Actinonin   中文名称: 放线酰胺素

Human peptide deformylase (HsPDF) with IC50 = 0.043 μM (as determined in the PDF assay, Table 3). [1]

在不同的人类肿瘤细胞系中，放线菌素抑制细胞增殖。该化合物对Raji细胞、MDA-MB-468细胞、PC3细胞、SK-LC-19细胞、Hela细胞、HT-1080细胞和AL67细胞的IC50值依次为4、6.9、12.8、16.6、27.4、15.7和49.3 μM[1]。放线菌素的主要靶点是线粒体中的HsPDF，该蛋白被放线菌素抑制，从而导致肿瘤细胞死亡。以剂量和时间依赖的方式，放线菌素处理细胞会导致ATP耗竭和肿瘤特异性线粒体膜去极化[1]。放线菌素能够强烈抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的三种肽链去甲酰酶（锌、镍和铁）。在测试条件下，放线菌素对 Zn-PDF（大肠杆菌）、Ni-PDF（大肠杆菌）、Fe-PDF（大肠杆菌）和 Ni-PDF（金黄色葡萄球菌）的 IC50 值分别为 90、3、0.8 和 11 nM[2]。放线菌素对革兰氏阳性菌具有抗菌活性，例如金黄色葡萄球菌（MIC 值：8–16 μg/mL）、化脓性链球菌（MIC 值：8 μg/mL）和表皮链球菌（MIC 值：2-4 μg/mL）。放线菌素对一些难培养的革兰氏阴性菌也具有抗菌活性，包括流感嗜血杆菌（MIC 值：1-2 μg/mL）、卡他莫拉菌（MIC 值：0.5 μg/mL）和淋病奈瑟菌（MIC 值：1-4 μg/mL）。放线菌素对流感嗜血杆菌acr（MIC值为0.13 μg/mL）和大肠杆菌acr（MIC值为0.25 μg/mL）的外排泵突变体表现出高活性[2]。

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放线菌素对17种人类肿瘤细胞系中的16种（代表9个不同谱系）表现出抗增殖活性，IC50值范围为4.0 μM至60.0 μM（例如，Daudi 5.2±2.2 μM，HL60 9.3±2.9 μM，Raji 4.0±1.0 μM，RL 5.9±0.6 μM，MDA-MB-468 6.9±0.3 μM，SK-BR-3 14.0±5.1 μM，CWR22 32.3±2.3 μM，TSU-PRI）。 60.0±7.1 μM，DU145 28.5±3.7 μM，PC3 12.8±3.5 μM，SK-LC-8 20.6±0.2 μM，SK-LC-16 16.6±0.4 μM，A2780 12.5±0.0 μM，HeLa 27.4±4.6 μM，HT-1080 15.7±0.2 μM）。HEK293 肾细胞具有耐药性（>250 μM）。正常细胞系（WI-38、NIH-3T3、hPBMCs）具有耐药性，IC50 >500 μM，而 ras 转化的鼠成纤维细胞 AL67 的 IC50 为 49.3±29.9 μM。所用检测方法包括胸苷掺入法、XTT 代谢法或台盼蓝排除法。[1] - 合成了33种放线菌素类似物；所有具有强效HsPDF抑制活性（IC50 < 0.1 μM）的化合物，在至少一种细胞系（CWR22Rv1、TSU-PRI、Daudi、HL60）上也表现出强效的抗增殖活性（IC50 < 50 μM）。未检测到HsPDF抑制的化合物未表现出细胞生长抑制作用。这种相关性证实了靶点特异性。（表3和图4）[1]
- 靶向HsPDF的小干扰RNA（siRNA HsPDF 581-601和659-679）显著降低了HeLa细胞中HsPDF mRNA和蛋白的表达。在低至10 nM的剂量下，这些siRNA显著抑制了细胞增殖（通过氚标记胸苷掺入法测定），并在转染后48小时观察到最大效应。对照siRNA没有作用。 [1]
- 放线菌素处理RL人B淋巴瘤细胞后，线粒体膜发生时间和剂量依赖性的去极化，可通过JC-1染料（红/绿荧光比值）进行测量。在100 μg/ml浓度下，去极化程度与CCCP（阳性对照）相当。去除放线菌素后，去极化可逆（约8小时后恢复）。在HeLa和HL60细胞中也观察到类似的去极化，但在相同剂量下，正常外周血淋巴细胞中未观察到。[1]
- 放线菌素以时间和剂量依赖的方式降低Daudi细胞中的ATP水平。在20 μg/ml浓度下，12小时时ATP消耗率为56.0%，24小时时为67.3%，36小时时为95.8%。[1]
- 放线菌素诱导低水平的细胞凋亡（膜联蛋白表达量约为7%）。通过膜联蛋白V染色确定，Daudi细胞中存在V阳性、碘化丙啶阴性的膜联蛋白V。[1]

