Zidesamtinib (NVL-520)

wild-type ROS1; ROS1 G2032R; ROS1 fusions and resistance mutants

Zidesamtinib (72 h) 的平均 IC50 为 0.4 nM，抑制表达野生型 ROS1 融合的七种细胞系的生长[1]。
Zidesamtinib (72 h) 的平均 IC50 为 1.6 nM，抑制六种带有 G2032R 突变的 ROS1 融合细胞系[1]。
Zidesamtinib (72 h) 有效抑制非 G2032R ROS1 突变体，IC50 ≤ 1.5 nM[1]。
Zidesamtinib (10-1000 nM; 4 周）抑制 NIH3T3 细胞中表达 ROS1 与 G2032R 融合和野生型 ROS1 融合的集落形成[1]。

Zidesamtinib（0.04-15 mg/kg；每天口服两次，持续 28 天）在所有剂量≥0.2 mg/kg 的野生型 ROS1 异种移植模型中都能促进肿瘤消退[1]。

生化激酶活性测定[1]
使用PhosphoSens测定法测量纯化激酶的活性。将测试化合物溶解在DMSO中至所需浓度的100倍，并在250nL下以3倍稀释系列分配到384孔板中。将含有2 mmol/L ATP的12.5μL溶液与26μmol/L荧光肽底物AQT0101或AQT0104的缓冲液（50 mmol/L HEPES pH 7.5，0.01%Brij-35，0.5 mmol/L EGTA，10 mmol/L MgCl2）加入板中。通过加入12.5μL溶液引发反应，该溶液在缓冲液中含有0.5 nmol/L ROS1、2 nmol/L ROS 1 G2032R、1 nmol/L TRKA、3 nmol/L TR KB或0.5 nmol/L TRKC激酶结构域（50 mmol/L HEPES pH 7.5，0.01%Brij-35，2%甘油，0.4 mg/mL BSA，0.5 mmol/L EGTA，10 mmol/L MgCl2）。最终浓度为1 mmol/L ATP、13μmol/L肽底物（ROS1和ROS1 G2032R的AQT0101或TRKA、TRKB和TRKC的AQT0104）、0.25至1.5 nmol/L激酶（0.25 nmol/L ROS1；1 nmol/L ROS 1 G2032 R；0.5 nmol/L TRKA；1.5 nmol/L TRKB；或0.5 nmol/L TRKC）、50 mmol/L HEPES pH 7.5、0.01%Brij-35、1%甘油、0.2 mg/mL BSA、0.5 mmol/L EGTA和10 mmol/L MgCl2。将平板密封，在30°C下，用平板阅读器在λ发射=485nm下每2分钟记录荧光信号120分钟。在反应的初始线性阶段，荧光强度随时间的变化是初始速度（v）。IC50由初始速度与对数（抑制剂浓度）回归到四参数逻辑斯谛方程的图计算得出。[1]

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激酶面板筛查[1]
使用放射性标记的[γ-33P]-ATP测量激酶活性的抑制。将含有[γ-33P]-ATP的溶液与NVL-520、335种激酶中的每一种以及相应的激酶底物混合。NVL-520在两种浓度下进行了测定：100 nmol/L和1μmol/L。该测定中ATP的浓度接近每种激酶的米氏常数（KM）。1小时后停止反应，使用闪烁计数器定量33P的掺入。通过33P的残余活性来衡量抑制作用：较低的残余活性表明特定激酶的抑制剂效力较高。基于335激酶筛选，选择24种抑制率>50%的激酶，使用相同的方法在10个浓度的NVL-520下以半对数步骤（3μmol/L、900 nmol/L、300 nmol/L和90 nmol/L，…、0.09 nmol/L）进行IC50测定。IC50由残余活性与对数（抑制剂浓度）回归到四参数逻辑斯谛方程的图确定。

