A-485

A-485 targets p300 (IC50 = 9.8 nM for p300-BHC) and CBP (IC50 = 2.6 nM for CBP-BHC). [1]
Surface plasmon resonance showed binding to p300-HAT with KD = 15 ± 1 nM. [1]

IC50: 9.8 nM (p300), 2.6 nM (CBP)

A-485 处理前列腺癌 PC-3 细胞 3 小时后，H3K27Ac 水平呈剂量依赖性降低，半数有效浓度 (EC50) 为 73 nM。A-485 治疗对 p300 或 CBP 蛋白水平无影响。A-485 对大多数多发性骨髓瘤细胞系以及少数急性髓系白血病和非霍奇金淋巴瘤细胞系均表现出强效作用，这些血液肿瘤细胞系对 A-485 的敏感性最高。在所有五种前列腺癌细胞系中，A-485 均导致 H3K27Ac 水平出现类似的降低[1]。

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A-485 选择性地抑制了谱系特异性肿瘤类型的增殖，包括血液系统恶性肿瘤（多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、非霍奇金淋巴瘤）和雄激素受体阳性前列腺癌，但对雄激素受体阴性前列腺癌细胞系无抑制作用。[1]
在 PC-3 细胞中，A-485 处理（3 小时）导致 H3K27Ac 水平呈剂量依赖性降低，EC50 = 73 nM，但对 H3K9Ac 无影响（EC50 > 10,000 nM）。同时观察到 H3K18Ac 水平的抑制与 H3K27Ac 类似。A-486 无活性。 [1]
A-485（24 小时）对 LnCaP-FGC 细胞中 DHT 刺激的 PSA 表达的抑制作用强于恩扎卢胺，并且还能抑制 TMPRSS2 和 SLC45A3 基因的表达。[1]
A-485 可降低雄激素耗竭的 22Rv1 细胞中 c-Myc 的表达，而恩扎卢胺则无此作用。[1]
在 PC-3 细胞中，A-485 处理（3 小时）选择性地抑制了 H3K27Ac 和 H3K18Ac，而对其他表观遗传标记（H3K4me3、H3K9Ac、H3K9me3、H3K36me2、H3K79me2、H4K20me2、H3K27me3、H4K16Ac、H3K4me1、H3K9me2）的抑制作用较弱。 [1]
质谱分析证实，A-485 导致 p300/CBP 激活环内多个乙酰化位点（例如 K1499Ac/K1535Ac）显著减少。[1]
p300/CBP 的 siRNA 敲低证实了 AR+ LnCaP-FGC 细胞的生长受到抑制，并且 H3K18Ac 和 H3K27Ac 水平受到抑制，但 H3K9Ac 水平未受影响。[1]

在雄性SCID小鼠体内，每日两次腹腔注射A-485，治疗21天后，肿瘤生长抑制率达54%（与载体对照组相比，P<0.005）。此外，连续七天给予A-485后，给药三小时即可降低MYC和AR依赖性基因SLC45A3的mRNA水平，并降低MYC蛋白水平，表明A-485在体内抑制p300介导的转录活性。这些结果均在荷瘤小鼠中获得。然而，在给药第七天，给药后16小时血浆和肿瘤组织中A-485的浓度低于给药后3小时的浓度。完成 A-485 给药方案后，动物体重略微下降 9%，并迅速恢复[1]。

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A-485 抑制了 LuCaP-77 CR（去势抵抗性前列腺癌）异种移植模型中的肿瘤生长。在 SCID 雄性小鼠体内建立肿瘤后，每天两次腹腔注射 A-485，持续 21 天，可诱导 54% 的肿瘤生长抑制率 (TGI)（与载体对照组相比，p < 0.005）。[1]
在荷瘤动物中连续 7 天给予 A-485 后，给药后 3 小时，雄激素受体 (AR) 依赖性基因 SLC45A3 和 c-Myc 的 mRNA 水平以及 c-Myc 蛋白水平均降低。给药后 16 小时（第 7 天），血浆和肿瘤中的 A-485 药物浓度下降，SLC45A3 和 c-Myc 的表达恢复至治疗前水平。 [1]