小鼠曾接受剂量高达 400 mg/kg 的放线菌素作为抗生素治疗，未发现风险。放线菌素在体外表现出抗癌活性，但似乎对正常组织无明显损害。值得注意的是，腹腔注射或口服放线菌素均能显著抑制裸鼠 CWR22 人前列腺肿瘤异种移植模型中的肿瘤生长。动物在接受治疗期间未出现任何毒性症状[1]。

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在携带 CWR22 人前列腺肿瘤异种移植的无胸腺裸鼠中，腹腔注射放线菌素（250 mg/kg，每日两次，持续 2 周，周末除外）可显著抑制肿瘤生长（P<0.005）。口服放线菌素（500 mg/kg，每日两次）同样有效，表明其具有良好的口服生物利用度。治疗期间未观察到动物出现任何临床毒性症状。 [1] 在携带 A549 人非小细胞肺癌异种移植瘤的无胸腺裸鼠中，腹腔注射放线菌素（150 mg/kg，每日一次，持续 2 周，周末除外）可显著抑制肿瘤生长（P<0.01）。在 PC3 人前列腺癌异种移植瘤中也观察到了类似的抗肿瘤活性。[1]

采用甲酸脱氢酶偶联分光光度法测定肽去甲酰酶 (PDF) 活性。反应混合物包含 50 mM HEPES (pH 7.4)、10 mM NaCl、0.2 mg/ml BSA、2.4 mM NAD⁺、1 U 甲酸脱氢酶和 0–32 mM N-甲酰化肽底物（甲酰-Met-Ala-Ser、甲酰-Met-Ala-His-Ala 或甲酰-Met-Thr-Met-His）。加入 20–100 μg HsPDF 酶（钴取代的 N 端截短突变体，带有 C 端 6x-组氨酸标签）启动反应。通过监测 340 nm 处吸光度的增加来测定 NADH 的生成速率。测定了每种底物的动力学参数（Vmax、Km、Kcat、Kcat/Km）。测试了放线菌素及其类似物对HsPDF活性的抑制作用，并将IC50值计算为抑制50%酶活性的浓度（与对照组相比）。[1]

采用氚标记胸苷掺入法评估细胞增殖。将细胞（每孔10,000个）接种于96孔板中，分别加入或不加入放线菌素（系列稀释）。孵育1-5天后，向每孔加入50 μl浓度为10 μCi/ml的氚标记胸苷，并孵育5小时。将培养板冻存过夜，收集细胞至滤膜上，并在液体闪烁计数器中计数。[1]
- XTT法：将处于对数生长期的细胞接种于96孔板中。加入不同浓度的放线菌素。当对照孔细胞达到汇合时，向每孔加入50 μl XTT溶液（1 mg/ml，溶于无血清培养基中），该溶液含有吩嗪甲酯，于37℃孵育2-4小时，并在450/630 nm双波长下读取吸光度。 [1]
- 使用 JC-1 染料测量线粒体膜去极化。将细胞以 1×10^6 个细胞/ml 的浓度与不同浓度的放线菌素 (0–100 μg/ml) 孵育。使用 CCCP (100 nM，10 分钟) 作为最大去极化的阳性对照。将细胞与 JC-1 在 37°C 下孵育 5 分钟，用 PBS 洗涤三次，然后重悬于含放线菌素的培养基中。进行流式细胞术分析，测量绿色荧光 (FL-1，525 nm) 以反映线粒体质量，红色荧光 (FL-2，590 nm) 以反映膜电位。线粒体膜电位以红/绿比值表示。[1]
- 使用 ATP 检测试剂盒测量 ATP 水平。将 Daudi 细胞用放线菌素 (5、10、20 μg/ml) 处理 1–36 小时。在每个时间点，对细胞进行计数并重悬至 100,000 个细胞/ml。使用带有 ATP 标准曲线的发光仪对 1,000 个细胞中的 ATP 进行定量。结果以每 1,000 个细胞中 ATP 的克数表示。[1]
- 通过 Annexin V 染色评估细胞凋亡。将 Daudi 细胞用放线菌素（5、10、20 μg/ml）处理 1-96 小时。在每个时间点，用 Annexin V 和碘化丙啶对 1×10^6 个细胞进行染色，并通过流式细胞术分析 Annexin V 阳性、碘化丙啶阴性细胞的百分比。[1]
- siRNA 转染：使用 Oligofectamine 将靶向 HsPDF（相对于起始密码子位置 581-601 或 659-679）的 siRNA 双链转染至 HeLa 细胞。使用对照 siRNA（非特异性双链混合物）。转染后第 1、2 和 3 天通过氚标记胸苷掺入法测定细胞增殖。在稳定表达全长 HsPDF-YFP 融合蛋白的 HeLa 细胞中，转染后 24 和 48 小时通过流式细胞术（平均峰值荧光）分析 HsPDF 蛋白的表达。[1]

