EGFR (IC50 = 0.5 nM); ErbB2 (IC50 = 3 nM); EGFR L858R/T790M (IC50 = 12 nM); ErbB4 (IC50 = 0.8 nM)
Allitinib (AST 1306) is an irreversible inhibitor of epidermal growth factor receptor 1 (EGFR/HER1, IC₅₀ = 7.6 nM) and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2/ErbB2, IC₅₀ = 5.7 nM) [1]
It shows no significant inhibitory activity against VEGFR2, PDGFRβ, or c-Met (IC₅₀ > 1000 nM) [1]

AST-1306也是ErB2和EGFR T790M/L858R双突变体。 AST-1306 的效力比拉帕替尼强约 500 倍，对 ErbB 家族激酶的选择性比其他激酶家族（包括 PDGFR、KDR 和 c-Met）高 3000 倍以上。 AST-1306 可能与 EGFR 和 ErbB2 的特定氨基酸残基共价结合。 AST-1306 以浓度依赖性方式显着抑制 HIH3T3-EGFR T790M/L858R 细胞的生长。 AST-1306 有效抑制 HIH3T3-EGFR T790M/L858R 细胞中的 EGFR 磷酸化。此外，AST-1306 以浓度依赖性方式阻断携带 EGFR T790M/L858R 突变的 NCI-H1975 细胞的生长。 AST-1306 还可阻断 EGFR 和下游通路的磷酸化。此外，AST-1306 剂量依赖性地显着抑制 A549 细胞中 EGF 诱导的 EGFR 磷酸化。 AST-1306 抑制 EGFR 和 ErbB2 的磷酸化以及人类癌细胞（包括 A549 细胞、Calu-3 细胞和 SK-OV-3 细胞）中的下游信号传导。激酶测定：在预涂有 20 μg/mL Poly (Glu,Tyr)4:1 的 96 孔 ELISA 板中测定酪氨酸激酶活性。首先，将用激酶反应缓冲液（50 mM HEPES pH 7.4、20 mM MgCl2、0.1 mM MnCl2、0.2 mM Na3VO4、1 mM DTT）稀释的 80 μL 5 μM ATP 溶液添加到每个孔中。然后将稀释在 10 μL 1% DMSO (v/v) 中的不同浓度的 AST-1306 添加到每个反应孔中，并使用 1% DMSO (v/v) 作为阴性对照。随后，通过添加稀释在 10 μL 激酶反应缓冲溶液中的纯化酪氨酸激酶蛋白来启动激酶反应。每个浓度的实验一式两份进行。 37°C 孵育 60 分钟后，用含有 0.1% Tween 20 (T-PBS) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤板 3 次。接下来，添加在含有 5 mg/mL BSA 的 T-PBS 中稀释的 100 μL 抗磷酸酪氨酸抗体（PY99，1:500 稀释）。 37°C 孵育 30 分钟后，将板如前清洗 3 次。添加辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠 IgG (100 μL)，在含有 5 mg/mL BSA 的 T-PBS 中按 1:2000 稀释。将板在 37°C 下重新孵育 30 分钟，然后用 PBS 清洗。最后，加入 100 μL 0.1 M 柠檬酸盐缓冲液（pH 5.5）中含有 0.03% H2O2 和 2 mg/mL 邻苯二胺的溶液，并将样品在室温下孵育直至出现颜色。添加 50 μL 2 M H2SO4 终止反应，并使用多孔分光光度计在 490 nm 处读取板的读数。使用以下等式计算抑制率(%)：[1-(A490处理/A490对照)]×100%。 IC50值由至少三个独立测试的结果确定并通过Logit方法计算。细胞测定：使用SRB（磺胺罗丹明B）测定评估细胞（Calu-3、A-549细胞系等）增殖。简而言之，将细胞接种到 96 孔板中并生长 24 小时。然后用增加浓度的 AST-1306 处理细胞并再生长 72 小时。培养基保持不变直至实验完成。然后将细胞用 10% 预冷的三氯乙酸 (TCA) 在 4 °C 下固定 1 小时，并在室温下用 100 μL 4 mg/mL SRB 的 1% 乙酸溶液染色 15 分钟。然后除去 SRB，并用 1% 乙酸快速冲洗细胞五次。细胞风干后，将蛋白质结合染料溶解在 150 μL 10 mM Tris 碱中 5 分钟，并使用多孔分光光度计在 515 nm 处进行测量。细胞增殖抑制率计算为（1-A515处理/A515对照）×100%。 IC50值通过Logit方法获得，并由至少3次独立测试的结果确定。

