HER1 (IC50 = 20 nM); HER2 (IC50 = 30 nM); HER4 (IC50 = 190 nM)

体外活性：BMS-599626 还抑制相关受体 HER4，但效力降低，IC50 为 190 nM。 BMS-599626 被确定为 HER1 的 ATP 竞争性抑制剂和 HER2 的 ATP 非竞争性抑制剂，Ki 分别为 2 nM 和 5 nM。 BMS-599626 抑制表达高水平 HER1 和/或 HER2 的肿瘤细胞的增殖，包括 Sal2、BT474、N87、KPL-4、HCC202、HCC1954、HCC1419、AU565、ZR-75-30、MDA-MB-175、 GEO 和 PC9 细胞的 IC50 分别为 0.24 μM、0.31 μM、0.45 μM、0.38 μM、0.94 μM、0.34 μM、0.75 μM、0.63 μM、0.51 μM、0.84 μM、0.90 μM 和 0.34 μM。而卵巢肿瘤细胞系 A2780 和 MRC5 成纤维细胞（两者均不表达 HER1 或 HER2）的增殖不受 BMS-599626 的显着抑制。最近的一项研究表明，BMS-599626 通过促进周期重新分配和抑制 DNA 修复，显着增强表达 EGFR 和 Her2 细胞的 HN-5 细胞的放射敏感性。激酶测定：HER1、HER2 和 HER4 的整个胞质序列在 Sf9 昆虫细胞中表达为重组蛋白。 HER1 和 HER4 与谷胱甘肽-S-转移酶一起表达为融合蛋白，并通过谷胱甘肽-S-Sepharose 上的亲和层析进行纯化。 HER2 被亚克隆到 pBlueBac4 载体中，并使用内部甲硫氨酸密码子 (M687) 表达为无标签蛋白以启动翻译。通过在含有0.1M NaCl的缓冲液中平衡的DEAE-Sepharose柱上层析分离截短的HER2蛋白，并用含有0.3M NaCl的缓冲液洗脱重组蛋白。对于 HER 激酶测定，反应体积为 50 μL，包含 10 ng 谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白或 150 ng 部分纯化的 HER2。该混合物还含有 1.5 μM 聚 (Glu/Tyr) (4:1)、1 μM ATP、0.15 μCi [γ-33P]ATP、50 mM Tris-HCl (pH 7.7)、2 mM DTT、0.1 mg/mL 牛血清白蛋白和 10 mM MnCl2。反应在 27°C 下进行 1 小时，加入 10 μL 终止缓冲液（2.5 mg/mL 牛血清白蛋白和 0.3 M EDTA）终止反应，然后加入 108 μL 3.5 mM ATP 混合物和5%三氯乙酸。使用 Filtermate 收集器在 GF/C Unifilter 板上回收酸不溶性蛋白质。通过液体闪烁计数确定放射性磷酸盐掺入聚（Glu/Tyr）底物中。通过非线性回归分析确定激酶活性的抑制百分比，并将数据报告为相对于对照反应实现 50% 抑制所需的抑制浓度 (IC50)。数据是三次重复测定的平均值。所有其他酪氨酸激酶也使用聚（Glu/Tyr）作为底物进行测定。 HER1 和 HER2 抑制动力学在含有不同浓度 ATP 和 BMS-599626 的反应混合物中测定。细胞测定：所有细胞系均维持在补充有 10% 胎牛血清、100 单位/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 RPMI 1640 中。将细胞以每孔 1,000 个铺板于 96 孔板中，并培养 24 小时，然后添加 BMS-599626。 BMS-599626 在培养基中稀释，使 DMSO 的最终浓度≤ 1%。添加 BMS-599626 后，将细胞再培养 72 小时，然后通过测量 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物染料与CellTiter96 试剂盒。对于某些细胞系，3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑染料代谢和细胞数量之间缺乏相关性，胸苷摄取测定用于测量细胞增殖这些细胞系。将细胞铺板于 96 孔板中并用上述化合物处理。 72 小时孵育结束时，用 [3H] 胸苷（0.4 μCi/孔）脉冲细胞 3 小时，然后收获。在 37°C 下用 2.5% 胰蛋白酶消化细胞 10 分钟，然后使用 Packard Filtermate Harvester 和 GF/C Unifilter 板过滤收获细胞。通过液体闪烁计数确定放射性胸苷掺入核酸中。

在体内，口服 BMS-599626 可在 60 mg/kg 至 240 mg/kg 的剂量范围内对 Sal2 肿瘤生长产生剂量依赖性抑制，从而在人乳腺肿瘤 KPL-4 异种移植物中产生有效的抗肿瘤活性。最大耐受剂量为180 mg/kg，并且在其他HER2扩增异种移植模型以及其他HER1过表达异种移植模型中也具有类似的抗肿瘤活性。

