EGFR (IC50 = 0.5 nM); ErbB2 (IC50 = 3 nM); EGFR^L858R/T790M (IC50 = 12 nM); ErbB4 (IC50 = 0.8 nM)

体外活性：AST-1306也是ErB2和EGFR T790M/L858R双突变体。 AST-1306 的效力比拉帕替尼强约 500 倍，对 ErbB 家族激酶的选择性比其他激酶家族（包括 PDGFR、KDR 和 c-Met）高 3000 倍以上。 AST-1306 可能与 EGFR 和 ErbB2 的特定氨基酸残基共价结合。 AST-1306 以浓度依赖性方式显着抑制 HIH3T3-EGFR T790M/L858R 细胞的生长。 AST-1306 有效抑制 HIH3T3-EGFR T790M/L858R 细胞中的 EGFR 磷酸化。此外，AST-1306 以浓度依赖性方式阻断携带 EGFR T790M/L858R 突变的 NCI-H1975 细胞的生长。 AST-1306 还可阻断 EGFR 和下游通路的磷酸化。此外，AST-1306 剂量依赖性地显着抑制 A549 细胞中 EGF 诱导的 EGFR 磷酸化。 AST-1306 抑制 EGFR 和 ErbB2 的磷酸化以及人类癌细胞（包括 A549 细胞、Calu-3 细胞和 SK-OV-3 细胞）中的下游信号传导。激酶测定：在预涂有 20 μg/mL Poly (Glu,Tyr)4:1 的 96 孔 ELISA 板中测定酪氨酸激酶活性。首先，将用激酶反应缓冲液（50 mM HEPES pH 7.4、20 mM MgCl2、0.1 mM MnCl2、0.2 mM Na3VO4、1 mM DTT）稀释的 80 μL 5 μM ATP 溶液添加到每个孔中。然后将稀释在 10 μL 1% DMSO (v/v) 中的不同浓度的 AST-1306 添加到每个反应孔中，并使用 1% DMSO (v/v) 作为阴性对照。随后，通过添加稀释在 10 μL 激酶反应缓冲溶液中的纯化酪氨酸激酶蛋白来启动激酶反应。每个浓度的实验一式两份进行。 37°C 孵育 60 分钟后，用含有 0.1% Tween 20 (T-PBS) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤板 3 次。接下来，添加在含有 5 mg/mL BSA 的 T-PBS 中稀释的 100 μL 抗磷酸酪氨酸抗体（PY99，1:500 稀释）。 37°C 孵育 30 分钟后，将板如前清洗 3 次。添加辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠 IgG (100 μL)，在含有 5 mg/mL BSA 的 T-PBS 中按 1:2000 稀释。将板在 37°C 下重新孵育 30 分钟，然后用 PBS 清洗。最后，加入 100 μL 0.1 M 柠檬酸盐缓冲液（pH 5.5）中含有 0.03% H2O2 和 2 mg/mL 邻苯二胺的溶液，并将样品在室温下孵育直至出现颜色。添加 50 μL 2 M H2SO4 终止反应，并使用多孔分光光度计在 490 nm 处读取板的读数。使用以下等式计算抑制率(%)：[1-(A490处理/A490对照)]×100%。 IC50值由至少三个独立测试的结果确定并通过Logit方法计算。细胞测定：使用SRB（磺胺罗丹明B）测定评估细胞（Calu-3、A-549细胞系等）增殖。简而言之，将细胞接种到 96 孔板中并生长 24 小时。然后用增加浓度的 AST-1306 处理细胞并再生长 72 小时。培养基保持不变直至实验完成。然后将细胞用 10% 预冷的三氯乙酸 (TCA) 在 4 °C 下固定 1 小时，并在室温下用 100 μL 4 mg/mL SRB 的 1% 乙酸溶液染色 15 分钟。然后除去 SRB，并用 1% 乙酸快速冲洗细胞五次。细胞风干后，将蛋白质结合染料溶解在 150 μL 10 mM Tris 碱中 5 分钟，并使用多孔分光光度计在 515 nm 处进行测量。细胞增殖抑制率计算为（1-A515处理/A515对照）×100%。 IC50值通过Logit方法获得，并由至少3次独立测试的结果确定。

