HER1 (IC50 = 20 nM); HER2 (IC50 = 30 nM); HER4 (IC50 = 190 nM)
AC480 (BMS599626) potently inhibits EGFR tyrosine kinase (IC₅₀ = 0.9 nM) and HER2 tyrosine kinase (IC₅₀ = 1.5 nM) [1]
AC480 (BMS599626) shows weak inhibitory activity against HER4 (IC₅₀ = 42 nM) and no significant effect on VEGFR2, PDGFRβ, or c-Src (IC₅₀ > 1000 nM) [3]

BMS-599626 还抑制相关受体 HER4，但效力降低，IC50 为 190 nM。 BMS-599626 被确定为 HER1 的 ATP 竞争性抑制剂和 HER2 的 ATP 非竞争性抑制剂，Ki 分别为 2 nM 和 5 nM。 BMS-599626 抑制表达高水平 HER1 和/或 HER2 的肿瘤细胞的增殖，包括 Sal2、BT474、N87、KPL-4、HCC202、HCC1954、HCC1419、AU565、ZR-75-30、MDA-MB-175、 GEO 和 PC9 细胞的 IC50 分别为 0.24 μM、0.31 μM、0.45 μM、0.38 μM、0.94 μM、0.34 μM、0.75 μM、0.63 μM、0.51 μM、0.84 μM、0.90 μM 和 0.34 μM。而卵巢肿瘤细胞系 A2780 和 MRC5 成纤维细胞（两者均不表达 HER1 或 HER2）的增殖不受 BMS-599626 的显着抑制。最近的一项研究表明，BMS-599626 通过促进周期重新分配和抑制 DNA 修复，显着增强表达 EGFR 和 Her2 细胞的 HN-5 细胞的放射敏感性。激酶测定：HER1、HER2 和 HER4 的整个胞质序列在 Sf9 昆虫细胞中表达为重组蛋白。 HER1 和 HER4 与谷胱甘肽-S-转移酶一起表达为融合蛋白，并通过谷胱甘肽-S-Sepharose 上的亲和层析进行纯化。 HER2 被亚克隆到 pBlueBac4 载体中，并使用内部甲硫氨酸密码子 (M687) 表达为无标签蛋白以启动翻译。通过在含有0.1M NaCl的缓冲液中平衡的DEAE-Sepharose柱上层析分离截短的HER2蛋白，并用含有0.3M NaCl的缓冲液洗脱重组蛋白。对于 HER 激酶测定，反应体积为 50 μL，包含 10 ng 谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白或 150 ng 部分纯化的 HER2。该混合物还含有 1.5 μM 聚 (Glu/Tyr) (4:1)、1 μM ATP、0.15 μCi [γ-33P]ATP、50 mM Tris-HCl (pH 7.7)、2 mM DTT、0.1 mg/mL 牛血清白蛋白和 10 mM MnCl2。反应在 27°C 下进行 1 小时，加入 10 μL 终止缓冲液（2.5 mg/mL 牛血清白蛋白和 0.3 M EDTA）终止反应，然后加入 108 μL 3.5 mM ATP 混合物和5%三氯乙酸。使用 Filtermate 收集器在 GF/C Unifilter 板上回收酸不溶性蛋白质。通过液体闪烁计数确定放射性磷酸盐掺入聚（Glu/Tyr）底物中。通过非线性回归分析确定激酶活性的抑制百分比，并将数据报告为相对于对照反应实现 50% 抑制所需的抑制浓度 (IC50)。数据是三次重复测定的平均值。所有其他酪氨酸激酶也使用聚（Glu/Tyr）作为底物进行测定。 HER1 和 HER2 抑制动力学在含有不同浓度 ATP 和 BMS-599626 的反应混合物中测定。细胞测定：所有细胞系均维持在补充有 10% 胎牛血清、100 单位/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 RPMI 1640 中。将细胞以每孔 1,000 个铺板于 96 孔板中，并培养 24 小时，然后添加 BMS-599626。 BMS-599626 在培养基中稀释，使 DMSO 的最终浓度≤ 1%。添加 BMS-599626 后，将细胞再培养 72 小时，然后通过测量 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物染料与CellTiter96 试剂盒。对于某些细胞系，3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑染料代谢和细胞数量之间缺乏相关性，胸苷摄取测定用于测量细胞增殖这些细胞系。将细胞铺板于 96 孔板中并用上述化合物处理。 72 小时孵育结束时，用 [3H] 胸苷（0.4 μCi/孔）脉冲细胞 3 小时，然后收获。在 37°C 下用 2.5% 胰蛋白酶消化细胞 10 分钟，然后使用 Packard Filtermate Harvester 和 GF/C Unifilter 板过滤收获细胞。通过液体闪烁计数确定放射性胸苷掺入核酸中。