p300 和 CBP 生化活性测定 [1]
采用时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 法检测组蛋白 H4 合成肽赖氨酸残基的乙酰化，从而测定 p300-BHC 和 CBP-BHC 结构域的乙酰转移酶活性。反应体系为 10 μL，包含 100 mM HEPES（pH 7.9）、80 μM EDTA、40 μg/mL BSA、100 mM KCl、1 mM DTT 和 0.01% Triton X-100。由于本实验中使用了 EDTA，所用 BHC 蛋白的结构完整性可能受到影响，因为该蛋白含有多个含锌结构域（C/H3、PHD 和 RING）。因此，p300-BHC活性测定也分别在完全不含EDTA的纯化p300-BHC和不含EDTA的测定缓冲液中进行。将每种目标化合物溶解于DMSO中，并使用Labcyte Echo分液器以50 nL的量分装至白色384孔低容量板中，浓度范围为50 μM至0.00075 μM，进行3倍稀释。将0.6 nM的p300-BHC或CBP-BHC蛋白与A-485或A-486预孵育30分钟。加入5 μL浓度为2 μM的生物素标记的合成组蛋白H4肽和0.5 μM的乙酰辅酶A启动反应。在湿润室中于室温孵育 1 小时后，加入 10 μL 3 nM LANCE Ultra 铕标记抗乙酰化组蛋白 H4 赖氨酸抗体和 900 nM LANCE Ultra ULight-链霉亲和素（溶于 LANCE 检测缓冲液）终止反应。使用 Perkin Elmer Envision 荧光共振能量转移仪进行 TR-FRET 测量，激光激发波长为 335 nm，发射波长分别为 665 nm 和 620 nm。乙酰辅酶 A 竞争实验的步骤与上述相同，只是乙酰辅酶 A 的浓度从 0.078 μM 变化至 10 μM。使用 Prism GraphPad 5 软件，通过对浓度/抑制反应曲线进行 S 形拟合计算抑制的 IC50 值。

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p300 AlphaLISA 肽结合分析 [1]
使用 AlphaLISA 技术评估 P300-BHC 与组蛋白 H4 合成肽的结合。在白色 384 孔板中进行 40 μL 反应体系，反应缓冲液包含 100 mM HEPES（pH 7.9）、80 μM EDTA、40 μg/mL BSA、100 mM KCl、1 mM DTT 和 0.01% Triton X-100。将 10 μL 生物素标记的 H4 肽加入到 10 μL P300-BHC 中（最终浓度分别为 15 nM 和 115 nM），并在室温下孵育 1 小时。为了证明生物素标记肽与AlphaLISA信号竞争后信号降低，将10 μL未标记的H4肽和生物素标记的H4肽的2倍混合物（终浓度分别为300 μM和115 nM）加入到20 μL P300-BHC（终浓度为15 nM）中，并在室温下孵育1小时。然后，将20 μL含有镍螯合AlphaLISA受体磁珠和AlphaScreen链霉亲和素供体磁珠的2倍混合物（终浓度均为20 μg/mL）加入到酶-肽复合物中，并在室温下孵育1.5小时。使用 Perkin Elmer Envision 仪器，激光激发波长为 680 nm，发射波长为 615 nm，进行 AlphaLISA 计数。

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热位移分析 [1]
使用 Roche LightCycler 480 仪器，在裂解缓冲液（如上所述）中，以 EDTA 纯化的 p300-BHC 进行热位移分析。Sypro Orange 染料购自 Invitrogen，为 5000X 储备液。该分析在 20mM HEPES（pH 7.5）、50mM NaCl、1mM TCEP、2% DMSO 和 1:500 稀释的染料中进行，蛋白质浓度为 1.5 μM。制备 50X DMSO 储备液，并加入 Lys CoA 和 A-485 样品，使最终 DMSO 浓度为 2% (v/v)。所有样品均进行四重复实验。

