Aloxistatin (Loxistatin; E64d, NSC-694281)   中文名称: 阿洛司他丁

Cysteine protease
Cysteine proteases:
- Cathepsin B (human recombinant): Ki ≈ 0.04 μM (fluorogenic substrate assay) [1]
- Cathepsin L (rat liver purified): IC₅₀ ≈ 0.08 μM (azocasein hydrolysis assay) [2]
- Cathepsin C (bovine spleen purified): IC₅₀ ≈ 0.2 μM (glycyl-phenylalanyl-4-methoxy-β-naphthylamide cleavage assay) [1]
- Selectivity over serine proteases: No inhibition of trypsin or chymotrypsin (10 μM Aloxistatin, casein hydrolysis assay) [1]

Aloxistatin（也称为 E-64d、E-64c 乙酯；Loxistatin；NSC 694281）是一种有效的、选择性的、不可逆的、广谱的、细胞膜可渗透的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。 Aloxistatin 可防止体外雨蛙蛋白诱导的胰蛋白酶原激活。阿洛司他汀可以进入完整细胞并抑制钙蛋白酶。 E-64d 已被证明对于治疗人类阿尔茨海默病是安全的。 Aloxistatin 通过调节异常的锌信号转导以及通过海马中的 ApoE/clusterin 途径调节脂质代谢改变，可潜在用于治疗发育性癫痫诱发的脑损伤。阿洛司他汀可以进入完整的血小板，通过抑制钙蛋白酶来抑制蛋白水解。 Aloxistatin 在体外可抑制甲状旁腺激素 (PTH) 诱导的细胞增殖并抑制成骨细胞的分化。激酶测定：在 24 孔板中，用抑制剂 L1 (10-20 μM) 或阿洛司他丁 (20-30 μM) 在 37°C 下处理 CTL 和 NK 细胞 (0.8×106/mL) 24 小时。然后将细胞用于 51 Cr 释放测定或裂解以在蛋白质印迹中检查穿孔素。如所示，在一些 51 Cr 释放测定中，在 4 小时反应期间也以相同浓度添加抑制剂。使用 NP-40 裂解缓冲液（25 mM HEPES、250 mM NaCl、2.5 mM 乙二胺四乙酸、0.1% 体积/体积 Nonidet P-40）制备细胞裂解物，并使用 Bradford 测定法测定总蛋白浓度。等量的蛋白质上样并在 8% SDS-PAGE 凝胶上解析。使用指定的适当抗体检测人或小鼠穿孔素。抗肌动蛋白抗体用作上样对照。细胞测定：用 A23187 加钙激活血小板，已知这种情况会导致钙蛋白酶催化 ABP 和 talin 蛋白水解。在没有抑制剂的情况下，A23187 导致 ABP 和talin 完全降解。 E 64d，渗透抑制剂，确实抑制细胞内蛋白水解。在最低测试浓度 20 μg/ml 下观察到了一些抑制作用，而在 50 μg/ml 下则获得了基本上完全的抑制作用。

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半胱氨酸蛋白酶抑制活性（文献[1]、[2]）:
1. 组织蛋白酶B抑制：Aloxistatin（0.01–1 μM）浓度依赖性抑制人重组组织蛋白酶B。0.1 μM时抑制率达~90%（Z-Arg-Arg-AMC荧光底物实验）[1]
2. 组织蛋白酶L抑制：0.1 μM Aloxistatin抑制大鼠肝脏组织蛋白酶L介导的偶氮酪蛋白降解~85%，IC₅₀≈0.08 μM[2]
- 癌细胞自噬调控:
1. 人乳腺癌MCF-7细胞：10 μM Aloxistatin处理24小时，LC3-II/LC3-I比值上调~3.2倍（Western blot），提示自噬诱导；自噬底物p62水平较对照组降低~60%[6]
2. 小鼠黑色素瘤B16细胞：5 μM Aloxistatin增强自噬流：mRFP-GFP-LC3斑点（自噬体）荧光强度上调~2.8倍（共聚焦显微镜）[6]
- 阿尔茨海默病（AD）相关活性:
1. 大鼠原代皮质神经元：2 μM Aloxistatin处理48小时，Aβ₄₂分泌减少~45%（ELISA）。Western blot显示β-分泌酶（BACE1）蛋白水平无变化，而Aβ降解酶组织蛋白酶B活性上调~30%[5]

E-64d 治疗后，用青霉素治疗小鼠以诱导复发性癫痫发作。结果表明，E-64d显着减少了齿状回颗粒上区和海马CA3亚区的异常苔藓纤维萌芽。在未经E-64d治疗的大鼠中，在齿状回和CA3亚区的锥体层中存在明显的苔藓纤维末端聚集。在用 E-64d 治疗的大鼠中，齿状回颗粒上区域和 CA3 亚区的苔藓纤维末端聚集显着减少。

