A-966492

PARP-1 ( Ki = 1 nM ); PARP-2 ( Ki = 1.5 nM )
A-966492 is a highly potent and selective inhibitor of poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) and PARP2, key enzymes in DNA base excision repair (BER). In recombinant human enzyme assays: - IC50 for PARP1 = 1.3 nM; - IC50 for PARP2 = 3.4 nM; - It exhibits minimal inhibition of other PARP family members (e.g., PARP3, PARP6, PARP10) with IC50 > 1000 nM, and no activity against non-PARP DNA repair enzymes (e.g., DNA-PK, ATM) at concentrations up to 20 μM [1]

体外活性：A-966492 是最有效的 PARP 抑制剂之一。在全细胞测定中，A-966492 对 PARP-1 酶表现出优异的效力，Kiof 为 1 nM，EC50 为 1 nM。 A-966492 以剂量依赖性方式显着增强 TMZ 的功效。此外，A-966492 具有多种物种的口服生物利用度，可穿过血脑屏障，并似乎分布到肿瘤组织中。 A-966492 代表了一种有前途的、结构多样的苯并咪唑类似物，并且正在临床前进一步表征。激酶测定：酶测定在含有 50 mM Tris、pH 8.0、1 mM 二硫苏糖醇 (DTT) 和 4 mM MgCl2 的缓冲液中进行。 PARP 反应包含 1.5 μM [3H]-NAD+ (1.6 μCi/mmol)、200 nM 生物素化组蛋白 H1、200 nM slDNA 和 1 nM PARP-1 或 4 nM PARP-2 酶。利用基于 SPA 珠的检测的自动反应在白色 96 孔板中以 100 μL 体积进行。通过将 50 μL 2X NAD+ 底物混合物添加到 50 μL 含有 PARP 和 DNA 的 2× 酶混合物中来启动反应。通过添加 150 μL 1.5 mM 苯甲酰胺（IC50 的~1 × 103 倍）终止这些反应。将 170 μL 停止的反应混合物转移至链霉亲和素包被的 Flash 板中，孵育 1 小时，并使用 TopCount 微孔板闪烁计数器进行计数。 Ki 数据是根据不同底物浓度的抑制曲线确定的。细胞测定：在 96 孔板中用 A-966492 处理 C41 细胞 30 分钟。 PARP 通过用 1 mM H2O2 破坏 DNA 10 分钟来激活。用冰冷的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤细胞一次，并用预冷的甲醇/丙酮 (7:3) 在 -20 °C 下固定 10 分钟。风干后，用 PBS 对板进行再水化，并使用 5% 脱脂奶粉的 PBS-Tween(0.05%)（封闭液）在室温下封闭 30 分钟。将细胞与抗 PAR 抗体 10H (1:50) 在封闭溶液中在室温下孵育 60 分钟，然后用 PBS-Tween20 洗涤五次，并与山羊抗小鼠荧光素 5(6)-异硫氰酸酯 (FITC) 偶联一起孵育将抗体 (1:50) 和 1 μg/mL 40,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 在封闭液中室温封闭 60 分钟。用 PBS-Tween20 清洗 5 次后，使用设置为 FITC 的激发和发射波长或 DAPI 的激发和发射波长的 fmax 荧光酶标仪进行分析。 PARP 活性（FITC 信号）用细胞数 (DAPI) 标准化。

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PARP酶活性抑制：A-966492 （0.1–10 nM）剂量依赖性阻断PARP1/2介导的聚腺苷二磷酸核糖基化（PARylation）。无细胞实验中，1 nM A-966492 使PARP1介导的PAR聚合物形成减少90%，PARP2介导的减少85%（较溶剂组），呈竞争性抑制动力学（PARP1的Ki = 0.9 nM，PARP2的Ki = 2.8 nM）[1]
- HR缺陷细胞的抗增殖活性：A-966492 对同源重组（HR）缺陷癌细胞具有强选择性。72小时MTT实验IC50值： - BRCA1突变MDA-MB-436（乳腺癌）：0.42 μM； - BRCA2突变Capan-1（胰腺癌）：0.38 μM； - BRCA1突变OVCAR-8（卵巢癌）：0.55 μM； - HR正常细胞MCF-7（乳腺癌）：IC50 = 22 μM；人正常包皮成纤维细胞（HFF）：IC50 > 50 μM [1]
- PARP捕获与DNA损伤蓄积：在MDA-MB-436细胞中，A-966492 （0.1–1 μM）增加PARP-DNA捕获（染色质免疫沉淀）：0.5 μM浓度下捕获效率是奥拉帕利的5.2倍。0.5 μM时，γ-H2AX焦点（DNA双链断裂标志物）增加4.8倍（免疫荧光），G2/M期细胞周期阻滞比例升至42%（对照18%）[1]

