UNC6934

NSD2-PWWP1 (Kd = 91 ± 8 nM by SPR; IC50 = 104 ± 13 nM by AlphaScreen disrupting H3K36me2 nucleosome interaction; Cellular engagement EC50 = 1.23 ± 0.25 μM by NanoBRET PPI assay). [1]

- 通过表面等离子共振 (SPR) 测定，UNC6934 与 NSD2-PWWP1 结构域结合的 Kd 为 91 ± 8 nM。 [1]
- UNC6934 以剂量依赖性方式破坏 NSD2-PWWP1 与核小体 H3K36me2 的相互作用，IC50 为 104 ± 13 nM。 [1]
- 在存在鲑鱼精子 DNA (SSD) 以阻断非特异性 DNA 相互作用的情况下，UNC6934 可有效解离全长 NSD2 与核小体 H3K36me2 的结合，IC50 为 78 ± 29 nM，比阴性对照 UNC7145（IC50 = 5.1 ± 1 μM）强约 65 倍。在没有 SSD 的情况下，UNC6934 无法解离全长 NSD2。 [1]
- 在荧光偏振实验中，UNC6934 在高达 25 μM 的浓度下对 NSD2-PWWP1 的 DNA 结合没有显著影响。 [1]
- 在细胞分级分离实验中，UNC6934 处理导致全长 NSD2 从染色质中适度释放。 [1]
- 在 UNC6934 处理后，未观察到全局 H3K36me2、H3K36me1、H3K36me3 或 H3K27me3 水平的变化。 [1]
- UNC6934 不影响 NSD2 靶基因（如粘附基因）的 mRNA 水平或位点特异性 H3K36me2 水平。 [1]
- UNC6934 不抑制包括 NSD1、NSD2、NSD3 和 SETD2 在内的 33 种甲基转移酶结构域中的任何一种。 [1]
- 在贴壁细胞系或造血系统恶性肿瘤细胞系中，使用高达 5 μM 的 UNC6934 处理 3-12 天，未观察到急性细胞毒性效应。 [1]
- UNC6934 不影响在骨髁基质上生长的 KMS-11 t(4;14) 多发性骨髓瘤细胞的增殖。 [1]

- 表面等离子共振 (SPR)： 将生物素化的 NSD2-PWWP1 结构域固定在 SA 传感器芯片上。UNC6934 的最高测试浓度为 2 μM，使用 0.33 的稀释因子得到五个浓度。实验采用单循环动力学，在含有 0.5% DMSO 的 HBS-EP 缓冲液中以 75 μl min⁻¹ 的流速进行，接触时间为 60 秒，解离时间为 120 秒。 [1]
- 差示扫描荧光法 (DSF)： 该测定用于确定 100 μM UNC6934 对 NSD2-PWWP1 及其他 15 个 PWWP 结构域热稳定性的影响。蛋白质使用浓度为 0.1 mg ml⁻¹，缓冲液含 100 mM HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl 和 5x Sypro Orange。Tm 值升高 >2°C 视为结合。UNC6934 不能稳定 NSD2-PWWP1 F266A 突变体。 [1]
- dCyper AlphaScreen 结合实验： 实验分两阶段进行。阶段 A：在不同 NaCl 浓度下，将带 His 标签的 NSD2-PWWP1 滴定至阳性对照 (H3K36me2) 和阴性对照 (H3K36me0) 核小体。阶段 B：使用最佳浓度的 NSD2-PWWP1 探测生物素化核小体组。对于拮抗剂测试，将 5 μl 化合物和 5 μl NSD2-PWWP1 (40 nM) 或全长 NSD2 (10 nM) 混合，孵育 15 分钟。然后加入 5 μl H3K36me2 dNuc (10 nM) 并孵育 30 分钟。加入镍螯合受体珠和链霉亲和素供体珠的混合物，孵育 60 分钟后测量 AlphaScreen 信号。 [1]
- NanoBRET PPI 实验： 用 H3.3-HaloTag 和 NSD2-PWWP1-NanoLuc（野生型或 F266A）或 NSD3-PWWP1-NanoLuc 转染 U2OS 细胞。第二天，将细胞种于 96 孔板中，加入或不加入化合物处理 20 小时。加入 NanoBRET NanoGlo 底物后，在 450 nm 和 618 nm 处分别测量供体发射和受体发射信号。观察到 UNC6934 处理后 BRET 信号呈剂量依赖性下降（EC50 = 1.23 ± 0.25 μM）。 [1]
- 荧光偏振 DNA 结合/置换实验： 将荧光标记的 dsDNA (5 nM) 和 NSD2-PWWP1 (500 nM) 与递增浓度的 UNC6934（高达 25 μM）一起孵育 30 分钟。然后测量荧光偏振信号。UNC6934 对 dsDNA 与 NSD2-PWWP1 的结合无显著影响。 [1]
- 晶体学： 解析了 NSD2-PWWP1 与 UNC6934 复合物的结构 (PDB: 6XCG)。晶体通过坐滴气相扩散法在 18°C 下获得，条件为 1.6 M (NH₄)₂SO₄、0.01 M MgCl₂ 和 0.1 M HEPES (pH 7.5)。 [1]