细胞活力测定[1]
协议因测试地点而异。对于测试部位A，将A549或稳定的Ba/F3细胞接种到384孔板中，并在含有10%FBS的完整培养基中以3倍稀释系列加入测试化合物。用抑制剂孵育72小时后，使用CellTiter-Glo试剂测量细胞存活率。未处理的孔作为阴性对照（不抑制增殖），而用高浓度非特异性激酶抑制剂星孢菌素处理的孔则作为阳性对照（完全抑制增殖）。使用四参数逻辑回归从抑制百分比和log（抑制剂浓度）计算IC50。[1]
对于测试部位B，所有抑制剂均以1 mmol/L的DMSO储备制备。使用多点组合试剂分配器，将每孔25μL的完整培养基预先接种到平板上。使用D300数字分配器将抑制剂以指示浓度的2倍分配到384孔板上，每孔25μL的完整培养基中。使用多点组合试剂分配器以每孔1000个细胞的体积25μL接种表达野生型或突变型ROS1融合物的Ba/F3细胞系。将板温育72小时。使用基于WST-8[2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺苯基）-2H-四唑鎓单钠盐]的测定法测量存活率，并在Biotek Synergy 2平板读数器上读取。每种情况都进行了三次检测。使用Microsoft Excel对数据进行归一化，并使用GraphPad Prism中的非线性回归分析计算IC50值。[1]
对于测试部位C，将MGH193-1和MGH9018-1细胞以4000个细胞/孔的速度一式三份铺在96孔板上。经过5天的药物处理后，用CellTiter Glo孵育细胞，并用SpectraMax M5多模微孔板读数器测量发光。GraphPad Prism（GraphPad软件）用于图形化显示数据，并通过使用四参数分析方法的非线性回归模型确定IC50值。[1]
在一些人类癌症细胞系中，我们观察到NVL-520表现出双相剂量-反应行为。我们将第一次剂量反应归因于ROS1抑制引起的靶向生长抑制，将第二次剂量反应归咎于ROS1抑制剂以外途径引起的脱靶细胞毒性。在这种情况下，只报告了第一个IC50值，并指示对靶ROS1的抑制。[1]

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细胞磷酸化测定[1]
对于Ba/F3 TRKB细胞磷酸化测定，将细胞接种到384孔板中，并在全培养基+10%FBS中以3倍稀释系列加入测试化合物。用100 ng/mL BDNF刺激细胞20分钟。使用磷酸化TRKA（Tyr674/675）/磷酸化TRKB（Tyr706/Tyr707）AlphaLISA试剂测量TRK磷酸化。未处理的孔作为阴性对照（无抑制），而用高浓度非特异性激酶抑制剂星孢菌素处理的孔则作为阳性对照（完全抑制）。使用四参数逻辑回归从抑制百分比和抑制剂浓度计算IC50。[1]
表达EZR-ROS1野生型或突变型融合物的NIH3T3细胞在收获前用指定浓度的抑制剂处理3小时。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞，用补充有0.25%脱氧胆酸盐、0.05%SDS和蛋白酶和磷酸酶抑制剂的细胞裂解缓冲液收获细胞。使用皮尔斯BCA蛋白测定法测定蛋白质浓度。使用添加了β-巯基乙醇的Laemelli样品缓冲液在75°C下提取裂解物10分钟，裂解物在4%至20%的预制梯度Bis-tris凝胶上运行。[1]
MGH193-1和MGH9018-1处理6小时。用以下抗体通过蛋白质印迹分析总蛋白裂解物：磷酸-ROS1 Y2274（3078）、ROS1（3287）、磷酸AKT S473（4060）、AKT（4691）、磷酸-ERK1/2 T202/Y204（9101）、ERK1/2（9102）、磷酸-S6 S240/244（5364）、S6（2217）和β-Actin（4970）。[1]

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菌落形成试验[1]
在含有DMSO或抑制剂（10、100或1000 nmol/L的克唑替尼、恩替尼、洛拉替尼或NVL-520）的完全培养基中，用0.8%琼脂糖预接种平板。每种抑制剂都与自己的DMSO条件配对，作为精确的对照。将表达CD74-ROS1或EZR-ROS1野生型或突变型融合的NIH3T3细胞以每0.5 mL琼脂糖2000个细胞的密度，用与底层相同浓度的DMSO或抑制剂，在完全培养基中的0.4%琼脂糖中铺板。培养板孵育4周，每孔每周3次喂食75μL含或不含抑制剂的完全培养基，以匹配每种培养条件，防止琼脂糖干燥。3周和4周后使用GelCount读取板。菌落计数按条件平均，并归一化为成对DMSO条件下的菌落计数。使用Microsoft Excel和GraphPad Prism进行数据分析和可视化。

