 (10 μM) 显示出极低的脱靶活性，仅抑制两种靶点超过 50%。人钠依赖性血清素转运蛋白是唯一被抑制的蛋白，其 Ki 值为 1.4 ± 0.8 μM。[1]

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UNC6934 是一种仅供实验室使用的研究化合物，尚未获准用于人体治疗。它是一种对NSD2-PWWP1结构域具有高选择性的化学探针（IC50 = 104 nM）。该化合物还能抑制5-羟色胺转运蛋白（SERT）和μ-阿片受体，其Ki值分别为1.4 µM和8 µM。操作该化合物时应遵循标准的实验室安全操作规程。建议储存于-20°C。

[1]. A chemical probe targeting the PWWP domain alters NSD2 nucleolar localization. Nat Chem Biol. 2022 Jan;18(1):56-63.

背景：NSD2 是负责 H3K36me2 的主要酶，H3K36me2 是一种与活跃基因转录相关的标记。它在多种癌症中异常表达，包括通过 t(4;14) 易位导致的多发性骨髓瘤 (MM)。UNC6934 是一种用于 NSD2-PWWP1 结构域的化学探针。[1]
作用机制： UNC6934 占据 NSD2-PWWP1 结构域的典型甲基赖氨酸结合口袋（由 Y233、W236 和 F266 组成的芳香笼），直接与 H3K36me2 竞争结合位点。这种结合诱导三个侧链（Y233、F266 和 E272）发生构象重排。 UNC6934的环丙基环紧密地嵌入芳香笼中，而体积较大的异丙基（如UNC7145中的异丙基）则不会导致明显的结合。[1]
- 选择性： UNC6934对NSD2-PWWP1具有选择性，优于其他15种人类PWWP结构域。这种选择性可归因于结构差异，例如NSD2中位于容纳苯并噁嗪环的空腔底部的G268。如果将NSD3中的G268替换为丝氨酸，则会阻碍配体结合。[1]
- 细胞靶标结合：基于UNC6934的生物素标记亲和试剂（UNC7096）可从细胞裂解液中富集内源性NSD2，这种作用可被UNC6934阻断，但不能被UNC7145阻断。蛋白质组学分析发现，NSD2 是唯一一种因与 UNC6934 竞争而显著减少的蛋白质。[1]
- 表型效应： UNC6934 促进内源性 NSD2 在核仁中的积累，模拟 t(4;14) MM 中 PWWP1 截短突变的表型效应。这是由于 NSD2 的染色质读取结构域与 C 端核仁定位序列 (NoLS) 之间存在竞争机制。[1]

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UNC6934 是一种高效、选择性的化学探针，靶向 NSD2 的 N 端 PWWP (PWWP1) 结构域。它以 104 nM 的 IC50 值抑制 NSD2 与 H3K36me2 核小体的相互作用，并以 92 nM 的 Kd 值与 NSD2 结合。该化合物对 NSD2-PWWP1 具有选择性，优于其他 14 种 PWWP 结构域。它用于表观遗传学研究和靶点验证。该化合物仅供研究使用，尚未获准用于临床应用。建议储存于 -20°C。

C24H21N5O4

443.454644918442

443.16

C, 65.00; H, 4.77; N, 15.79; O, 14.43

2561494-77-5

146676966

Off-white to gray solid powder

1.8

114

2

6

6

33

736

0

O=C(C1C=CC2=C(C=1)OCC(N2)=O)N(CC1C=CC(C(NC2C=CN=CN=2)=O)=CC=1)C1CC1

KOZGEDUWAQFVAV-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H21N5O4/c30-22-13-33-20-11-17(5-8-19(20)27-22)24(32)29(18-6-7-18)12-15-1-3-16(4-2-15)23(31)28-21-9-10-25-14-26-21/h1-5,8-11,14,18H,6-7,12-13H2,(H,27,30)(H,25,26,28,31)

N-Cyclopropyl-3-oxo-N-(4-(pyrimidin-4-ylcarbamoyl)benzyl)-3,4-dihydro-2H-benzo[b][1,4]oxazine-7-carboxamide

UNC6934; UNC-6934; UNC6,934; 2561494-77-5; N-cyclopropyl-3-oxo-N-(4-(pyrimidin-4-ylcarbamoyl)benzyl)-3,4-dihydro-2H-benzo[b][1,4]oxazine-7-carboxamide; CHEMBL5200945; N-cyclopropyl-3-oxo-N-({4-[(pyrimidin-4-yl)carbamoyl]phenyl}methyl)-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazine-7-carboxamide; UNC 6934;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 25 mg/mL (56.38 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.64 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.64 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.64 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。