AG-14361   中文名称: AG14361

PARP-1 ( Ki = 0.5 nM )

体外活性：AG14361 的效力比苯甲酰胺至少强 1000 倍。 AG14361 在透化 SW620 细胞中的 IC50 为 29 nM，在完整 SW620 细胞中为 14 nM。 AG14361与鸡PARP-1催化结构域结合的晶体分析表明，AG14361的三环系统位于由氨基酸残基Trp861、His862、Gly863、Tyr896、Phe897、Ala898、Lys903、Ser904、Tyr907组成的口袋中，和Glu988。 AG14361 与 Ser904 和 Gly863 形成重要的氢键，并与 Glu988 形成水介导的氢键。 AG14361 诱导的生长抑制并非归因于 PARP-1 相关效应，因为在比 GI50 低得多的浓度 (≤1 μM) 下观察到最大的 PARP-1 抑制。 0.4 μM 的 AG14361 不会影响癌细胞基因表达或生长，但它会增加替莫唑胺和托泊替康的抗增殖活性，并抑制 LoVo 细胞中潜在致命性 γ 辐射损伤的恢复达 73%。此外，微阵列分析显示，0.4 μMA AG14361 不会显着改变基因表达。 A549 细胞暴露于 0.4 μM AG14361 17 小时不会改变 6800 个基因的表达。因此，虽然0.4 μM AG14361抑制细胞PARP-1活性超过85%，但它基本上不改变基因表达和细胞增殖，表明这种低浓度AG14361的细胞效应对PARP-1抑制具有特异性。较高的生长抑制浓度的 AG14361 会影响基因表达，但这些影响不太可能与 PARP-1 抑制相关，因为 PARP-/- 和 PARP-1+/+ 细胞中的细胞增殖受到同等影响。 AG14361 迅速吸收到血流中并分布到肿瘤和肝脏，在大脑中检测到的浓度较低。组织与血浆浓度比表明，在两种异种移植模型中，随着时间的推移，AG14361 保留在肿瘤组织中，肿瘤浓度（≥15 μM，持续 2 小时）超过体外抑制 PARP-1 活性所需的浓度。激酶测定：在含有 20 nM PARP-1、500 μM NAD+ 加 [32P]NAD+（每个反应混合物 0.1–0.3 μCi）和活化小牛胸腺 DNA 的反应混合物中测量全长重组人 PARP-1 的活性(10 μg/mL)，25℃； 4分钟后加入冰冷的10%（重量/体积）三氯乙酸终止反应。将掺入酸不溶性材料中的反应产物[32P]ADP-核糖沉积到使用Bio-Dot微滤装置的Whatman GF/C玻璃纤维过滤器上，并使用PhosphorImager进行定量。测量 AG14361 在 0–600 nM 时对 PARP-1 活性的抑制，并通过非线性回归分析计算 AG14361 的 Ki。细胞测定：LoVo 和 SW620 结直肠癌细胞和 A549 非小细胞肺癌细胞维持在含有 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养基中。在 96 孔板中指数生长的 LoVo、A549 和 SW620 细胞中估计细胞生长抑制。细胞单独暴露于 AG14361 (0–20 μM) 或在 400 μM 替莫唑胺存在下。培养 5 天后，用 10% 三氯乙酸固定这些细胞，并用磺胺罗丹明 B 染色。根据计算机生成的曲线计算单独或组合的替莫唑胺、拓扑替康和 AG14361 抑制生长 50% (GI50) 的浓度。在停滞于 G1 期的汇合 LoVo 细胞培养物中测量潜在致命损伤的恢复情况，以模拟肿瘤中抗辐射的静止细胞群。将此类细胞暴露于 8 Gy γ 辐射，然后立即收获并铺板用于集落形成测定，或者在收获和铺板用于集落形成测定之前作为生长停滞的汇合培养物维持 4 小时或 24 小时恢复期。根据指示，在照射前 30 分钟添加 0.4 μM AG14361，并存在于恢复孵育中。

放射前的 AG14361 治疗显着增加了携带 LoVo 异种移植物的小鼠对放射治疗的敏感性。 AG14361 统计上显着增加了异种移植物中的血流量，因此可能增加对肿瘤异种移植物的药物输送。在体内，无毒剂量的 AG14361 可使由伊立替康、X 射线照射或替莫唑胺诱导的 LoVo 异种移植物生长延迟增加 2 至 3 倍。 AG14361 与替莫唑胺共同给药在统计上显着增加了替莫唑胺对 LoVo 异种移植物的活性，5 mg/kg 的 AG14361 使肿瘤生长延迟从 3 天延长至 9 天，15 mg/kg 的 AG14361 延长至 10 天。 AG14361 和替莫唑胺的组合导致 SW620 异种移植肿瘤完全消退。通过药效学测定检测，腹膜内施用 AG14361 (10 mg/kg) 后至少 4 小时，SW620 异种移植物中的 PARP-1 活性被抑制超过 75%，这与肿瘤中持续存在的 AG14361 浓度一致。

在含有活化小牛胸腺 DNA (10 μg/mL)、25 °C、500 μM NAD⁺ 加 [^{32P]NAD+（每个反应混合物 0.1–0.3 μCi）和 20 nM PARP-1。 4 分钟后加入冰冷的 10%（重量/体积）三氯乙酸终止反应。 PhosphorImager 用于量化反应产物 [32P]ADP-核糖，该产物在使用 Bio-Dot 微滤沉积到 Whatman GF/C 玻璃纤维过滤器上后整合到酸不溶性材料中设备。测量 AG14361 在 0–600 nM 时对 PARP-1 活性的抑制，并通过非线性回归分析计算 AG14361 的 K_i。}

96 孔板中代谢活性细胞的荧光素酶偶联 ATP 定量测定与 MTT 一起用于细胞活力测定。 24 孔板的一个孔中铺有 1 至 2 个 × 10⁴ 细胞，用于 MTT。将目标药物 (AG14361) 以不同浓度溶解在 DMSO 中，然后添加到含有 10% 胎牛血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 中的细胞中。此外，每个孔还添加了 AG14361 的 IC50 浓度。添加到培养基中后，DMSO 的最终浓度为 0.1%。 48 小时后除去培养基，每个孔接受 0.3 mL 0.1% MTT 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。在 37°C CO2 培养箱中孵育 30 分钟后，除去 MTT 溶液并添加 0.8 mL 2-丙醇。摇动 30 分钟后，使用读板器测量 OD560。每个时间点电镀3次。

[1]. J Natl Cancer Inst . 2004 Jan 7;96(1):56-67.

[2]. Clin Cancer Res . 2004 Feb 1;10(3):881-9.

[3]. Clin Cancer Res . 2005 Dec 1;11(23):8449-57.

LSM-1988 is a member of benzimidazoles.

C19H20N4O

320.39

320.163

C, 71.23; H, 6.29; N, 17.49; O, 4.99

328543-09-5

9840076

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

1.676

1.92

53.65

1

3

3

24

460

0

O=C1NCCN2C3=C1C=CC=C3N=C2C4=CC=C(C=C4)CN(C)C

SEKJSSBJKFLZIT-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H20N4O/c1-22(2)12-13-6-8-14(9-7-13)18-21-16-5-3-4-15-17(16)23(18)11-10-20-19(15)24/h3-9H,10-12H2,1-2H3,(H,20,24)

2-[4-[(dimethylamino)methyl]phenyl]-1,3,10-triazatricyclo[6.4.1.04,13]trideca-2,4,6,8(13)-tetraen-9-one

AG 14361; AG14361; AG-14361

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (3.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (3.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (3.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 4% DMSO+ddH2O: 2mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。