EGFR (IC50 = 0.5 nM); ErbB2 (IC50 = 3 nM); EGFR^L858R/T790M (IC50 = 12 nM); ErbB4 (IC50 = 0.8 nM)

体外活性：AST-1306也是ErB2和EGFR T790M/L858R双突变体。 AST-1306 的效力比拉帕替尼强约 500 倍，对 ErbB 家族激酶的选择性比其他激酶家族（包括 PDGFR、KDR 和 c-Met）高 3000 倍以上。 AST-1306 可能与 EGFR 和 ErbB2 的特定氨基酸残基共价结合。 AST-1306 以浓度依赖性方式显着抑制 HIH3T3-EGFR T790M/L858R 细胞的生长。 AST-1306 有效抑制 HIH3T3-EGFR T790M/L858R 细胞中的 EGFR 磷酸化。此外，AST-1306 以浓度依赖性方式阻断携带 EGFR T790M/L858R 突变的 NCI-H1975 细胞的生长。 AST-1306 还可阻断 EGFR 和下游通路的磷酸化。此外，AST-1306 剂量依赖性地显着抑制 A549 细胞中 EGF 诱导的 EGFR 磷酸化。 AST-1306 抑制 EGFR 和 ErbB2 的磷酸化以及人类癌细胞（包括 A549 细胞、Calu-3 细胞和 SK-OV-3 细胞）中的下游信号传导。激酶测定：在预涂有 20 μg/mL Poly (Glu,Tyr)4:1 的 96 孔 ELISA 板中测定酪氨酸激酶活性。首先，将用激酶反应缓冲液（50 mM HEPES pH 7.4、20 mM MgCl2、0.1 mM MnCl2、0.2 mM Na3VO4、1 mM DTT）稀释的 80 μL 5 μM ATP 溶液添加到每个孔中。然后将稀释在 10 μL 1% DMSO (v/v) 中的不同浓度的 AST-1306 添加到每个反应孔中，并使用 1% DMSO (v/v) 作为阴性对照。随后，通过添加稀释在 10 μL 激酶反应缓冲溶液中的纯化酪氨酸激酶蛋白来启动激酶反应。每个浓度的实验一式两份进行。 37°C 孵育 60 分钟后，用含有 0.1% Tween 20 (T-PBS) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤板 3 次。接下来，添加在含有 5 mg/mL BSA 的 T-PBS 中稀释的 100 μL 抗磷酸酪氨酸抗体（PY99，1:500 稀释）。 37°C 孵育 30 分钟后，将板如前清洗 3 次。添加辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠 IgG (100 μL)，在含有 5 mg/mL BSA 的 T-PBS 中按 1:2000 稀释。将板在 37°C 下重新孵育 30 分钟，然后用 PBS 清洗。最后，加入 100 μL 0.1 M 柠檬酸盐缓冲液（pH 5.5）中含有 0.03% H2O2 和 2 mg/mL 邻苯二胺的溶液，并将样品在室温下孵育直至出现颜色。添加 50 μL 2 M H2SO4 终止反应，并使用多孔分光光度计在 490 nm 处读取板的读数。使用以下等式计算抑制率(%)：[1-(A490处理/A490对照)]×100%。 IC50值由至少三个独立测试的结果确定并通过Logit方法计算。细胞测定：使用SRB（磺胺罗丹明B）测定评估细胞（Calu-3、A-549细胞系等）增殖。简而言之，将细胞接种到 96 孔板中并生长 24 小时。然后用增加浓度的 AST-1306 处理细胞并再生长 72 小时。培养基保持不变直至实验完成。然后将细胞用 10% 预冷的三氯乙酸 (TCA) 在 4 °C 下固定 1 小时，并在室温下用 100 μL 4 mg/mL SRB 的 1% 乙酸溶液染色 15 分钟。然后除去 SRB，并用 1% 乙酸快速冲洗细胞五次。细胞风干后，将蛋白质结合染料溶解在 150 μL 10 mM Tris 碱中 5 分钟，并使用多孔分光光度计在 515 nm 处进行测量。细胞增殖抑制率计算为（1-A515处理/A515对照）×100%。 IC50值通过Logit方法获得，并由至少3次独立测试的结果确定。

每天两次口服 AST-1306 可显着预防 SK-OV-3 和 Calu-3 异种移植模型中的肿瘤生长。在 SK-OV-3 模型中，用 AST-1306 治疗 7 天后，肿瘤几乎消失。相比之下，AST-1306 仅轻微抑制 HO-8910 和 A549 异种移植模型中的肿瘤生长。因此，AST-1306 在 ErbB2 过表达肿瘤模型中的抗肿瘤功效高于表达低水平 ErbB2 的肿瘤模型。 AST-1306 具有良好的耐受性。拉帕替尼在这些 ErbB2 过表达肿瘤模型中显示出抗肿瘤活性，但在相同剂量和给药方案下，AST-1306 在 SK-OV-3 异种移植肿瘤模型中比拉帕替尼更有效。此外，每天两次口服 AST-1306，持续 3 周，可显着抑制 FVB-2/Nneu 模型中的肿瘤生长。治疗11天后，肿瘤几乎完全消失。治疗期间小鼠的体重减少了不到20%。