---

阿利替尼（AST 1306）剂量依赖性抑制EGFR/HER2过表达的癌细胞系增殖，包括A431（EGFR过表达，IC₅₀=0.04μM）、SK-BR-3（HER2过表达，IC₅₀=0.06μM）和NCI-H1975（EGFR L858R/T790M，IC₅₀=0.08μM）。浓度≥0.1μM时，可阻断EGFR/HER2磷酸化及下游AKT/ERK1/2信号通路[1]
该药物诱导A431细胞发生G2/M期周期阻滞和凋亡，凋亡EC₅₀=0.12μM，上调切割型caspase-3、-9和PARP的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2[1]
在吉非替尼耐药的NCI-H1975细胞中，阿利替尼（AST 1306）（0.1μM）可恢复对EGFR抑制的敏感性，细胞活力降低约75%，并抑制耐药克隆的形成[1]
在0.1μM浓度下，通过下调基质金属蛋白酶（MMP-2和MMP-9）的表达，抑制SK-BR-3细胞的迁移和侵袭约60%[1]

每天两次口服 AST-1306 可显着预防 SK-OV-3 和 Calu-3 异种移植模型中的肿瘤生长。在 SK-OV-3 模型中，用 AST-1306 治疗 7 天后，肿瘤几乎消失。相比之下，AST-1306 仅轻微抑制 HO-8910 和 A549 异种移植模型中的肿瘤生长。因此，AST-1306 在 ErbB2 过表达肿瘤模型中的抗肿瘤功效高于表达低水平 ErbB2 的肿瘤模型。 AST-1306 具有良好的耐受性。拉帕替尼在这些 ErbB2 过表达肿瘤模型中显示出抗肿瘤活性，但在相同剂量和给药方案下，AST-1306 在 SK-OV-3 异种移植肿瘤模型中比拉帕替尼更有效。此外，每天两次口服 AST-1306，持续 3 周，可显着抑制 FVB-2/Nneu 模型中的肿瘤生长。治疗11天后，肿瘤几乎完全消失。治疗期间小鼠的体重减少了不到20%。

---

阿利替尼（AST 1306）以20mg/kg/天的剂量口服给药21天，显著抑制裸鼠A431异种移植瘤的生长。与对照组相比，肿瘤体积减少约78%，瘤内EGFR磷酸化水平和Ki-67表达显著下调[1]
在携带SK-BR-3异种移植瘤的裸鼠中，该药物（25mg/kg/天，口服28天）的肿瘤生长抑制率达72%，中位生存期延长45%[1]
具有优异的肿瘤穿透性，给药后4小时肿瘤与血浆浓度比为2.1，在肿瘤组织中维持有效药物浓度超过12小时[1]

酪氨酸激酶活性在预涂有 20 μg/mL Poly (Glu,Tyr)4:1 的 96 孔 ELISA 板中测量。最初，每个孔接受 80 μL 稀释的 5 μM ATP 激酶反应缓冲液，其中包括 50 mM HEPES pH 7.4、20 mM MgCl2、0.1 mM MnCl2、0.2 mM Na3VO4 和 1 mM DTT。接下来，将不同浓度的 AST-1306 添加到每个反应孔中，并以 10 μL 1% DMSO (v/v) 作为阴性对照。在 10 μL 激酶反应缓冲溶液中添加稀释的纯化酪氨酸激酶蛋白，然后开始激酶反应。在每个浓度下，进行重复实验。将板在 37°C 下孵育 60 分钟。随后，使用含有 0.1% Tween 20 (T-PBS) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗 3 次。随后，添加 100 μL 稀释的抗磷酸酪氨酸抗体（PY99，1:500 稀释）在含有 5 mg/mL BSA 的 T-PBS 中。 37°C 孵育 30 分钟后，将板清洗 3 次。添加与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠 IgG (100 μL)，在添加了 5 mg/mL BSA 的 T-PBS 中按 1:2000 稀释。在 37°C 下重新孵育 30 分钟后，用 PBS 清洁板。最后，加入 100 μL 0.1 M 柠檬酸盐缓冲液（pH 5.5）中含有 0.03% H2O2 和 2 mg/mL 邻苯二胺的溶液，在室温下孵育样品直至显色。加入50 μL 2 M H2SO4 后，停止反应，用多孔分光光度计在490 nm 处测量板的波长。使用下式计算抑制率(%)：[1-(A490处理/A490对照)]×100%。 Logit 方法用于计算 IC50 值，该值源自至少三个独立测试的结果。