将CTG-0848模型[1]的肿瘤碎片皮下植入雌性无胸腺裸鼠（Nude-Foxn1nu）体内。剂量分别为0.04、0.2、1、5、15 mg/kg，每日两次灌胃，持续21天。皮下异种移植研究[1]。CTG-0848 PDX。[1]实验操作均按照Champions Oncology机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的指南进行，该机构已获得实验动物护理评估和认证协会（AAALAC）的认证。将CTG-0848模型的肿瘤碎片皮下植入雌性无胸腺裸鼠（Nude-Foxn1nu）左侧腹部。在疗效研究中，当肿瘤生长至 150 至 300 mm³ 后，将小鼠（每组 n = 3–5 只）随机分组，并通过灌胃法每日两次（间隔 12 小时）分别给予赋形剂或 NVL-520。在另一项药代动力学 (PK) 和药效学 (PD) 研究中，当肿瘤生长至 350 至 500 mm³ 后，小鼠接受单次给药或每日两次（连续 5 天）的赋形剂或 NVL-520 给药，并在给药后 1 小时和 12 小时（仅治疗组）采集肿瘤组织和血液样本。经供应商提供的NGS验证，该模型包含杂合CD74–ROS1融合基因。[1]

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\nLu01-0414 PDX。[1]
本研究中所有与动物处理、护理和治疗相关的程序均按照药明康德IACUC批准的指南，并遵循AAALAC的指导进行。将Lu01-0414模型中的肿瘤切片（约30 mm³）皮下植入雌性Balb/c裸鼠右侧腹部。在疗效研究中，待肿瘤平均体积生长至160 mm³后，将小鼠（每组n = 3-5只）随机分组，并分别通过灌胃法（每日两次，间隔12小时）给予赋形剂或NVL-520。在另一项药代动力学和药效学研究中，待肿瘤平均体积生长至492 mm³后，小鼠接受单次给药或每日两次（连续5天）的赋形剂或NVL-520，并在给药后1小时和12小时（仅给药组）采集肿瘤组织和血液样本。经供应商提供的NGS检测验证，该模型包含SDC4-ROS1杂合融合基因，且SDC4 L66残基与ROS1 A1750残基之间存在连锁。[1]

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\nMGH9018-1 PDX。[1]
本研究按照《实验动物饲养和使用指南》的规定进行，并经麻省总医院IACUC批准。将异种移植瘤皮下植入6至8周龄雌性无胸腺裸鼠（Nu/Nu）的侧腹部。小鼠饲养于层流罩内，置于铺有Alpha-Dri垫料的无菌过滤笼中。待肿瘤体积达到150 mm³后，将小鼠随机分组。治疗组分别采用灌胃法，每日一次给予溶于酸性水中的药物溶液（克唑替尼），或每日两次、间隔9/15小时给予溶于20%羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）中的药物溶液（NVL-520）。每周测量两次肿瘤体积，并使用公式：mm³ = 0.5² × L × W² 计算。对于蛋白质测定，荷瘤小鼠按照上述给药方案连续给药3天，并在最后一次给药后3小时收集肿瘤组织进行Western blotting分析。[1]

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\n\nCTG-2532 PDX。[1]
实验操作均按照经AAALAC认证的Champions Oncology的IACUC批准的指南进行。将CTG-2532模型的肿瘤组织块皮下植入雌性无胸腺裸鼠（Nude-Foxn1nu）左侧腹部。在疗效研究中，当肿瘤生长至 150 至 300 mm³ 后，将小鼠（每组 n = 5）分别灌胃给予赋形剂、NVL-520 或瑞波替尼，每日两次（间隔 12 小时），持续 21 天（每日两次，共 21 天），直至耐受为止。瑞波替尼（DC Chemicals 公司）以含有 0.5% 羧甲基纤维素和 1% Tween-80 的悬浮液形式给药。给药悬浮液在 2–8°C 避光条件下持续搅拌保存，最长可达 7 天。在另一项药代动力学 (PK) 和药效学 (PD) 研究中，将 CTG-2532 肿瘤皮下植入小鼠体内，待肿瘤生长至 350 至 550 mm³ 后，给予单次剂量的赋形剂或 NVL-520。分别于给药后 1 小时和 12 小时（仅治疗组）采集肿瘤和血液样本，用于 PK 和 PD 分析。经供应商提供的NGS验证，该模型含有CD74–ROS1 G2032R突变体。\nBa/F3 CD74–ROS1 G2032R CDX。本研究中所有与动物操作、护理和治疗相关的程序均按照Pharmaron公司IACUC批准的指南进行，并遵循AAALAC的指导。将1 × 10⁶个Ba/F3 CD74–ROS1 G2032R细胞皮下接种于6至8周龄的雌性Balb/c裸鼠右侧腹部。当肿瘤平均体积达到约128 mm³时，开始治疗，并定期测量肿瘤大小和体重。[1]

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\n\n\n采用LC/MS测定血浆药物浓度。游离药物浓度通过将药代动力学实验测定的总浓度值乘以小鼠血浆中相应的游离分数（NVL-520 为 7.7%，克唑替尼为 7.6%）计算得出。[1]