- 细胞培养： HCT116、HEK293、HT1080、MCF7 和 U2OS 细胞培养于含 10% FBS 和青霉素/链霉素的 DMEM 中。OP9 骨髁基质细胞培养于含 GlutaMAX、20% FBS 和 55 μmol liter⁻¹ β-巯基乙醇的 α-MEM 中。KMS-11 和 TKO2 细胞培养于含 10% FBS 和青霉素/链霉素的 RPMI 中。 [1]
- 化学蛋白质组学： 将 KMS-11 全细胞裂解液 (3 mg) 与 DMSO、20 μM UNC7145 或 20 μM UNC6934 预孵育 1 小时。加入结合了 UNC7096 的磁珠，孵育 1 小时。洗涤磁珠，用胰蛋白酶过夜进行磁珠上酶解。产生的多肽通过 LC-MS/MS 分析。无标记定量质谱数据使用 MaxQuant 搜索，并使用 R 语言中的 DEP 包进行分析。 [1]
- 荧光显微镜（免疫荧光）： 细胞用 2% 甲醛固定，0.25% Triton X-100 透化，1% BSA 封闭。细胞与 NSD2 (1:500) 和 fibrillarin (1:1,000) 的一抗 4°C 孵育过夜，然后与荧光二抗 (1:1,000) 孵育。DNA 用 Hoechst 33342 染色。使用共聚焦显微镜获取图像。使用 CellProfiler 流水线计算皮尔逊相关系数 (PCC) 来量化共定位。 [1]
- 荧光显微镜（融合蛋白）： 用 0.125 μg NSD2-GFP 和 0.125 μg fibrillarin-RFP 转染 U2OS 细胞。24 小时后，化合物处理细胞 4 小时或直接固定。细胞用 2% 甲醛固定，Hoechst 33342 染色。使用 EVOS FL Auto 2 成像系统获取图像。 [1]
- 全局 H3K36me2 的免疫印迹： 细胞用化合物处理 72 小时，收集并裂解。样品在 SDS 上样缓冲液中煮沸，用 NuPAGE 凝胶电泳。使用 H3K36me2 (1:2,000)、组蛋白 H3 (1:5,000)、α-微管蛋白 (1:5,000) 和 NSD2 (1:1,000) 抗体进行免疫印迹，近红外检测。 [1]
- 细胞活力/增殖评估（贴壁细胞）： 用 3、5 或 10 μM 的 UNC6934 或 UNC7145 处理细胞 (HCT116、HEK293、HT1080、MCF7、U2OS) 72 小时。染色细胞核，用 IncuCyte 活细胞分析系统成像。 [1]
- 细胞活力/增殖评估（悬浮细胞）： 用 3、5 或 10 μM 的 UNC6934 或 UNC7145 处理细胞 (KMS-11、MM1S、RS4;11、TKO、UTMC2) 6-12 天。使用 CellTiter-Glo 发光细胞活力测定法测量活力。 [1]
- KMS-11/OP9 共培养增殖实验： 将表达 GFP 的 KMS-11 和 TKO 细胞用 5 μM UNC6934 或 UNC7145 预处理 10 天，然后接种到 OP9 骨髁基质细胞融合单层上。使用 IncuCyte 活细胞成像平台，通过计数 GFP+ 细胞监测 7 天内的增殖情况。 [1]
- 5-乙炔基尿苷 (5-EU) 掺入实验： 细胞用 5 μM UNC6934 或 UNC7145 预处理 30 分钟，然后加入 5-EU 处理 45 分钟。固定细胞并染色核仁素。使用 Click-iT 试剂盒标记新生 RNA。获取图像并使用 CellProfiler 流水线分析。 [1]
- 逆转录定量 PCR (RT-qPCR)： 提取总 RNA 并逆转录。使用 SYBR Green 预混液进行 qPCR。相对转录水平通过 Cₜ 法确定，并相对于 B2M 或 TBP 内参基因进行标准化。 [1]
- 染色质免疫沉淀定量 PCR (ChIP-qPCR)： 细胞 (1 x 10⁷) 用 1% 多聚甲醛固定。裂解的细胞核用微球菌核酸酶处理并超声破碎。向染色质中加入 anti-H3K36me2 抗体，孵育过夜。纯化 DNA 并通过 qPCR 分析。计算投入百分比。 [1]
- 细胞分级分离： KMS-11 细胞沉淀重悬于低渗缓冲液 A。收集上清液（胞质组分）。沉淀依次重悬于不含 NaCl 的缓冲液 B，然后含 150 mM NaCl 的缓冲液 B，以提取核质组分。剩余的染色质结合沉淀重悬于组蛋白缓冲液。通过 western blot 分析各组分中的 NSD2。 [1]