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采用时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）法检测生物素标记的组蛋白H4肽段的乙酰化水平。A-485对p300-BHC（溴结构域-HAT-C/H3结构域）的抑制IC50值为9.8 nM，对CBP-BHC的抑制IC50值为2.6 nM。在不含EDTA的条件下也观察到了类似的结果。[1]
单周期模式的表面等离子共振（SPR）实验表明，A-485与p300-HAT的结合解离常数（KD）为15 ± 1 nM，且解离速率较慢（koff = 1.3 ± 0.01e-03/s，t1/2 = 531 ± 4.5 s）。 A-486 的结合力比 p300-BHC 弱约 1000 倍（KD = 20,000 ± 1000 nM），且解离速率极快（koff > 0.3/s）。[1]
热稳定性分析 (TSA) 表明，Lys-CoA 和 A-485 均可使 p300-BHC 的热稳定性提高 5.8°C。[1]
人 p300 HAT 结构域（1287-1666，内部环缺失 1523-1554，以及 K1637R 和 M1652G 突变）与 A-485 复合物的 X 射线晶体结构已在 1.95 Å 分辨率下解析，证实 A-485 的结合位点与乙酰辅酶 A 的结合位点重叠。 [1]
基于AlphaLISA的肽底物结合实验表明，未标记的肽而非A-485会竞争结合位点，证实A-485与肽底物不竞争结合位点。[1]

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基于高内涵显微镜的检测：用化合物处理 PC-3 细胞 3 小时，然后进行组蛋白修饰检测。检测了H3K27Ac、H3K18Ac、H3K9Ac和其他表观遗传标记的荧光强度。A-485可降低H3K27Ac的表达（EC50 = 73 nM），但对H3K9Ac无影响（EC50 > 10,000 nM）。[1]
蛋白质印迹分析：用化合物处理细胞，裂解细胞，并用针对H3K27Ac、H3K18Ac、H3K9Ac、p300、CBP和c-Myc的抗体进行检测。A-485处理不改变p300或CBP的蛋白水平。[1]
定量RT-PCR (qRT-PCR)：去除雄激素后，用DHT刺激细胞，并用化合物处理细胞。提取RNA并分析PSA、TMPRSS2、SLC45A3和c-Myc的表达。 A-485抑制DHT刺激的PSA表达的能力强于恩扎卢胺。[1]
染色质免疫沉淀(ChIP)：用DHT刺激LnCaP-FGC细胞6小时后，分别用A-485或恩扎卢胺处理。检测PSA增强子雄激素反应元件(ARE)上的H3K27Ac沉积和AR占位。A-485降低了H3K27Ac结合，但未降低AR占位，而恩扎卢胺则同时降低了这两项指标。[1]
细胞增殖实验：使用siRNA敲低或化合物处理后，通过3H-胸苷掺入法（针对LnCaP-FGC细胞）评估124种癌细胞系的增殖情况。A-485在血液肿瘤（多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、非霍奇金淋巴瘤）和AR阳性前列腺癌细胞系中表现出最广泛的敏感性。 [1]
siRNA 敲低：将 LnCaP-FGC 细胞在缺乏雄激素的培养基中培养 72 小时，然后通过核转染导入针对 p300/CBP 的 siRNA。24 小时后，用米勃龙处理细胞，并检测 3H-胸苷掺入情况或进行蛋白质印迹分析。[1]

将细胞系接种于 96 孔或 384 孔板中，并使其贴壁 24 小时。然后用 A-485 处理细胞 3、4 或 5 天。实验重复三次，并根据制造商的建议，使用细胞活力检测试剂盒测定活细胞比例。对于胸苷掺入实验，用 A-485 处理细胞 1、2、3 或 4 天。在实验时间点前 24 小时，加入氚标记的胸苷，并将细胞继续孵育 24 小时。然后在滤板上分离基因组 DNA。