酪氨酸激酶活性在预涂有 20 μg/mL Poly (Glu,Tyr)4:1 的 96 孔 ELISA 板中测量。最初，每个孔接受 80 μL 稀释的 5 μM ATP 激酶反应缓冲液，其中包括 50 mM HEPES pH 7.4、20 mM MgCl2、0.1 mM MnCl2、0.2 mM Na3VO4 和 1 mM DTT。接下来，将不同浓度的 AST-1306 添加到每个反应孔中，并以 10 μL 1% DMSO (v/v) 作为阴性对照。在 10 μL 激酶反应缓冲溶液中添加稀释的纯化酪氨酸激酶蛋白，然后开始激酶反应。在每个浓度下，进行重复实验。将板在 37°C 下孵育 60 分钟。随后，使用含有 0.1% Tween 20 (T-PBS) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗 3 次。随后，添加 100 μL 稀释的抗磷酸酪氨酸抗体（PY99，1:500 稀释）在含有 5 mg/mL BSA 的 T-PBS 中。 37°C 孵育 30 分钟后，将板清洗 3 次。添加与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠 IgG (100 μL)，在添加了 5 mg/mL BSA 的 T-PBS 中按 1:2000 稀释。在 37°C 下重新孵育 30 分钟后，用 PBS 清洁板。最后，加入 100 μL 0.1 M 柠檬酸盐缓冲液（pH 5.5）中含有 0.03% H2O2 和 2 mg/mL 邻苯二胺的溶液，在室温下孵育样品直至显色。加入50 μL 2 M H2SO4 后，停止反应，用多孔分光光度计在490 nm 处测量板的波长。使用下式计算抑制率(%)：[1-(A490处理/A490对照)]×100%。 Logit 方法用于计算 IC50 值，该值源自至少三个独立测试的结果。

使用 SRB（磺酰罗丹明 B）测定法评估细胞（Calu-3、A-549 细胞系等）的增殖。综上所述，细胞接种到96孔板后培养24小时。处理后，细胞在逐渐升高的 AST-1306 浓度下再生长 72 小时。在实验结束之前，介质保持不变。在 4 °C 下使用 10% 预冷的三氯乙酸 (TCA) 1 小时后，使用 100 μL 4 mg/mL SRB 的 1% 乙酸溶液在室温下对细胞染色 15 分钟。去除 SRB 后，用 1% 乙酸快速洗涤细胞五次。空气干燥细胞后，使用 150 μL 10 mM Tris 碱溶解蛋白质结合染料，然后使用多孔分光光度计在 515 nm 处测量五分钟。 (1-A515处理/A515对照)×100%是用于确定细胞增殖抑制率的公式。通过使用 Logit 方法，IC50 值是根据至少三个独立测试的结果计算得出的。

Nude mice with SK-OV-3 and Calu-3 tumors[1]
25, 50, 100 mg/kg
p.o; twice daily; for 28 days

[1]. AST1306, a novel irreversible inhibitor of the epidermal growth factor receptor 1 and 2, exhibits antitumor activity both in vitro and in vivo. PLoS One. 2011;6(7):e21487.

N-[4-[3-chloro-4-[(3-fluorophenyl)methoxy]anilino]-6-quinazolinyl]-2-propenamide is a member of quinazolines.
Allitinib is an orally bioavailable and irreversible inhibitor of the receptor tyrosine kinases (RTKs) epidermal growth factor receptors 1 (EGFR; ErbB1) and 2 (ErbB2; HER2; HER-2), with potential antineoplastic activity. Upon oral administration, allitinib selectively and irreversibly binds to and inhibits the activity of both EGFR and HER2, which prevents signaling mediated by EGFR and HER2. This may inhibit tumor growth and angiogenesis in tumor cells overexpressing these RTKs. EGFR and HER2 are RTKs that belong to the EGFR superfamily; they play major roles in both tumor cell proliferation and tumor vascularization and are overexpressed in many cancer cell types.

C24H18CLFN4O2

448.88

448.11

C, 64.22; H, 4.04; Cl, 7.90; F, 4.23; N, 12.48; O, 7.13

897383-62-9

Allitinib tosylate;1050500-29-2

24739943

Off-white to light yellow solid powder

1.4±0.1 g/cm3

655.0±55.0 °C at 760 mmHg

349.9±31.5 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.700

5.02

79.63

2

6

7

32

641

0

FC1=CC=CC(COC2=C(Cl)C=C(NC3=NC=NC4=C3C=C(NC(C=C)=O)C=C4)C=C2)=C1

MVZGYPSXNDCANY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H18ClFN4O2/c1-2-23(31)29-17-6-8-21-19(11-17)24(28-14-27-21)30-18-7-9-22(20(25)12-18)32-13-15-4-3-5-16(26)10-15/h2-12,14H,1,13H2,(H,29,31)(H,27,28,30)

N-[4-[3-chloro-4-[(3-fluorophenyl)methoxy]anilino]quinazolin-6-yl]prop-2-enamide

Allitinib; AST1306; ALS-1306; ALS1306; AST 6; AST-6; AST-1306; Allitinib free base; AST 1306; ALS1306; AST6

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)