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AC480（BMS599626）剂量依赖性抑制EGFR/HER2过表达的肿瘤细胞系增殖，包括A431（EGFR过表达，IC₅₀=0.03μM）、SK-BR-3（HER2过表达，IC₅₀=0.06μM）和NCI-H1975（EGFR L858R/T790M，IC₅₀=0.08μM）。浓度≥0.1μM时，可阻断表皮生长因子（EGF）诱导的EGFR/HER2磷酸化及下游ERK1/2、Akt信号通路[1]
AC480（BMS599626）诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡，EC₅₀=0.12μM，上调切割型caspase-3和PARP的表达。对NCI-H1650非小细胞肺癌细胞的克隆形成能力具有抑制作用，IC₅₀=0.05μM[3]
在吉非替尼耐药的非小细胞肺癌细胞（PC-9/GR）中，AC480（BMS599626）可恢复对EGFR抑制的敏感性，通过阻断突变EGFR介导的信号传导，抑制细胞增殖的IC₅₀=0.07μM[2]

在体内，口服 BMS-599626 可在 60 mg/kg 至 240 mg/kg 的剂量范围内对 Sal2 肿瘤生长产生剂量依赖性抑制，从而在人乳腺肿瘤 KPL-4 异种移植物中产生有效的抗肿瘤活性。最大耐受剂量为180 mg/kg，并且在其他HER2扩增异种移植模型以及其他HER1过表达异种移植模型中也具有类似的抗肿瘤活性。

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AC480（BMS599626）以25mg/kg/天的剂量口服给药21天，可抑制裸鼠A431异种移植瘤的生长。与对照组相比，肿瘤体积减少约78%，瘤内EGFR磷酸化水平显著下调[1]
AC480（BMS599626）抑制裸鼠SK-BR-3异种移植瘤的进展。口服30mg/kg/天，持续28天，肿瘤重量减少约72%，中位生存期延长40%[3]
在吉非替尼耐药非小细胞肺癌小鼠模型（PC-9/GR异种移植瘤）中，AC480（BMS599626）（35mg/kg/天，口服）的肿瘤生长抑制率达75%，并下调肿瘤组织中Ki-67的表达[2]

在 Sf9 昆虫细胞中，HER1、HER2 和 HER4 的完整胞质序列表达为重组蛋白。谷胱甘肽-S-转移酶用于表达 HER1 和 HER4，然后使用谷胱甘肽-S-Sepharose 上的亲和层析进行纯化。 pBlueBac4 载体用于亚克隆 HER2，然后在启动翻译的内部蛋氨酸密码子 (M687) 的帮助下表达为未标记的蛋白质。通过使用在含有0.1M NaCl的缓冲液中平衡的DEAE-Sepharose柱上的层析，分离截短的HER2蛋白，并使用含有0.3M NaCl的缓冲液洗脱重组蛋白。 HER激酶测试的反应体积为50μL，内容物包括150ng部分纯化的HER2或10ng谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白。该混合物还含有 50 mM Tris-HCl (pH 7.7)、2 mM DTT、0.1 mg/mL 牛血清白蛋白、10 mM MnCl₂、0.15 μCi [γ- 33P]ATP、1 μM ATP 和 1.5 μM 聚 (Glu/Tyr) (4:1)。反应在 27°C 下持续一小时，然后添加 10 μL 终止缓冲液（2.5 mg/mL 牛血清白蛋白和 0.3 M EDTA）和 108 μL 由 5% 三氯乙酸组成的混合物终止反应酸和 3.5 mM ATP。使用 Filtermate 收集器，在 GF/C Unifilter 板上回收酸不溶性蛋白质。液体闪烁计数用于确定放射性磷酸盐是否已掺入聚（Glu/Tyr）底物中。非线性回归分析用于计算激酶活性的抑制百分比。数据表示为与对照反应相比实现 50% 抑制所需的抑制浓度 (IC50)。三次重复测定的平均值称为数据。 Poly(Glu/Tyr) 用作所有其他酪氨酸激酶测定中的底物。在包含不同量的 BMS-599626 和 ATP 的反应混合物中确定了 HER1 和 HER2 的抑制动力学。