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小鼠AD模型（APP/PS1转基因小鼠，文献[5]）:
1. 分组：6月龄小鼠（n=8/组）随机分为2组：（1）溶剂对照组（腹腔注射10% DMSO+90%生理盐水）；（2）Aloxistatin 1 mg/kg组[5]
2. 给药方案：腹腔注射，每日1次，持续4周[5]
3. 疗效:
- 脑内Aβ₄₂水平：海马区较对照组降低~40%，皮质区降低~35%（ELISA）；
- 认知功能：Morris水迷宫实验显示逃避潜伏期较对照组缩短~30%；
- 小胶质细胞活化：海马区Iba1⁺小胶质细胞数量减少~25%（免疫组织化学）[5]
- 小鼠黑色素瘤异种移植模型:
1. 给药方案：B16肿瘤体积达~100 mm³时开始，Aloxistatin 5 mg/kg（腹腔注射，每2天1次），持续14天[6]
2. 疗效:
- 肿瘤体积：较溶剂对照组减少~55%；
- 肿瘤自噬：肿瘤组织中LC3-II水平上调~2.5倍（Western blot）；
- 对小鼠体重无显著影响（较基线变化<5%）[6]

将抑制剂 L1 (10–20 μM) 或 Aloxistatin (20–30 μM) 应用于 CTL 和 NK 细胞 (0.8×106/mL)，在 37°C 下在 24 孔板中持续 24 小时。之后，将细胞用于 51 Cr 释放实验或裂解细胞以在蛋白质印迹分析中观察穿孔素。一些 51Cr 释放测定还在 4 小时反应期间添加相同浓度的抑制剂，如图所示。使用 NP-40 裂解缓冲液（25 mM HEPES、250 mM NaCl、2.5 mM 乙二胺四乙酸、0.1% 体积/体积 Nonidet P-40）制备细胞裂解液，并使用 Bradford 法测定总蛋白浓度。将等量的蛋白质上样并解析到 8% SDS-PAGE 凝胶上。按照指示使用正确的抗体来检测人或小鼠穿孔素。使用抗肌动蛋白抗体作为上样对照。

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组织蛋白酶B活性抑制实验:
1. 蛋白制备：人重组组织蛋白酶B在大肠杆菌中表达，镍螯合层析纯化，在50 mM醋酸钠缓冲液（pH5.5）中用10 mM DTT激活[1]
2. 反应体系：100 μL混合物含激活的组织蛋白酶B（0.5 μg）、荧光底物Z-Arg-Arg-AMC（20 μM）、Aloxistatin（0.01–1 μM）及50 mM醋酸钠缓冲液（pH5.5），溶剂（DMSO）作为对照[1]
3. 孵育与检测：37℃孵育60分钟，每10分钟测定荧光强度（激发光360 nm，发射光460 nm）。抑制率=（1–药物组荧光强度/对照组荧光强度）×100%[1]
4. 数据分析：Lineweaver-Burk双倒数作图（竞争性抑制模型）计算Ki值[1]
- 组织蛋白酶L活性抑制实验:
1. 蛋白制备：大鼠肝脏中通过离子交换层析纯化组织蛋白酶L，在0.1 M Tris-HCl缓冲液（pH7.5）中用5 mM DTT激活[2]
2. 反应体系：200 μL混合物含组织蛋白酶L（1 μg）、底物偶氮酪蛋白（1%，w/v）、Aloxistatin（0.02–0.5 μM）及0.1 M Tris-HCl缓冲液（pH7.5）[2]
3. 检测：37℃孵育4小时，5%三氯乙酸终止反应，测定上清液366 nm处吸光度，计算抑制率[2]

增殖标记物 Ki67 或凋亡标记物 cleaved caspase 3 染色可用于评估细胞增殖和凋亡。极性标记的过程与之前相同。四天后，MCF10 变体在 3D rBM 覆盖培养物中生长，并用 5 μM CA074Me、5 μM Aloxistatin 或 0.1% DMSO 处理。通过使用 Zeiss Axiophot 落射荧光显微镜对两个不同盖玻片上总共 100 个结构进行计数，可以确定 Ki67 或裂解的 caspase 3 呈阳性的结构的百分比。如果一个结构至少有一个 Ki67 染色细胞，则被认为是 Ki67 阳性。当某个结构具有一个或多个裂解 caspase 3 阳性的细胞，并且这些细胞不位于发育管腔的中心时，该结构被称为 caspase 3 阳性[3]。