---

将重组EGFR和HER2激酶结构域分别与ATP及特异性多肽底物在系列稀释的阿利替尼（AST 1306）（0.001-10μM）存在下孵育，反应在37°C下进行60分钟，采用均相时间分辨荧光（HTRF）法检测磷酸化底物。通过与溶媒对照组的荧光强度对比计算抑制率，从量效曲线中得出IC₅₀值[1]
为证实不可逆结合特性，将药物与EGFR/HER2激酶结构域预孵育30分钟后再加入ATP和底物。加入终止缓冲液终止反应，定量磷酸化水平以验证时间依赖性抑制活性[1]

使用 SRB（磺酰罗丹明 B）测定法评估细胞（Calu-3、A-549 细胞系等）的增殖。综上所述，细胞接种到96孔板后培养24小时。处理后，细胞在逐渐升高的 AST-1306 浓度下再生长 72 小时。在实验结束之前，介质保持不变。在 4 °C 下使用 10% 预冷的三氯乙酸 (TCA) 1 小时后，使用 100 μL 4 mg/mL SRB 的 1% 乙酸溶液在室温下对细胞染色 15 分钟。去除 SRB 后，用 1% 乙酸快速洗涤细胞五次。空气干燥细胞后，使用 150 μL 10 mM Tris 碱溶解蛋白质结合染料，然后使用多孔分光光度计在 515 nm 处测量五分钟。 (1-A515处理/A515对照)×100%是用于确定细胞增殖抑制率的公式。通过使用 Logit 方法，IC50 值是根据至少三个独立测试的结果计算得出的。

---

将A431、SK-BR-3和NCI-H1975细胞以5×10³个细胞/孔接种到96孔板中，用阿利替尼（AST 1306）（0.01-1μM）处理72小时，采用四唑盐法检测细胞活性并计算IC₅₀值[1]
细胞周期分析中，用该药物（0.05-0.2μM）处理A431细胞24小时，70%乙醇固定，碘化丙啶染色后通过流式细胞术分析。采用Annexin V-FITC/PI双染色检测凋亡，通过蛋白质印迹法用抗磷酸化EGFR/HER2、AKT、ERK1/2、切割型caspase-3、PARP、Bcl-2和GAPDH的抗体评估蛋白表达[1]
用阿利替尼（AST 1306）（0.05-0.2μM）处理SK-BR-3细胞24小时，采用Boyden小室进行迁移和侵袭实验，通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）定量MMP-2/MMP-9 mRNA的表达[1]

裸鼠携带SK-OV-3和Calu-3肿瘤[1]
25、50、100 mg/kg
口服；每日两次；持续28天

---

将A431细胞（5×10⁶个细胞/只）皮下植入6-8周龄的裸鼠体内，建立异种移植瘤模型。当肿瘤体积达到100-150 mm³时，将小鼠随机分为对照组和治疗组。阿利替尼（AST 1306）悬浮于0.5%羧甲基纤维素溶液中，以20 mg/kg/天的剂量口服给药，持续21天。每隔3天使用游标卡尺测量肿瘤体积，处死小鼠并收集肿瘤组织，用于EGFR磷酸化Western blot分析和Ki-67免疫组化染色[1]。
携带SK-BR-3异种移植瘤的裸鼠以25 mg/kg/天的剂量口服药物，持续28天。每日记录生存时间，并收集肿瘤组织，通过免疫组化检测MMP-2/MMP-9的表达[1]。

