AG-14361   中文名称: AG14361

PARP-1 ( Ki = 0.5 nM )
AG-14361 is a potent and selective inhibitor of poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1), with an IC50 of 1.5 nM in recombinant human PARP1 enzyme assays. It exhibits minimal activity against PARP2 (IC50 = 45 nM) and no significant inhibition of other DNA repair enzymes (e.g., DNA-PK, ATM) at concentrations up to 10 μM [1]

体外活性：AG14361 的效力比苯甲酰胺至少强 1000 倍。 AG14361 在透化 SW620 细胞中的 IC50 为 29 nM，在完整 SW620 细胞中为 14 nM。 AG14361与鸡PARP-1催化结构域结合的晶体分析表明，AG14361的三环系统位于由氨基酸残基Trp861、His862、Gly863、Tyr896、Phe897、Ala898、Lys903、Ser904、Tyr907组成的口袋中，和Glu988。 AG14361 与 Ser904 和 Gly863 形成重要的氢键，并与 Glu988 形成水介导的氢键。 AG14361 诱导的生长抑制并非归因于 PARP-1 相关效应，因为在比 GI50 低得多的浓度 (≤1 μM) 下观察到最大的 PARP-1 抑制。 0.4 μM 的 AG14361 不会影响癌细胞基因表达或生长，但它会增加替莫唑胺和托泊替康的抗增殖活性，并抑制 LoVo 细胞中潜在致命性 γ 辐射损伤的恢复达 73%。此外，微阵列分析显示，0.4 μMA AG14361 不会显着改变基因表达。 A549 细胞暴露于 0.4 μM AG14361 17 小时不会改变 6800 个基因的表达。因此，虽然0.4 μM AG14361抑制细胞PARP-1活性超过85%，但它基本上不改变基因表达和细胞增殖，表明这种低浓度AG14361的细胞效应对PARP-1抑制具有特异性。较高的生长抑制浓度的 AG14361 会影响基因表达，但这些影响不太可能与 PARP-1 抑制相关，因为 PARP-/- 和 PARP-1+/+ 细胞中的细胞增殖受到同等影响。 AG14361 迅速吸收到血流中并分布到肿瘤和肝脏，在大脑中检测到的浓度较低。组织与血浆浓度比表明，在两种异种移植模型中，随着时间的推移，AG14361 保留在肿瘤组织中，肿瘤浓度（≥15 μM，持续 2 小时）超过体外抑制 PARP-1 活性所需的浓度。激酶测定：在含有 20 nM PARP-1、500 μM NAD+ 加 [32P]NAD+（每个反应混合物 0.1–0.3 μCi）和活化小牛胸腺 DNA 的反应混合物中测量全长重组人 PARP-1 的活性(10 μg/mL)，25℃； 4分钟后加入冰冷的10%（重量/体积）三氯乙酸终止反应。将掺入酸不溶性材料中的反应产物[32P]ADP-核糖沉积到使用Bio-Dot微滤装置的Whatman GF/C玻璃纤维过滤器上，并使用PhosphorImager进行定量。测量 AG14361 在 0–600 nM 时对 PARP-1 活性的抑制，并通过非线性回归分析计算 AG14361 的 Ki。细胞测定：LoVo 和 SW620 结直肠癌细胞和 A549 非小细胞肺癌细胞维持在含有 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养基中。在 96 孔板中指数生长的 LoVo、A549 和 SW620 细胞中估计细胞生长抑制。细胞单独暴露于 AG14361 (0–20 μM) 或在 400 μM 替莫唑胺存在下。培养 5 天后，用 10% 三氯乙酸固定这些细胞，并用磺胺罗丹明 B 染色。根据计算机生成的曲线计算单独或组合的替莫唑胺、拓扑替康和 AG14361 抑制生长 50% (GI50) 的浓度。在停滞于 G1 期的汇合 LoVo 细胞培养物中测量潜在致命损伤的恢复情况，以模拟肿瘤中抗辐射的静止细胞群。将此类细胞暴露于 8 Gy γ 辐射，然后立即收获并铺板用于集落形成测定，或者在收获和铺板用于集落形成测定之前作为生长停滞的汇合培养物维持 4 小时或 24 小时恢复期。根据指示，在照射前 30 分钟添加 0.4 μM AG14361，并存在于恢复孵育中。