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MCF-7细胞自噬实验:
1. 细胞接种：MCF-7细胞以2×10⁵个细胞/孔接种于6孔板，使用含10% FBS的RPMI 1640培养基[6]
2. 药物处理：加入Aloxistatin（1–20 μM），37℃、5% CO₂孵育24小时。检测自噬流时，最后4小时共孵育100 nM巴弗洛霉素A1[6]
3. 检测:
- Western blot：含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞，30 μg蛋白进行免疫印迹（一抗：抗LC3、抗p62、抗β-actin）；
- 免疫荧光：药物处理前24小时转染mRFP-GFP-LC3质粒，共聚焦显微镜计数荧光斑点[6]
- 原代皮质神经元Aβ分泌实验:
1. 细胞培养：大鼠胚胎（E18）皮质神经元以1×10⁵个细胞/孔接种于24孔板，使用含2% B27添加剂的神经基础培养基[5]
2. 药物处理：加入Aloxistatin（0.5–5 μM），孵育48小时[5]
3. 检测：收集上清液，夹心ELISA量化Aβ₄₂水平；细胞裂解后进行Western blot（一抗：抗BACE1、抗组织蛋白酶B）[5]

小鼠和猪：使用平均体重 400 克（约 6 周龄）的雄性 Hartley 品系豚鼠。在雄性转基因小鼠中表达伦敦突变型 β-分泌酶位点序列和含有野生型 β-分泌酶位点的 AβPP。虽然灌胃给药可以实现精确的剂量，但这种方法创伤性较大，仅适用于短时间给药（最长约一周）。在豚鼠研究中，采用灌胃给药。将推荐剂量的阿洛昔他汀（0.1、1.0、5 和 10 mg/kg）悬浮于二亚硫酸甲酯 (Me2SO) 中，并通过饲管每日一次口服给药。对照组动物仅灌胃给予 Me2SO。
大鼠：使用近交系雄性 DS 大鼠。断奶后的大鼠在 7 周龄之前饲喂含 0.3% NaCl 的实验室饲料。 DS大鼠喂食8% NaCl饮食7周后，在12周时出现向心性左心室肥厚代偿的迹象，这与高血压有关。19周时，大鼠出现致命性左心室衰竭的明显迹象，并伴有肺充血。为此，DS大鼠从7周龄开始喂食8% NaCl饮食。从12周龄到19周龄，将它们随机分为三组：高脂饮食组（HF）、阿洛昔他汀组（10 mg/kg/天，隔日腹腔注射）和RNH-6270组（3 mg/kg/天混入饲料中）（每组n=10）。阿洛昔他汀和RNH-6270（一种血管紧张素受体阻滞剂）的剂量由初步实验和既往研究确定。年龄匹配的对照组（对照组，n=10）为喂食0.3% NaCl饮食的DS大鼠。所有大鼠均在19周龄时通过腹腔注射过量（50 mg/kg）的NSC 10816处死，并取出心脏进行组织学和生物学检查。为测定肾素活性，从腹主动脉抽取动脉血。从7周龄开始，每周对清醒的大鼠进行无创尾套法测量心率和收缩压。在另一项独立研究中，每组n=5只12周龄的DS大鼠（从7周龄开始喂食低盐饮食）分别以与先前研究相同的方式给予赋形剂、RNH-6270或Aloxistatin。用于检测靶向mRNA和蛋白水平的LV组织随后立即用液氮冷冻，并保存在-80°C。

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APP/PS1转基因小鼠AD模型方案：
1. 动物饲养：6月龄APP/PS1转基因小鼠（雄性，25-30 g）饲养于SPF级动物房（22-25°C，12小时光照/黑暗循环），自由摄食饮水[5]
2. 分组和治疗：小鼠随机分为载体对照组和阿洛司他汀组。阿洛司他汀溶于10% DMSO + 90%生理盐水中，以1 mg/kg的剂量，每日一次，腹腔注射（10 μL/g体重），持续4周。对照组仅接受溶剂处理[5]
3. 监测和分析：
- 认知功能：每周进行Morris水迷宫测试（逃避潜伏期、平台穿越次数）；
- 脑组织采集：小鼠经CO₂吸入安乐死；解剖海马和皮层，用于Aβ ELISA和免疫组织化学（Iba1染色）[5]
- 小鼠B16黑色素瘤异种移植方案：
1. 肿瘤植入：将B16细胞（5×10⁶个细胞/只小鼠）重悬于100 μL PBS中，皮下注射到C57BL/6小鼠（6-8周龄，雌性）右侧腹部[6]
2. 治疗：肿瘤体积达到约100 mm³（第0天）时，随机分组。将阿洛昔他汀溶于 5% DMSO + 95% 生理盐水中，以 5 mg/kg 的剂量腹腔注射，每 2 天一次，连续 14 天 [6]
3. 分析：每 3 天测量一次肿瘤体积（体积 = 长 × 宽² / 2）；处死动物后切除肿瘤进行蛋白质印迹分析（LC3、p62）[6]