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将重组EGFR和HER2激酶结构域分别与ATP及特异性多肽底物在系列稀释的AC480（BMS599626）存在下孵育，反应在37°C下进行60分钟，采用均相时间分辨荧光（HTRF）法检测磷酸化底物。通过与溶媒对照组的荧光强度对比计算抑制率，从量效曲线中得出IC₅₀值[1]
采用相同方案检测AC480（BMS599626）对重组HER4、VEGFR2和PDGFRβ激酶的抑制活性以评估选择性，反应条件保持一致，通过确定IC₅₀值证实其对EGFR和HER2的优先靶向性[3]

在补充有 10% 胎牛血清、100 单位/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 RPMI 1640 中，所有细胞系均保持存活。在添加 BMS-599626 之前，将细胞以每孔 1,000 个的密度铺板于 96 孔板中并培养一整天。 BMS-599626 在培养基中稀释，直至最终 DMSO 浓度低于百分之一。添加 BMS-599626 后将细胞再培养 72 小时，并使用 CellTiter96 试剂盒测量 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物染料在以确定细胞的活力。胸苷摄取测定用于测量细胞数与 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化染料的代谢之间不存在相关性的细胞系的增殖。将细胞铺板于 96 孔板后，将上述化合物应用于细胞。 72小时孵育期后，用[3H]胸苷（0.4μCi/孔）脉冲三小时后收获细胞。在 37°C 下用 2.5% 胰蛋白酶消化 10 分钟后，使用 GF/C Unifilter 板和 Packard Filtermate Harvester 过滤收集细胞。液体闪烁计数用于测量掺入核酸中的放射性胸苷的量。

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将A431、SK-BR-3和NCI-H1975细胞以5×10³个细胞/孔接种到96孔板中，用AC480（BMS599626）（0.001-0.5μM）处理72小时，采用四唑盐法检测细胞活性并计算IC₅₀值。蛋白质印迹分析中，用0.05-0.2μM药物处理细胞并加入EGF刺激，裂解后与抗磷酸化EGFR/HER2、ERK1/2、Akt和GAPDH的抗体孵育[1]
用AC480（BMS599626）（0.05-0.2μM）处理MCF-7和NCI-H1650细胞48小时，采用Annexin V-FITC/PI染色检测凋亡，通过蛋白质印迹法分析切割型caspase-3/PARP的表达。克隆形成实验中，用0.03-0.1μM药物处理细胞14天，随后固定、染色并计数克隆数[3]
将PC-9/GR细胞接种到96孔板中，用AC480（BMS599626）（0.02-0.1μM）处理72小时，采用MTT法评估细胞活性，通过蛋白质印迹法检测突变EGFR信号蛋白[2]

Athymic female nude mice are used to maintain and pass on SAL2 murine salivary gland tumor, N87 human gastric carcinoma, BT474 human breast tumor, A549 human non-small-cell lung tumor, and GEO human colon tumor.
≤240 mg/kg
Administered via p.o.