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HR缺陷细胞的抗增殖活性：AG-14361 对同源重组（HR）缺陷癌细胞具有选择性细胞毒性。72小时MTT实验IC50值：BRCA2突变Capan-1（胰腺癌，0.8 μM）、BRCA1突变MDA-MB-436（乳腺癌，1.1 μM）；HR正常细胞MCF-7（乳腺癌，IC50 = 16 μM）、人正常包皮成纤维细胞（HFF，IC50 >50 μM）[1]
- PARP抑制与DNA损伤蓄积：在Capan-1细胞中，AG-14361 （0.1–2 μM）剂量依赖性降低聚腺苷二磷酸核糖（PAR）聚合物水平：1 μM浓度下PAR较对照降低90%（蛋白质印迹法）。0.5 μM时，γ-H2AX焦点（DNA双链断裂标志物）增加4.5倍（免疫荧光），G2/M期细胞周期阻滞比例升至40%（对照18%）[1]
- 与DNA损伤药物的协同作用：AG-14361 （0.2 μM）与卡铂（0.5 μg/mL）联合处理BRCA1突变MDA-MB-436细胞，细胞存活率降至20%（联合组），显著低于单药组（AG-14361单药65%、卡铂单药70%），联合指数（CI）=0.4；与替莫唑胺（0.1 μg/mL）联合也呈协同作用（CI=0.38）[2]
- 凋亡诱导作用：Capan-1细胞经AG-14361 （1 μM）处理48小时后，凋亡细胞（Annexin V阳性/PI阳性）比例从对照的3%升至32%，同时切割型caspase-3蛋白水平升高3.0倍（蛋白质印迹法）[1]

放射前的 AG14361 治疗显着增加了携带 LoVo 异种移植物的小鼠对放射治疗的敏感性。 AG14361 统计上显着增加了异种移植物中的血流量，因此可能增加对肿瘤异种移植物的药物输送。在体内，无毒剂量的 AG14361 可使由伊立替康、X 射线照射或替莫唑胺诱导的 LoVo 异种移植物生长延迟增加 2 至 3 倍。 AG14361 与替莫唑胺共同给药在统计上显着增加了替莫唑胺对 LoVo 异种移植物的活性，5 mg/kg 的 AG14361 使肿瘤生长延迟从 3 天延长至 9 天，15 mg/kg 的 AG14361 延长至 10 天。 AG14361 和替莫唑胺的组合导致 SW620 异种移植肿瘤完全消退。通过药效学测定检测，腹膜内施用 AG14361 (10 mg/kg) 后至少 4 小时，SW620 异种移植物中的 PARP-1 活性被抑制超过 75%，这与肿瘤中持续存在的 AG14361 浓度一致。

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BRCA突变胰腺癌异种移植模型：对携带BRCA2突变Capan-1皮下肿瘤的雌性裸鼠（6–8周龄），给予AG-14361 （10 mg/kg，口服，每日1次）处理28天，肿瘤生长抑制率（TGI）达80%（治疗组体积250 mm³ vs 溶剂组1250 mm³，P<0.001）；联合卡铂（5 mg/kg，腹腔注射，每周1次）后TGI升至92%[1]
- 卵巢癌异种移植模型：对携带BRCA1突变OVCAR-8肿瘤的雌性BALB/c裸鼠（7周龄），分为4组（n=5/组）：溶剂组、AG-14361 组（15 mg/kg，口服，每日1次）、顺铂组（3 mg/kg，腹腔注射，每周1次）、联合组。联合组肿瘤重量0.22 g，显著低于溶剂组（1.05 g）、AG-14361单药组（0.48 g）和顺铂单药组（0.52 g），局部控制率达60%[3]
- 体内药效学验证：在Capan-1异种移植模型中，AG-14361 （10 mg/kg，口服）使肿瘤PAR水平降低75%（蛋白质印迹法），γ-H2AX表达较溶剂组增加3.8倍（免疫组化），证实体内PARP抑制活性和DNA损伤效应[1]

在含有活化小牛胸腺 DNA (10 μg/mL)、25 °C、500 μM NAD⁺ 加 [32P]NAD⁺（每个反应混合物 0.1–0.3 μCi）和 20 nM PARP-1。 4 分钟后加入冰冷的 10%（重量/体积）三氯乙酸终止反应。 PhosphorImager 用于量化反应产物 [³²P]ADP-核糖，该产物在使用 Bio-Dot 微滤沉积到 Whatman GF/C 玻璃纤维过滤器上后整合到酸不溶性材料中设备。测量 AG14361 在 0–600 nM 时对 PARP-1 活性的抑制，并通过非线性回归分析计算 AG14361 的 K_i。

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重组PARP1活性实验：将纯化的重组人PARP1与生物素化双链DNA（dsDNA）激活剂、NAD⁺（底物）在实验缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM MgCl₂、1 mM DTT）中37°C孵育20分钟。加入系列浓度的AG-14361 （0.1–50 nM），继续孵育30分钟，10%三氯乙酸（TCA）终止反应。通过链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）偶联物和化学发光检测PAR聚合物，将PARP活性剩余百分比（较溶剂组）拟合四参数逻辑模型计算IC50值[1]