- 在贴壁细胞系（HCT116、HEK293、HT1080、MCF7、U2OS）或造血系统恶性肿瘤细胞系（KMS-11、MM1S、RS4;11、TKO、UTMC2）中，高达 5 μM 的 UNC6934 在 3-12 天内未显示出急性细胞毒性作用。 [1]
- 在针对 90 种中枢神经系统受体、通道和转运蛋白的筛选中，UNC6934 (10 μM) 显示出极小的脱靶活性，仅抑制了其中两种靶标超过 50%。人钠依赖性血清素转运蛋白是唯一具有可测量抑制常数 Ki (1.4 ± 0.8 μM) 的蛋白质。 [1]

[1]. A chemical probe targeting the PWWP domain alters NSD2 nucleolar localization. Nat Chem Biol. 2022 Jan;18(1):56-63.

- 背景介绍： NSD2 是负责 H3K36me2 的主要酶，该修饰与活跃基因转录相关。它在多种癌症中异常表达，包括通过 t(4;14) 易位的多发性骨髓瘤 (MM)。UNC6934 是一种针对 NSD2-PWWP1 结构域的化学探针。 [1]
- 作用机制： UNC6934 占据 NSD2-PWWP1 结构域的经典甲基赖氨酸结合口袋（由 Y233、W236 和 F266 构成的芳香笼），直接与 H3K36me2 竞争。这种结合诱导三个侧链（Y233、F266、E272）发生构象重排。UNC6934 的环丙基环紧密贴合在芳香笼中，而体积更大的异丙基（如 UNC7145 中）则无法产生有效结合。 [1]
- 选择性： UNC6934 对 NSD2-PWWP1 的选择性高于其他 15 个人类 PWWP 结构域。选择性可以通过结构差异来解释，例如 NSD2 中容纳苯并恶嗪酮环的腔体底部是 G268，若将其替换为 NSD3 中的丝氨酸，会阻碍配体结合。 [1]
- 细胞靶点结合： 基于 UNC6934 的生物素标记亲和试剂 (UNC7096) 能够从细胞裂解液中富集内源性 NSD2，此效应可被 UNC6934（而非 UNC7145）阻断。蛋白质组学分析确定，NSD2 是唯一被 UNC6934 竞争显著耗竭的蛋白质。 [1]
- 表型效应： UNC6934 促进内源性 NSD2 在核仁中积累，表型复制了 t(4;14) MM 中 PWWP1 截短突变导致的效果。这是由于 NSD2 的染色质阅读器结构域与 C 端的核仁定位序列之间存在的竞争机制所致。 [1]

C24H21N5O4

443.454644918442

443.16

C, 65.00; H, 4.77; N, 15.79; O, 14.43

2561494-77-5

146676966

Off-white to gray solid powder

1.8

114

2

6

6

33

736

0

O=C(C1C=CC2=C(C=1)OCC(N2)=O)N(CC1C=CC(C(NC2C=CN=CN=2)=O)=CC=1)C1CC1

KOZGEDUWAQFVAV-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H21N5O4/c30-22-13-33-20-11-17(5-8-19(20)27-22)24(32)29(18-6-7-18)12-15-1-3-16(4-2-15)23(31)28-21-9-10-25-14-26-21/h1-5,8-11,14,18H,6-7,12-13H2,(H,27,30)(H,25,26,28,31)

N-Cyclopropyl-3-oxo-N-(4-(pyrimidin-4-ylcarbamoyl)benzyl)-3,4-dihydro-2H-benzo[b][1,4]oxazine-7-carboxamide

UNC6934; UNC-6934; UNC6,934; 2561494-77-5; N-cyclopropyl-3-oxo-N-(4-(pyrimidin-4-ylcarbamoyl)benzyl)-3,4-dihydro-2H-benzo[b][1,4]oxazine-7-carboxamide; CHEMBL5200945; N-cyclopropyl-3-oxo-N-({4-[(pyrimidin-4-yl)carbamoyl]phenyl}methyl)-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazine-7-carboxamide; UNC 6934;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : 25 mg/mL (56.38 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.64 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.64 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.64 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。