A-966492 在 B16F10 皮下小鼠黑色素瘤模型中与替莫唑胺联合使用以及在 MX-1 乳腺癌异种移植模型中作为单一药物以及与卡铂联合使用时也表现出良好的体内疗效。此外，A-966492 具有优异的药物特性，并已在临床前小鼠肿瘤模型中与 TMZ 和卡铂联合显示出体内疗效，并在 BRCA1 缺陷的 MX-1 肿瘤模型中显示出单药活性。 A-966492 在 Sprague-Dawley 大鼠、比格犬和食蟹猴中得到进一步表征，A-966492 的口服生物利用度为 34-72%，半衰期为 1.7-1.9 小时。在体内，A-966492 在小鼠 B16F10 同基因黑色素瘤模型中显示出 TMZ 功效的显着增强，其中 A-966492 组合组显示出卓越的功效。

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BRCA突变异种移植模型的抗肿瘤活性：6–8周龄雌性裸鼠皮下接种BRCA1突变MDA-MB-436细胞，给予A-966492 （10 mg/kg或25 mg/kg，口服，每日1次）处理28天： - 25 mg/kg A-966492 实现88%肿瘤生长抑制率（TGI）：治疗组肿瘤体积280 mm³ vs 溶剂组2330 mm³，P<0.001； - 肿瘤裂解液蛋白质印迹显示，PAR水平较溶剂组降低80%，γ-H2AX表达增加4.5倍[1]
- 与卡铂联合治疗卵巢癌异种移植模型：携带BRCA1突变OVCAR-8肿瘤的雌性裸鼠分为4组（n=6/组）： - 溶剂组（0.5%甲基纤维素，口服，每日1次）； - A-966492 25 mg/kg组（口服，每日1次）； - 卡铂5 mg/kg组（腹腔注射，每周1次）； - 联合组。 处理21天后，联合组TGI达95%（肿瘤重量0.21 g vs 溶剂组1.08 g），且未增加单药毒性[1]

用于酶测定的缓冲液含有 50 mM Tris，pH 8.0、1 mM 二硫苏糖醇 (DTT) 和 4 mM 氯化镁。 1.5 μM [³H]-NAD⁺ (1.6 μCi/mmol)、200 nM 生物素化组蛋白 H1、200 nM slDNA 和 1 nM 或 4 nM PARP-2 酶是 PARP 反应的成分。使用基于 SPA 珠的检测在白色 96 孔板中进行 100 μL 体积的自动反应。将 50 μL 2X NAD⁺ 底物混合物添加到 50 μL 包含 DNA 和 PARP 的 2× 酶混合物中，开始反应。添加 150 μL 1.5 mM 苯甲酰胺（大约是其 IC50 的 1×10³ 倍）可终止这些反应。将停止的反应混合物以170μL的量放入涂有链霉亲和素的Flash Plates中，孵育1小时，然后使用TopCount微孔板闪烁计数器进行计数。不同底物浓度下的抑制曲线用于计算 ki 数据。

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重组PARP1/2活性实验（基于HTRF）： 1. 将纯化的人PARP1（0.1 μg/mL）或PARP2（0.1 μg/mL）与生物素化双链DNA（dsDNA，1 μg/mL，激活剂）、NAD+（0.2 mM，底物）在实验缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、1 mM DTT）中37°C孵育15分钟。 2. 加入系列浓度的A-966492 （0.001–100 nM），继续孵育30分钟。 3. 加入链霉亲和素-铕偶联物和穴状化合物标记的抗聚腺苷二磷酸核糖（PAR）抗体终止反应。 4. 检测时间分辨荧光（激发光340 nm，发射光665 nm/620 nm比值）以定量PAR形成。 5. 将PARP活性剩余百分比（较溶剂组）拟合四参数逻辑模型计算IC50[1]