每天两次口服 AST-1306 可显着预防 SK-OV-3 和 Calu-3 异种移植模型中的肿瘤生长。在 SK-OV-3 模型中，用 AST-1306 治疗 7 天后，肿瘤几乎消失。相比之下，AST-1306 仅轻微抑制 HO-8910 和 A549 异种移植模型中的肿瘤生长。因此，AST-1306 在 ErbB2 过表达肿瘤模型中的抗肿瘤功效高于表达低水平 ErbB2 的肿瘤模型。 AST-1306 具有良好的耐受性。拉帕替尼在这些 ErbB2 过表达肿瘤模型中显示出抗肿瘤活性，但在相同剂量和给药方案下，AST-1306 在 SK-OV-3 异种移植肿瘤模型中比拉帕替尼更有效。此外，每天两次口服 AST-1306，持续 3 周，可显着抑制 FVB-2/Nneu 模型中的肿瘤生长。治疗11天后，肿瘤几乎完全消失。治疗期间小鼠的体重减少了不到20%。

酪氨酸激酶活性在预涂有 20 μg/mL Poly (Glu,Tyr)4:1 的 96 孔 ELISA 板中测量。最初，每个孔接受 80 μL 稀释的 5 μM ATP 激酶反应缓冲液，其中包括 50 mM HEPES pH 7.4、20 mM MgCl2、0.1 mM MnCl2、0.2 mM Na3VO4 和 1 mM DTT。接下来，将不同浓度的 AST-1306 添加到每个反应孔中，并以 10 μL 1% DMSO (v/v) 作为阴性对照。在 10 μL 激酶反应缓冲溶液中添加稀释的纯化酪氨酸激酶蛋白，然后开始激酶反应。在每个浓度下，进行重复实验。将板在 37°C 下孵育 60 分钟。随后，使用含有 0.1% Tween 20 (T-PBS) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗 3 次。随后，添加 100 μL 稀释的抗磷酸酪氨酸抗体（PY99，1:500 稀释）在含有 5 mg/mL BSA 的 T-PBS 中。 37°C 孵育 30 分钟后，将板清洗 3 次。添加与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠 IgG (100 μL)，在添加了 5 mg/mL BSA 的 T-PBS 中按 1:2000 稀释。在 37°C 下重新孵育 30 分钟后，用 PBS 清洁板。最后，加入 100 μL 0.1 M 柠檬酸盐缓冲液（pH 5.5）中含有 0.03% H2O2 和 2 mg/mL 邻苯二胺的溶液，在室温下孵育样品直至显色。加入50 μL 2 M H2SO4 后，停止反应，用多孔分光光度计在490 nm 处测量板的波长。使用下式计算抑制率(%)：[1-(A490处理/A490对照)]×100%。 Logit 方法用于计算 IC50 值，该值源自至少三个独立测试的结果。

使用 SRB（磺酰罗丹明 B）测定法评估细胞（Calu-3、A-549 细胞系等）的增殖。综上所述，细胞接种到96孔板后培养24小时。处理后，细胞在逐渐升高的 AST-1306 浓度下再生长 72 小时。在实验结束之前，介质保持不变。在 4 °C 下使用 10% 预冷的三氯乙酸 (TCA) 1 小时后，使用 100 μL 4 mg/mL SRB 的 1% 乙酸溶液在室温下对细胞染色 15 分钟。去除 SRB 后，用 1% 乙酸快速洗涤细胞五次。空气干燥细胞后，使用 150 μL 10 mM Tris 碱溶解蛋白质结合染料，然后使用多孔分光光度计在 515 nm 处测量五分钟。 (1-A515处理/A515对照)×100%是用于确定细胞增殖抑制率的公式。通过使用 Logit 方法，IC50 值是根据至少三个独立测试的结果计算得出的。

Nude mice with SK-OV-3 and Calu-3 tumors[1]
25, 50, 100 mg/kg
p.o; twice daily; for 28 days

[1]. AST1306, a novel irreversible inhibitor of the epidermal growth factor receptor 1 and 2, exhibits antitumor activity both in vitro and in vivo. PLoS One. 2011;6(7):e21487.

C24H18CLFN4O2

448.88

448.11

C, 64.22; H, 4.04; Cl, 7.90; F, 4.23; N, 12.48; O, 7.13

897383-62-9

Allitinib tosylate;1050500-29-2

Solid powder

C=CC(=O)NC1=CC2=C(C=C1)N=CN=C2NC3=CC(=C(C=C3)OCC4=CC(=CC=C4)F)Cl

MVZGYPSXNDCANY-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C24H18ClFN4O2/c1-2-23(31)29-17-6-8-21-19(11-17)24(28-14-27-21)30-18-7-9-22(20(25)12-18)32-13-15-4-3-5-16(26)10-15/h2-12,14H,1,13H2,(H,29,31)(H,27,28,30)

N-[4-[3-chloro-4-[(3-fluorophenyl)methoxy]anilino]quinazolin-6-yl]prop-2-enamide

Allitinib; AST1306; ALS-1306; ALS1306; AST 6; AST-6; AST-1306; Allitinib free base; AST 1306; ALS1306; AST6

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)