LuCap-77 CR异种移植疗效研究。[1]
本研究采用LuCap-77 CR前列腺PDX模型。将供体肿瘤组织解离后，于第0天以0.2 ml的体积，按1:2的比例混合注射到16周龄雄性CB-17 SCID小鼠的右侧腹部。接种后第26天，将肿瘤组织进行大小匹配，平均肿瘤体积为211 ± 3 (SEM) mm³，并于第28天开始给药。所有小鼠均纳入分析。使用Studylog软件，根据肿瘤体积将小鼠随机分为1个治疗组。每周计算两次肿瘤体积。使用电子游标卡尺测量肿瘤的长度(L)和宽度(W)，并使用Study Director 3.1版本软件，根据以下公式计算肿瘤体积：V = L × W²/2。本研究采用部分盲法。在研究期间，主要研究者负责随机分组并测量肿瘤体积，而另一名技术人员负责配制和给药化合物。肿瘤生长抑制率（TGI%）根据以下公式计算：TGI% =（对照组平均肿瘤体积 – 治疗组平均肿瘤体积）/ 对照组平均肿瘤体积 × 100。

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LuCap-77 CR 异种移植瘤药效学研究 [1]
在 SCID 小鼠中建立 LuCap-77 CR 异种移植瘤模型，并按照上述“LuCap-77 CR 异种移植瘤生长研究”中的方法，用 A-485 给药 7 天。末次给药 3 小时后，收集肿瘤组织并用干冰速冻。为了提取 RNA，使用 Precellys 24 均质器将肿瘤组织在 96 孔 RNA 离心管试剂盒的裂解液中均质，并按照制造商的说明进行后续处理。对于蛋白质印迹分析，将肿瘤组织在冰冷的裂解缓冲液中匀浆（如“蛋白质印迹”部分所述），并在20,000 g下离心20分钟。然后按照上述方法处理上清液进行蛋白质印迹分析。

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LuCaP-77 CR 去势抵抗性前列腺癌患者来源的异种移植模型：在SCID雄性小鼠中建立肿瘤模型。肿瘤建立后，通过腹腔注射（IP）给予A-485，每日两次（BID），持续21天。观察到肿瘤生长抑制率（TGI）为54%（与载体组相比，p < 0.005）。[1]
为了进行药效学评估，按照BID方案，对荷瘤动物连续7天给予A-485。在末次给药后3小时和16小时切除肿瘤，并进行mRNA和蛋白质分析。[1]

在每日两次给药21天后，携带LuCaP-77 CR肿瘤的小鼠经A-485治疗后体重减轻了9%。给药方案结束后，动物迅速恢复。[1]

[1]. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 2017 Oct 5;550(7674):128-132.

组蛋白乙酰转移酶 (HAT) 和组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 催化的蛋白质动态可逆乙酰化是基因转录的主要表观遗传调控机制，并与多种疾病相关。目前，组蛋白去乙酰化酶抑制剂已被批准用于治疗某些癌症，但类药组蛋白乙酰转移酶抑制剂的研发进展缓慢。组蛋白乙酰转移酶同源物 p300 和 CREB 结合蛋白 (CBP) 是关键的转录共激活因子，对多种细胞过程至关重要，并与包括癌症在内的人类病理状况密切相关。目前针对 p300 和 CBP 组蛋白乙酰转移酶结构域的抑制剂，包括天然产物、双底物类似物以及广泛使用的小分子 C646，均缺乏效力或选择性。本文介绍了一种高效、高选择性且具有药理活性的 p300 和 CBP 催化抑制剂 A-485。我们解析了小分子与p300催化活性位点结合的高分辨率（1.95 Å）共晶体结构，并证实A-485与乙酰辅酶A竞争性结合。A-485选择性抑制谱系特异性肿瘤的增殖，包括多种血液系统恶性肿瘤和雄激素受体阳性前列腺癌。A-485抑制雄激素敏感型和去势抵抗型前列腺癌中的雄激素受体转录程序，并在去势抵抗型异种移植模型中抑制肿瘤生长。这些结果表明，利用小分子抑制剂选择性靶向组蛋白乙酰转移酶的催化活性是可行的，这可能为转录激活因子驱动的恶性肿瘤和疾病提供有效的治疗方法。 [1] 总之，我们通过鉴定出A-485，克服了开发类药物HAT抑制剂这一长期难题。A-485是一种首创的高效、选择性强、具有细胞和体内活性的p300/CBP催化抑制剂。类似的方法可以更广泛地应用于其他HAT抑制剂的开发。此外，这些结果凸显了靶向p300/CBP HAT活性的治疗价值，为评估HAT抑制剂在多种人类疾病中的临床应用价值提供了重要进展。[1]