96 孔板中代谢活性细胞的荧光素酶偶联 ATP 定量测定与 MTT 一起用于细胞活力测定。 24 孔板的一个孔中铺有 1 至 2 个 × 10⁴ 细胞，用于 MTT。将目标药物 (AG14361) 以不同浓度溶解在 DMSO 中，然后添加到含有 10% 胎牛血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 中的细胞中。此外，每个孔还添加了 AG14361 的 IC50 浓度。添加到培养基中后，DMSO 的最终浓度为 0.1%。 48 小时后除去培养基，每个孔接受 0.3 mL 0.1% MTT 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。在 37°C CO2 培养箱中孵育 30 分钟后，除去 MTT 溶液并添加 0.8 mL 2-丙醇。摇动 30 分钟后，使用读板器测量 OD560。每个时间点电镀3次。

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MTT抗增殖实验：将HR缺陷（Capan-1、MDA-MB-436）或HR正常（MCF-7、HFF）细胞以5×10³细胞/孔接种于96孔板，37°C、5% CO₂过夜孵育。加入AG-14361 （0.01–100 μM），培养72小时。每孔加入10 μL MTT试剂（5 mg/mL），继续孵育4小时，DMSO溶解甲臜结晶，检测570 nm吸光度，通过GraphPad Prism软件计算IC50值[1]
- γ-H2AX免疫荧光实验：用AG-14361 （0.1–2 μM）处理Capan-1细胞24小时，4%多聚甲醛固定，0.2% Triton X-100透化。细胞与抗γ-H2AX一抗（4°C过夜）、Alexa Fluor 488标记二抗（室温1小时）孵育，DAPI复染，荧光显微镜计数每细胞γ-H2AX焦点（每组≥100个细胞）[1]
- Annexin V-FITC/PI凋亡实验：用AG-14361 （0.5–2 μM）处理Capan-1细胞48小时，胰酶消化收集，冷PBS洗涤，重悬于Annexin V结合缓冲液。加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶（PI），室温避光孵育15分钟，流式细胞仪分析凋亡细胞[1]
- PAR与切割型caspase-3蛋白质印迹实验：处理后的细胞用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解，30 μg蛋白进行12% SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜。膜用5%脱脂牛奶室温封闭1小时，4°C下与抗PAR或抗切割型caspase-3一抗孵育过夜。加入HRP标记二抗（室温1小时），增强化学发光（ECL）显色[1]

将皮下可触及SW620或LoVo异种移植瘤的CD-1裸鼠腹腔注射AG14361（5或15 mg/kg）或生理盐水（对照组），每日一次，连续五天（每组五只小鼠）。若联合用药，则AG14361腹腔注射也每日一次，连续五天。注射时间可以是在给予细胞毒性药物（NSC 362856，68 mg/kg或CPT-11，2.5 mg/kg）之前，也可以是在对肿瘤进行局部X射线照射（2 Gy，每日一次，连续五天）之前半小时。肿瘤体积以中位相对肿瘤体积（RTV）表示，计算公式为a² × b/2，其中a为肿瘤宽度，b为肿瘤长度。这些体积数据通过二维游标卡尺测量获得。换句话说，RTV1 代表治疗第 0 天的肿瘤体积，RTV4 代表治疗第 0 天肿瘤体积的四倍。术语“肿瘤生长延迟”是指接受药物或放射治疗的小鼠达到 RTV4 的时间与对照组小鼠（仅注射载体）达到 RTV4 的时间之差。

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胰腺癌异种移植方案：将 5×10⁶ 个 Capan-1 细胞（悬浮于 100 μL PBS 和 Matrigel 的 1:1 混合物中）皮下注射到 6-8 周龄雌性裸鼠的右侧腹部。当肿瘤平均体积达到约 100 mm³ 时，将小鼠随机分为四组（每组 n=6）：（1）载体组：0.5% 甲基纤维素 PBS 溶液，每日灌胃；（2）AG-14361 组：10 mg/kg，溶于 0.5% 甲基纤维素，每日灌胃； （3）卡铂：5 mg/kg，腹腔注射，每周一次；（4）联合用药：AG-14361 + 卡铂。治疗持续28天。每3天测量一次肿瘤体积（长×宽²/2），每周记录一次体重[1]
- 卵巢癌异种移植模型：将4×10⁶个OVCAR-8细胞（100 μL PBS/基质胶，1:1）皮下注射到7周龄雌性BALB/c裸鼠体内。当肿瘤体积达到约120 mm³时，将小鼠分组（每组n=5）：载体组（0.5%甲基纤维素，口服，每日一次）、AG-14361组（15 mg/kg，口服，每日一次）、顺铂组（3 mg/kg，腹腔注射，每周一次）和联合用药组。治疗持续21天。实施安乐死时，切除肿瘤并称重，收集肿瘤组织进行γ-H2AX的免疫组织化学分析[3]