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\n\nKp,uu 和颅内研究[1]
\n本研究中所有与动物操作、护理和治疗相关的程序均按照 Pharmaron 的 IACUC 批准的指南进行，并遵循 AAALAC 的指导。[1]
\n\nNVL-520 配制成 1 mg/mL 的 20% HP-β-CD 去离子水混悬液。劳拉替尼配制成 1 mg/mL 的 HCl + 20% HP-β-CD 去离子水溶液。化合物经口给予雄性 Wistar Han 大鼠（每组 n = 3）。 1小时后，收集脑组织样本和血浆，并将脑组织样本在PBS缓冲液中匀浆。脑组织和血浆样本用乙腈沉淀，并离心（4700 rpm，15分钟）。采用LC/MS-MS定量上清液中的药物浓度。使用快速平衡透析法测定游离药物分数。Kp,uu计算为脑组织中游离药物浓度与血浆中游离药物浓度的比值。[1]
\n\nBa/F3 CD74–ROS1 G2032R细胞用含有萤火虫荧光素酶基因和新霉素抗性标记的病毒颗粒进行转导。感染细胞经新霉素筛选，并通过有限稀释法建立单克隆培养。转化成功的细胞通过Sanger测序和生物发光法进行验证。在体内研究中，将 1 × 10⁵ 个 Ba/F3 CD74–ROS1 G2032R 荧光素酶细胞立体定位植入 6 至 8 周龄雌性 Balb/c 裸鼠的右侧前脑。5 天后，根据平均生物发光信号将小鼠随机分为三组，每组 n = 7–10 只，分别接受载体或 NVL-520（2 mg/kg，每日两次）口服给药。定期测量生物发光和体重，直至研究结束（治疗开始后 61 天）或动物达到安乐死标准。\n

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[1]. NVL-520 is a selective, TRK-sparing, and brain-penetrant inhibitor of ROS1 fusions and secondary resistance mutations. Cancer Discov. 2022 Dec 13;CD-22-0968.

齐德沙替尼是一种口服的选择性受体酪氨酸激酶c-ros癌基因1 (ROS1)抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。口服后，齐德沙替尼靶向并结合ROS1的野生型、点突变体和融合蛋白，从而抑制ROS1驱动的肿瘤细胞增殖，包括携带某些ROS1耐药突变的肿瘤细胞，例如溶剂前沿突变G2032R以及S1986Y/F、L2026M和D2033N耐药突变。抑制ROS1可破坏下游信号通路，并抑制ROS1过表达、重排或突变的肿瘤细胞生长。ROS1在某些癌细胞中过表达，在癌细胞的生长和存活中起着关键作用。 NVL-520 能够穿透血脑屏障 (BBB)。

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NVL-520 的临床前综合特性包括：对 ROS1 和多种 ROS1 耐药突变具有强效靶向性、对 ROS1 G2032R 相对于 TRK 具有高选择性以及能够穿透血脑屏障，这些特性标志着一种独特的 ROS1 TKI 的开发，它有可能克服早期 TKI 对 ROS1 融合阳性患者的局限性。[1]

C22H22FN7O

419.46

C, 63.00; H, 5.29; F, 4.53; N, 23.37; O, 3.81

2739829-00-4

2739829-00-4

166560233

Typically exists as white to off-white solids at room temperature

2.8

96.7Ų

1

7

1

31

629

1

CCN1C2=C(CC3=NN(N=C3C4=C(C=C(C=C4)F)[C@H](OC5=C(N=CC2=C5)N)C)C)C=N1

DTWUUAFTYSMNQX-GFCCVEGCSA-N

InChI=1S/C22H22FN7O/c1-4-30-21-13(11-26-30)7-18-20(28-29(3)27-18)16-6-5-15(23)9-17(16)12(2)31-19-8-14(21)10-25-22(19)24/h5-6,8-12H,4,7H2,1-3H3,(H2,24,25)/t12-/m1/s1

(19R)-3-ethyl-16-fluoro-10,19-dimethyl-20-oxa-3,4,9,10,11,23-hexazapentacyclo[19.3.1.02,6.08,12.013,18]pentacosa-1(25),2(6),4,8,11,13(18),14,16,21,23-decaen-22-amine

NVL520; NVL 520; NVL-520; Zidesamtinib; NVL-520; 2739829-00-4; NVL520; zidesamtinib [INN]; MX5KQV5XHC; Zidesamtinib [WHO-DD]; ZIDESAMTINIB [USAN];

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~119.20 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (2.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 12.5 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (2.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 12.5 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 1.25 mg/mL (2.98 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 12.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。