在 Sf9 昆虫细胞中，HER1、HER2 和 HER4 的完整胞质序列表达为重组蛋白。谷胱甘肽-S-转移酶用于表达 HER1 和 HER4，然后使用谷胱甘肽-S-Sepharose 上的亲和层析进行纯化。 pBlueBac4 载体用于亚克隆 HER2，然后在启动翻译的内部蛋氨酸密码子 (M687) 的帮助下表达为未标记的蛋白质。通过使用在含有0.1M NaCl的缓冲液中平衡的DEAE-Sepharose柱上的层析，分离截短的HER2蛋白，并使用含有0.3M NaCl的缓冲液洗脱重组蛋白。 HER激酶测试的反应体积为50μL，内容物包括150ng部分纯化的HER2或10ng谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白。该混合物还含有 50 mM Tris-HCl (pH 7.7)、2 mM DTT、0.1 mg/mL 牛血清白蛋白、10 mM MnCl₂、0.15 μCi [γ-³³P]ATP、1 μM ATP 和 1.5 μM 聚 (Glu/Tyr) (4:1)。反应在 27°C 下持续一小时，然后添加 10 μL 终止缓冲液（2.5 mg/mL 牛血清白蛋白和 0.3 M EDTA）和 108 μL 由 5% 三氯乙酸组成的混合物终止反应酸和 3.5 mM ATP。使用 Filtermate 收集器，在 GF/C Unifilter 板上回收酸不溶性蛋白质。液体闪烁计数用于确定放射性磷酸盐是否已掺入聚（Glu/Tyr）底物中。非线性回归分析用于计算激酶活性的抑制百分比。数据表示为与对照反应相比实现 50% 抑制所需的抑制浓度 (IC50)。三次重复测定的平均值称为数据。 Poly(Glu/Tyr) 用作所有其他酪氨酸激酶测定中的底物。在包含不同量的 BMS-599626 和 ATP 的反应混合物中确定了 HER1 和 HER2 的抑制动力学。

在补充有 10% 胎牛血清、100 单位/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 RPMI 1640 中，所有细胞系均保持存活。在添加 BMS-599626 之前，将细胞以每孔 1,000 个的密度铺板于 96 孔板中并培养一整天。 BMS-599626 在培养基中稀释，直至最终 DMSO 浓度低于百分之一。添加 BMS-599626 后将细胞再培养 72 小时，并使用 CellTiter96 试剂盒测量 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物染料在以确定细胞的活力。胸苷摄取测定用于测量细胞数与 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化染料的代谢之间不存在相关性的细胞系的增殖。将细胞铺板于 96 孔板后，将上述化合物应用于细胞。 72小时孵育期后，用[3H]胸苷（0.4μCi/孔）脉冲三小时后收获细胞。在 37°C 下用 2.5% 胰蛋白酶消化 10 分钟后，使用 GF/C Unifilter 板和 Packard Filtermate Harvester 过滤收集细胞。液体闪烁计数用于测量掺入核酸中的放射性胸苷的量。

Athymic female nude mice are used to maintain and pass on SAL2 murine salivary gland tumor, N87 human gastric carcinoma, BT474 human breast tumor, A549 human non-small-cell lung tumor, and GEO human colon tumor.
≤240 mg/kg
Administered via p.o.

[1]. Clin Cancer Res . 2006 Oct 15;12(20 Pt 1):6186-93.

[2]. Invest New Drugs . 2011 Aug;29(4):554-61.

[3]. Mol Cancer Ther . 2008 Sep;7(9):2589-98.

C27H27FN8O3

530.55

530.22

C, 61.12; H, 5.13; F, 3.58; N, 21.12; O, 9.05

714971-09-2

BMS-599626 Hydrochloride;873837-23-1

Solid powder

CC1=C2C(=NC=NN2C=C1NC(=O)OC[C@@H]3COCCN3)NC4=CC5=C(C=C4)N(N=C5)CC6=CC(=CC=C6)F

LUJZZYWHBDHDQX-QFIPXVFZSA-N

InChI=1S/C27H27FN8O3/c1-17-23(34-27(37)39-15-22-14-38-8-7-29-22)13-36-25(17)26(30-16-32-36)33-21-5-6-24-19(10-21)11-31-35(24)12-18-3-2-4-20(28)9-18/h2-6,9-11,13,16,22,29H,7-8,12,14-15H2,1H3,(H,34,37)(H,30,32,33)/t22-/m0/s1

[(3S)-morpholin-3-yl]methyl N-[4-[[1-[(3-fluorophenyl)methyl]indazol-5-yl]amino]-5-methylpyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-yl]carbamate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)