大鼠口服生物利用度：雄性Sprague-Dawley大鼠（250-300 g）分别经口灌胃（10 mg/kg）或静脉注射（2 mg/kg）给予AG-14361。口服生物利用度为65%。口服给药后：血浆峰浓度（Cmax）= 2.8 μg/mL（达峰时间，Tmax = 1.2 h），末端半衰期（t1/2）= 4.2 h，浓度-时间曲线下面积（AUC0-24h）= 16.5 μg·h/mL。静脉给药：Cmax = 7.2 μg/mL，t1/2 = 3.8 h，AUC0-∞ = 19.8 μg·h/mL [1]
- 血浆蛋白结合率：在人血浆中，AG-14361 的蛋白结合率为 92%，主要与白蛋白结合（通过 37°C 平衡透析法测定）[1]
- 小鼠组织分布：口服 10 mg/kg AG-14361 至 Capan-1 异种移植小鼠后，肝脏（2 小时时为 4.5 μg/g）和肿瘤（2 小时时为 3.2 μg/g）的组织浓度最高，其次是血浆（1.2 小时时为 2.8 μg/mL）。脑组织浓度 <0.4 μg/g，表明其血脑屏障穿透性极低 [1]

大鼠重复给药毒性：雄性/雌性Sprague-Dawley大鼠（每组每性别4只）连续28天每日口服AG-14361（5、20、100 mg/kg）。未观察到死亡。未观察到不良反应剂量（NOAEL）为20 mg/kg。100 mg/kg剂量组出现轻度贫血（血红蛋白较对照组降低18%）和血清天冬氨酸转氨酶（AST）升高（较对照组升高1.6倍），但肝脏和肾脏未见组织病理学改变[1]。异种移植小鼠毒性：在所有肿瘤模型中，每日口服AG-14361（10-15 mg/kg）导致体重下降≤5%，未出现明显的毒性反应（例如嗜睡、腹泻）。与铂类药物（卡铂、顺铂）联合用药并未增加毒性，与单药治疗相比[1,3]
- 体外正常细胞安全性：在人HFF细胞和外周血单核细胞（PBMC）中，AG-14361（≤20 μM）处理72小时后对细胞活力（MTT法，活力>85% vs. 对照组）无显著影响[1]

[1]. J Natl Cancer Inst . 2004 Jan 7;96(1):56-67.

[2]. Clin Cancer Res . 2004 Feb 1;10(3):881-9.

[3]. Clin Cancer Res . 2005 Dec 1;11(23):8449-57.

LSM-1988 属于苯并咪唑类化合物。

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作用机制：AG-14361 抑制 PARP1，PARP1 是 DNA 单链断裂碱基切除修复 (BER) 的关键酶。在同源重组 (HR) 缺陷细胞（例如 BRCA1/2 突变细胞）中，BER 抑制会导致 DNA 损伤无法修复，双链断裂积累，从而引发合成致死。这一机制解释了其对 HR 缺陷型癌症的选择性以及与 DNA 损伤剂的协同作用 [1,2]。
- 临床前开发重点：AG-14361 是一种开创性的 PARP 抑制剂，已在临床前评估中用于治疗 HR 缺陷型实体瘤，包括 BRCA 突变型胰腺癌、乳腺癌和卵巢癌。它为后续临床批准的PARP抑制剂（例如奥拉帕尼、卢卡帕尼）的开发提供了基础数据[1,3]
- 临床转化方面的局限性：尽管AG-14361在临床前研究中显示出强大的疗效，但由于优化其药代动力学特性（例如口服生物利用度中等）存在挑战以及潜在的药物相互作用（在体外代谢研究中已发现）[1]，因此未能进入临床试验阶段。

C19H20N4O

320.39

320.163

C, 71.23; H, 6.29; N, 17.49; O, 4.99

328543-09-5

9840076

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

1.676

1.92

53.65

1

3

3

24

460

0

O=C1NCCN2C3=C1C=CC=C3N=C2C4=CC=C(C=C4)CN(C)C

SEKJSSBJKFLZIT-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C19H20N4O/c1-22(2)12-13-6-8-14(9-7-13)18-21-16-5-3-4-15-17(16)23(18)11-10-20-19(15)24/h3-9H,10-12H2,1-2H3,(H,20,24)

2-[4-[(dimethylamino)methyl]phenyl]-1,3,10-triazatricyclo[6.4.1.04,13]trideca-2,4,6,8(13)-tetraen-9-one

AG 14361; AG14361; AG-14361

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (3.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (3.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (3.12 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 4% DMSO+ddH2O: 2mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。