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A-485是一种首创的高效、选择性强、类药物的p300/CBP催化抑制剂，具有乙酰辅酶A竞争性。它的效力至少比之前报道的p300细胞渗透性工具化合物（包括C646）高1000倍。 [1]
A-485 在 10 μM 浓度下不抑制其他 HAT 家族成员（PCAF、HAT1、MYST3、MYST4、TIP60、GCN5L2），且对 BET 溴结构域蛋白和 150 多个非表观遗传靶点具有选择性。它仅在 10 μM 浓度下与多巴胺和血清素转运蛋白表现出显著结合（>90%），对 Plk3 的抑制作用较弱（IC50 = 2.7 μM）。A-485 无法达到显著的脑暴露量，因此不太可能在体内调节这些转运蛋白。[1]
p300 是雄激素受体 (AR) 活性的关键共激活因子，在前列腺癌进展过程中表达上调。A-485 可抑制雄激素敏感型和去势抵抗型前列腺癌中的 AR 转录程序。 [1]
A-485 还抑制了 c-Myc 的表达，而 c-Myc 的表达与前列腺癌的进展密切相关。[1]

C25H24F4N4O5

536.4755

536.168

C, 55.97; H, 4.51; F, 14.17; N, 10.44; O, 14.91

1889279-16-6

1889279-16-6

118958122

White to off-white solid powder

3.3

108Ų

2

9

6

38

941

2

C[C@@H](C(F)(F)F)N(CC1=CC=C(C=C1)F)C(=O)CN2C(=O)[C@]3(CCC4=C3C=CC(=C4)NC(=O)NC)OC2=O

VRVJKILQRBSEAG-LFPIHBKWSA-N

InChI=1S/C25H24F4N4O5/c1-14(25(27,28)29)32(12-15-3-5-17(26)6-4-15)20(34)13-33-21(35)24(38-23(33)37)10-9-16-11-18(7-8-19(16)24)31-22(36)30-2/h3-8,11,14H,9-10,12-13H2,1-2H3,(H2,30,31,36)/t14-,24+/m0/s1

N-(4-fluorobenzyl)-2-((R)-5-(3-methylureido)-2',4'-dioxo-2,3-dihydrospiro[indene-1,5'-oxazolidin]-3'-yl)-N-((S)-1,1,1-trifluoropropan-2-yl)acetamide

A-485; A 485; N-(4-Fluorobenzyl)-2-((R)-5-(3-methylureido)-2',4'-dioxo-2,3-dihydrospiro[indene-1,5'-oxazolidin]-3'-yl)-N-((S)-1,1,1-trifluoropropan-2-yl)acetamide; (1R)-N-[(4-Fluorophenyl)methyl]-2,3-dihydro-5-[[(methylamino)carbonyl]amino]-2',4'-dioxo-N-[(1S)-2,2,2-trifluoro-1-methylethyl]spiro[1H-indene-1,5'-oxazolidine]-3'-acetamide; CHEMBL4282264; A485.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~125 mg/mL (~233.00 mM)

配方 1 中的溶解度: 11 mg/mL (20.50 mM) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.88 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.88 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.88 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。