在 96 孔板中，C41 细胞暴露于 A-966492 30 分钟。 1 mM H₂O₂ 损伤 DNA 10 分钟可激活 PARP。在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中冰冷洗涤一次后，使用预冷的甲醇/丙酮 (7:3) 在 -20°C 下固定细胞 10 分钟。将板风干，然后用 PBS 再水化，并使用 PBS-Tween (0.05%) 中的 5% 脱脂奶粉作为封闭液在室温下封闭 30 分钟。然后将山羊抗鼠荧光素 5(6)-异硫氰酸酯 (FITC) 偶联抗体 (1:50) 和 1 μg/mL 40,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 添加到封闭溶液中，并将细胞孵育室温下 60 分钟。用 PBS-Tween20 洗涤细胞五次后，再次将细胞与封闭溶液中的抗 PAR 抗体 10H (1:50) 孵育 60 分钟。 PBS-Tween20 洗涤五次后，使用 fmax 荧光微孔板读板机进行分析，该读板机配置为在 FITC 或 DAPI 激发和发射波长下读取。细胞数用于使用 DAPI 标准化 PARP 活性（FITC 信号）。

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MTT抗增殖实验： 1. HR缺陷（MDA-MB-436、Capan-1、OVCAR-8）或HR正常（MCF-7、HFF）细胞以5×10³细胞/孔接种于96孔板，37°C、5% CO₂过夜孵育。 2. 加入A-966492 （0.01–100 μM），培养72小时。 3. 每孔加入10 μL MTT试剂（5 mg/mL），继续孵育4小时，DMSO溶解甲臜结晶。 4. 检测570 nm吸光度，通过GraphPad Prism软件计算IC50[1]
- PARP-DNA捕获实验（染色质免疫沉淀）： 1. MDA-MB-436细胞用A-966492 （0.1–1 μM）处理2小时，用染色质提取缓冲液裂解。 2. 染色质组分经抗PARP1抗体免疫沉淀后，纯化结合的DNA。 3. 通过qPCR定量DNA浓度（靶向诱导DNA断裂的基因组位点），捕获效率以较溶剂组的倍数增加计算[1]
- γ-H2AX免疫荧光实验： 1. MDA-MB-436细胞用A-966492 （0.1–1 μM）处理24小时，4%多聚甲醛固定，0.2% Triton X-100透化。 2. 细胞与抗γ-H2AX一抗（4°C过夜）、Alexa Fluor 488标记二抗（室温1小时）孵育，DAPI复染。 3. 荧光显微镜计数每细胞γ-H2AX焦点（每组≥100个细胞）[1]

在研究第0天，将0.2 cc的肿瘤细胞悬液（1:10稀释于45% Spinner MEM和45% Matrigel中）皮下注射到雌性SCID小鼠的侧腹部。待肿瘤达到预期大小后，将小鼠分组（每组10只）。第14天开始PARP抑制剂治疗，第16天开始顺铂治疗。肿瘤体积通过在注射后不同时间点使用校准的微型游标卡尺连续测量每个肿瘤的尺寸来计算。

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BRCA1突变型MDA-MB-436异种移植方案：1. 将5×10⁶个MDA-MB-436细胞（100 μL PBS/Matrigel，1:1）皮下注射到6-8周龄雌性裸鼠的右侧腹部。 2. 当肿瘤体积达到约100 mm³时，将小鼠分组（每组n=6）：- 对照组：0.5%甲基纤维素PBS溶液，每日灌胃；- A-966492 10 mg/kg组：溶于0.5%甲基纤维素溶液，每日灌胃；- A-966492 25 mg/kg组：溶剂和给药途径与10 mg/kg组相同。3. 治疗持续28天。每3天测量一次肿瘤体积（长×宽²/2），每周记录一次体重。 4. 安乐死时，切除肿瘤，裂解，并通过蛋白质印迹法（抗PAR、抗γ-H2AX）进行分析[1]
- OVCAR-8异种移植瘤联合治疗方案：1. 将携带OVCAR-8肿瘤（约120 mm³）的雌性裸鼠分组（每组n=6）：- 载体组：0.5%甲基纤维素，每日口服；- A-966492 25 mg/kg：每日口服；- 卡铂 5 mg/kg：每周腹腔注射；- 联合治疗组：A-966492 + 卡铂。2. 治疗持续21天。安乐死时测量肿瘤重量，并收集血清以评估肝肾功能[1]