对于异种移植模型，将8至10周龄的无胸腺NCr-nu小鼠侧腹部皮下注射CWR22（前列腺癌）、A549（肺癌）或PC3（前列腺癌）肿瘤细胞碎屑与Matrigel混合。待肿瘤可触及后，将小鼠随机分为对照组和治疗组（每组3-5只）。除周末外，每日腹腔注射（ip）或口服放线菌素，持续2周。剂量：CWR22模型——250 mg/kg，腹腔注射，每日两次；或500 mg/kg，口服，每日两次；A549模型——150 mg/kg，腹腔注射，每日一次。对照组仅注射溶剂。每3-5天用游标卡尺测量肿瘤大小。肿瘤体积按公式4/3 × π × [(较大直径 + 较小直径)/4]^3计算。 [1]
- 进行了一项小鼠初步毒性研究，以确定最大耐受剂量，以体重减轻作为限制性标准。[1]

放线菌素具有口服生物利用度，在CWR22异种移植瘤模型中，口服（500 mg/kg）和腹腔注射（250 mg/kg）两种给药方式均显示出相似的抗肿瘤疗效。[1]

在小鼠中，放线菌素作为抗生素，剂量高达 400 mg/kg 时耐受性良好。在异种移植研究中，动物在接受腹腔注射（150 或 250 mg/kg）或口服（500 mg/kg）治疗期间均未出现临床毒性迹象。[1]
- 体外实验表明，正常细胞系（WI-38 人成纤维细胞、NIH-3T3 小鼠成纤维细胞、正常人外周血单核细胞）对放线菌素具有耐药性，IC50 > 500 μM，比致瘤性造血细胞系的 IC50 高 5 倍以上。然而，当剂量超过肿瘤细胞 IC50 的 5 倍时，放线菌素可降低人骨髓细胞的集落形成（骨髓抑制活性）。 [1]
- 浓度高达 100 μg/ml 的放线菌素不会引起正常外周血淋巴细胞线粒体膜去极化，而肿瘤细胞（RL、HeLa、HL60）则表现出显著的去极化。[1]

[1]. Human mitochondrial peptide deformylase, a new anticancer target of actinonin-based antibiotics. J Clin Invest. 2004 Oct;114(8):1107-16.

[2]. Actinonin, a naturally occurring antibacterial agent, is a potent deformylase inhibitor. Biochemistry. 2000 Feb 15;39(6):1256-62.

[3]. Hydroxamate inhibitors of human gelatinase B (92 kDa). Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 5(4), 349-352 (1995).

[4]. Modes of action of microbially-produced phytotoxins. Toxins (Basel). 2011 Aug;3(8):1038-64.

[5]. Human meprin alpha and beta homo-oligomers: cleavage of basement membrane proteins and sensitivity to metalloprotease inhibitors. Biochem J. 2004 Mar 1;378(Pt 2):383-9.

已有报道称链霉菌含有放线菌素，相关数据可供参考。

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作用机制：放线菌素抑制HsPDF，HsPDF是一种人线粒体酶，可去除新合成线粒体蛋白N端甲硫氨酸上的甲酰基。这种抑制作用会导致未加工蛋白的积累、电子传递链复合物的破坏、质子梯度降低、线粒体膜去极化和ATP耗竭。此外，未折叠蛋白的积累可能诱导线粒体特异性应激反应，上调转录因子CHOP，而CHOP与程序性细胞死亡有关。放线菌素撤药后膜去极化的可逆性表明其对电子传递链具有间接影响。[1]
-选择性：肿瘤细胞似乎比正常细胞对放线菌素诱导的线粒体损伤更敏感。肿瘤选择性的原因尚在研究中，但可能与肿瘤线粒体的差异有关。[1]
- 抗癌活性：放线菌素可抑制小鼠体内人前列腺癌（CWR22、PC3）和肺癌（A549）异种移植瘤的生长。其类似物（SKI-AC-111111）在前列腺肿瘤异种移植模型中显示出比放线菌素强约3倍的体内抗肿瘤活性（初步结果）。[1]

C19H35N3O5

385.4983

385.257

13434-13-4

443600

White to off-white solid powder

1.1±0.1 g/cm3

137-139ºC

1.513

0.59

118.97

4

5

11

27

498

3

CCCCC[C@H](CC(=O)NO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1CO

XJLATMLVMSFZBN-VYDXJSESSA-N

InChI=1S/C19H35N3O5/c1-4-5-6-8-14(11-16(24)21-27)18(25)20-17(13(2)3)19(26)22-10-7-9-15(22)12-23/h13-15,17,23,27H,4-12H2,1-3H3,(H,20,25)(H,21,24)/t14-,15+,17+/m1/s1

(2R)-N'-hydroxy-N-[(2S)-1-[(2S)-2-(hydroxymethyl)pyrrolidin-1-yl]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]-2-pentylbutanediamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~50 mg/mL (~129.70 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (12.97 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 50.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 5 mg/mL (12.97 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 50.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 5 mg/mL (12.97 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 50.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。