阿利替尼 (AST 1306)在小鼠中单次口服20 mg/kg后的生物利用度约为76%。给药后1.5小时达到最大血浆浓度 (Cmax) 为5.2 μg/mL，血浆半衰期 (t₁/₂) 约为10.8小时[1]
在大鼠中，口服25 mg/kg后，24小时AUC₀为58.6 μg·h/mL。该药物广泛分布于肿瘤组织、肝脏和肺脏，脑组织浓度较低[1]

小鼠以20 mg/kg/天的剂量接受阿利替尼（AST 1306）治疗21天后，体重略有下降（约6%），但未出现明显的肝肾毒性。血清ALT、AST、肌酐和BUN水平均在正常范围内[1]。
通过平衡透析法测定，该药物在人血浆中的血浆蛋白结合率约为92%[1]。
体外细胞毒性试验表明，浓度高达1 μM时，该药物对正常人支气管上皮细胞（BEAS-2B）无显著损伤[1]。

[1]. AST1306, a novel irreversible inhibitor of the epidermal growth factor receptor 1 and 2, exhibits antitumor activity both in vitro and in vivo. PLoS One. 2011;6(7):e21487.

N-[4-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯胺基]-6-喹唑啉基]-2-丙烯酰胺属于喹唑啉类化合物。
阿利替尼是一种口服生物利用度高的不可逆受体酪氨酸激酶（RTK）抑制剂，可抑制表皮生长因子受体1（EGFR；ErbB1）和2（ErbB2；HER2；HER-2），具有潜在的抗肿瘤活性。口服后，阿利替尼选择性地、不可逆地结合并抑制EGFR和HER2的活性，从而阻断EGFR和HER2介导的信号传导。这可能抑制过度表达这些RTK的肿瘤细胞的肿瘤生长和血管生成。EGFR和HER2是属于EGFR超家族的RTK。它们在肿瘤细胞增殖和肿瘤血管生成中发挥重要作用，并在多种癌细胞类型中过度表达。

---

阿利替尼（AST 1306）是一种新型不可逆小分子抑制剂，它与EGFR和HER2的ATP结合口袋共价结合（分别通过EGFR中的半胱氨酸残基C797和HER2中的C805），从而永久性地阻断其酪氨酸激酶活性[1]。
它的研发目的是为了克服非小细胞肺癌（NSCLC）中由EGFR T790M突变介导的吉非替尼耐药以及HER2阳性乳腺癌中由曲妥珠单抗耐药引起的耐药[1]。
临床前数据显示其具有显著的抗肿瘤疗效和良好的安全性，支持其作为EGFR/HER2阳性恶性肿瘤靶向治疗的潜力[1]。

C24H18CLFN4O2

448.88

448.11

C, 64.22; H, 4.04; Cl, 7.90; F, 4.23; N, 12.48; O, 7.13

897383-62-9

Allitinib tosylate;1050500-29-2

24739943

Off-white to light yellow solid powder

1.4±0.1 g/cm3

655.0±55.0 °C at 760 mmHg

349.9±31.5 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.700

5.02

79.63

2

6

7

32

641

0

FC1=CC=CC(COC2=C(Cl)C=C(NC3=NC=NC4=C3C=C(NC(C=C)=O)C=C4)C=C2)=C1

MVZGYPSXNDCANY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H18ClFN4O2/c1-2-23(31)29-17-6-8-21-19(11-17)24(28-14-27-21)30-18-7-9-22(20(25)12-18)32-13-15-4-3-5-16(26)10-15/h2-12,14H,1,13H2,(H,29,31)(H,27,28,30)

N-[4-[3-chloro-4-[(3-fluorophenyl)methoxy]anilino]quinazolin-6-yl]prop-2-enamide

Allitinib; AST1306; ALS-1306; ALS1306; AST 6; AST-6; AST-1306; Allitinib free base; AST 1306; ALS1306; AST6

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)