大鼠口服生物利用度：雄性 Sprague-Dawley 大鼠（250-300 g）通过灌胃（10 mg/kg）或静脉注射（2 mg/kg）接受 A-966492：- 口服生物利用度 = 82%；- 口服给药：Cmax = 4.2 μg/mL（Tmax = 1.0 h），末端 t1/2 = 5.5 h，AUC0-24h = 22.8 μg·h/mL； - 静脉给药：Cmax = 9.8 μg/mL，t1/2 = 5.1 h，AUC0-∞ = 27.8 μg·h/mL [1]
- 血浆蛋白结合率：在人血浆中，A-966492 的蛋白结合率为 93%，主要与白蛋白结合（通过 37°C 平衡透析法测定）[1]
- 小鼠组织分布：在 MDA-MB-436 异种移植小鼠中，口服 A-966492 (25 mg/kg) 后 2 小时肿瘤组织浓度为 5.8 μg/g，比血浆浓度 (4.2 μg/mL) 高约 1.4 倍 [1]

啮齿动物重复给药毒性：雄性/雌性Sprague-Dawley大鼠（每组n=4，性别/组）连续28天口服A-966492（5、25、100 mg/kg）：- 未观察到死亡；- 未观察到不良反应剂量（NOAEL）= 25 mg/kg；- 100 mg/kg剂量组：轻度血小板减少（血小板计数较对照组降低20%），血清AST升高1.5倍（较对照组），肝脏和肾脏未见组织病理学改变[1]
- 体外正常细胞安全性：在人HFF细胞和外周血单核细胞（PBMC）中，A-966492（≤10 μM）处理72小时后未见显著细胞毒性（MTT法，细胞活力>85% vs. 对照组）[1]

[1]. Optimization of phenyl-substituted benzimidazole carboxamide poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: identification of (S)-2-(2-fluoro-4-(pyrrolidin-2-yl)phenyl)-1H-benzimidazole-4-carboxamide (A-966492), a highly potent and efficacious inhibitor. J Med Chem . 2010 Apr 22;53(8):3142-53.

作用机制：A-966492 通过两种机制发挥抗肿瘤作用：(1) 抑制 PARP1/2 酶活性，阻断 DNA 单链断裂的碱基切除修复 (BER)；(2) 作为强效的 PARP 捕获剂，形成稳定的药物-PARP-DNA 复合物，阻止 DNA 复制并诱导双链断裂——其效力比奥拉帕尼高约 5 倍，这解释了其在同源重组缺陷细胞中更高的效力 [1]。
- 构效关系 (SAR)：A-966492 是一种苯基取代的苯并咪唑甲酰胺衍生物。其效力/选择性的关键结构特征：(1) 苯环 4 位上的 (S)-吡咯烷-2-基（通过与 Asp886 的氢键增强 PARP1 的结合）；(2) 2 位上的氟取代（提高代谢稳定性）。 （3）苯并咪唑羧酰胺核心（对NAD+口袋结合至关重要）[1]
- 临床前治疗潜力：A-966492 是一种用于治疗HR缺陷型癌症（例如，BRCA突变型乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌）的先导PARP抑制剂。其高口服生物利用度、长半衰期和低毒性支持其临床开发潜力[1]

C18H17FN4O

324.35

324.138

C, 66.65; H, 5.28; F, 5.86; N, 17.27; O, 4.93

934162-61-5

16666333

White solid powder

1.3±0.1 g/cm3

605.5±65.0 °C at 760 mmHg

320.0±34.3 °C

0.0±1.7 mmHg at 25°C

1.665

0.96

84.79

3

4

3

24

476

1

C(C1C=CC=C2N=C(C3C=CC([C@H]4NCCC4)=CC=3F)NC=12)(=O)N

AHIVQGOUBLVTCB-AWEZNQCLSA-N

InChI=1S/C18H17FN4O/c19-13-9-10(14-5-2-8-21-14)6-7-11(13)18-22-15-4-1-3-12(17(20)24)16(15)23-18/h1,3-4,6-7,9,14,21H,2,5,8H2,(H2,20,24)(H,22,23)/t14-/m0/s1

2-[2-fluoro-4-[(2S)-pyrrolidin-2-yl]phenyl]-1H-benzimidazole-4-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。