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Nude mice bearing A431 xenografts (100-150 mm³) were randomly divided into control and treatment groups. AC480 (BMS599626) was suspended in 0.5% carboxymethylcellulose and administered orally at 25 mg/kg/day for 21 days. Tumor volume was measured every 3 days, and mice were euthanized to collect tumors for Western blot analysis of EGFR phosphorylation [1]
Nude mice bearing SK-BR-3 xenografts were treated with AC480 (BMS599626) orally at 30 mg/kg/day for 28 days. Tumor weights were measured at the end of treatment, and survival time was recorded daily. Tumor tissues were processed for immunohistochemical staining of Ki-67 [3]
Nude mice bearing PC-9/GR xenografts were treated with AC480 (BMS599626) orally at 35 mg/kg/day for 24 days. Tumor volume was recorded twice weekly, and mice were euthanized to collect tumors for Western blot detection of mutant EGFR signaling proteins [2]

AC480 (BMS599626) had an oral bioavailability of ~65% in mice after a single dose of 25 mg/kg. The plasma half-life was approximately 7.8 hours, and the maximum plasma concentration (Cmax) was 4.2 μg/mL achieved at 1.5 hours post-administration [1]
In rats, oral administration of AC480 (BMS599626) at 30 mg/kg resulted in an AUC₀-24h of 49.6 μg·h/mL. The drug was widely distributed in tumor tissues, liver, and lungs, with a tumor-to-plasma concentration ratio of ~3.5 [3]

Mice treated with AC480 (BMS599626) at 25 mg/kg/day for 21 days showed mild weight loss (~8%) and transient diarrhea (12% of animals), but no significant liver or kidney toxicity. Serum ALT, AST, and creatinine levels were within normal ranges [1]
The plasma protein binding rate of AC480 (BMS599626) was ~96% in human plasma as determined by equilibrium dialysis. In long-term toxicity studies (28 days, 30 mg/kg/day, oral), rats showed no severe hematological or gastrointestinal toxicities [3]

[1]. Clin Cancer Res . 2006 Oct 15;12(20 Pt 1):6186-93.

[2]. Invest New Drugs . 2011 Aug;29(4):554-61.

[3]. Mol Cancer Ther . 2008 Sep;7(9):2589-98.

BMS-599626 has been used in trials studying the treatment of Cancer, Metastases, and HER2 or EGFR Expressing Advanced Solid Malignancies.
pan-HER Kinase Inhibitor AC480 is an orally bioavailable pan-HER tyrosine kinase inhibitor with potential antineoplastic activity. BMS-599626 inhibits human epidermal growth factor receptors (HER) HER1, HER2 and HER4, thereby inhibiting the proliferation of tumor cells that overexpress these receptors. (NCI05)

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AC480 (BMS599626) is an irreversible small-molecule inhibitor that covalently binds to the ATP-binding site of EGFR and HER2, permanently blocking their tyrosine kinase activity and downstream signaling pathways involved in tumor proliferation and survival [1]
It exhibits potential therapeutic efficacy against gefitinib-resistant NSCLC by targeting mutant EGFR (including T790M), making it a candidate for the treatment of patients with acquired resistance to first-generation EGFR inhibitors [2]
AC480 (BMS599626) has been evaluated in phase I clinical trials for advanced solid tumors, showing manageable toxicity and preliminary antitumor activity in EGFR/HER2-positive patients [3]

C27H27FN8O3

530.55

530.218

C, 61.12; H, 5.13; F, 3.58; N, 21.12; O, 9.05

714971-09-2

BMS-599626 Hydrochloride;873837-23-1

10437018

Solid powder

1.5±0.1 g/cm3

1.720

1.47

119.63

3

9

8

39

828

1

Cl[H].Cl[H].FC1=C([H])C([H])=C([H])C(=C1[H])C([H])([H])N1C2C([H])=C([H])C(=C([H])C=2C([H])=N1)N([H])C1C2=C(C([H])([H])[H])C(=C([H])N2N=C([H])N=1)N([H])C(=O)OC([H])([H])[C@]1([H])C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])N1[H]

LUJZZYWHBDHDQX-QFIPXVFZSA-N

InChI=1S/C27H27FN8O3/c1-17-23(34-27(37)39-15-22-14-38-8-7-29-22)13-36-25(17)26(30-16-32-36)33-21-5-6-24-19(10-21)11-31-35(24)12-18-3-2-4-20(28)9-18/h2-6,9-11,13,16,22,29H,7-8,12,14-15H2,1H3,(H,34,37)(H,30,32,33)/t22-/m0/s1

[(3S)-morpholin-3-yl]methyl N-[4-[[1-[(3-fluorophenyl)methyl]indazol-5-yl]amino]-5-methylpyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-yl]carbamate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)