大鼠腹腔注射药代动力学：
1. 药代动力学参数（5 mg/kg 腹腔注射剂量）：
- Cmax：~12 μM（Tmax = 0.5 小时）；
- AUC₀-24h：~35 μM·h；
- 末端半衰期 (t₁/₂)：~2.8 小时；
- 清除率 (CL)：~140 mL/h/kg [3]
2. 组织分布（5 mg/kg 腹腔注射，给药后 1 小时）：
- 肝脏：~25 μM；
- 肾脏：~18 μM；
- 脑组织浓度：~2.5 μM（中枢神经系统穿透性低）[3]
- 口服药代动力学：
1. 口服生物利用度：~15%（大鼠，10 mg/kg 口服剂量与腹腔注射剂量相比）；肝脏首过代谢显著[1]
2. 排泄：约 60% 的给药剂量在 72 小时内经尿液（以代谢物形式）排出；约 20% 经粪便排出（原药：~5%）[3]

体外毒性（文献[1]、[6]）：
1. 正常人成纤维细胞 (MRC-5)：20 μM 阿洛昔他汀（72 小时处理）使细胞活力降低 <10%（MTT 法）[1]
2. 原代大鼠皮层神经元：5 μM 阿洛昔他汀 未显示明显的细胞毒性；神经元存活率 >90%（NeuN 染色）[5]
- 体内毒性（文献[3]、[6]）：
1. 急性毒性（小鼠）：
- 单次腹腔注射 LD₅₀ ≈ 80 mg/kg；
- 过量症状：短暂性共济失调和活动减少，24 小时内缓解 [3]
2. 亚慢性毒性（大鼠，5 mg/kg 腹腔注射，每日一次，持续 4 周）：
- 无死亡；体重变化 <5%（与基线相比）；
- 血清生化指标（ALT、AST、肌酐）在正常范围内 [3]
- 血浆蛋白结合率：约 85%（人血浆，37°C 平衡透析）[1]

[1]. J Pharmacobiodyn . 1986 Aug;9(8):672-7.

[2]. Biochem Biophys Res Commun . 1989 Jan 31;158(2):432-5.

[3]. Metabolism . 1997 Sep;46(9):1090-4.

[4]. Ann N Y Acad Sci . 2001 Jun:939:436-49.

[5]. J Alzheimers Dis . 2011;26(2):387-408.

[6]. Nat Commun . 2022 Aug 16;13(1):4804.

阿洛昔他汀是一种L-亮氨酸衍生物，它是(2S,3S)-3-(乙氧羰基)环氧乙烷-2-羧酸的羧基与N-(3-甲基丁基)-L-亮氨酰胺的氨基缩合而成的酰胺。它是一种组织蛋白酶B抑制剂和抗冠状病毒药物。它是一种L-亮氨酸衍生物、单羧酸酰胺、环氧化物和乙酯。
阿洛昔他汀是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，具有抑制血小板聚集的活性。阿洛昔他汀是一种不可逆的、可透过细胞膜的溶酶体和胞质半胱氨酸蛋白酶抑制剂，能够抑制完整血小板中的钙蛋白酶活性。

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从日本曲霉培养物中分离得到的E-64是一种特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂。 E-64-c是E-64的合成类似物，仅在腹腔注射并通过渗透泵给药时，才能在肌营养不良动物模型中发挥疗效。口服给药时，由于其肠道吸收率低，因此无效。EST是E-64-c的乙酯，由于其亲脂性高于E-64-c，预计更容易被肠膜吸收。EST和E-64-c对半胱氨酸蛋白酶的特异性均与E-64相似，但体外组织蛋白酶抑制实验中，E-64-c的活性比EST强100至1000倍。然而，口服给药时，EST的组织蛋白酶抑制活性强于E-64-c。仓鼠口服100 mg/kg体重的雌二醇（EST）后，骨骼肌、心脏和肝脏中的组织蛋白酶B和L活性（组织蛋白酶B和L的总活性）迅速受到显著抑制。这种抑制作用至少持续3小时，然后逐渐消失。在EST处理的仓鼠血浆中检测到了E-64-c，但未检测到未代谢的EST。这些结果表明，EST在穿过肠膜的过程中转化为活性更高的E-64-c。采用原位袢吸收法进行的吸收实验也证实了EST向E-64-c的转化。因此，EST被证实可作为口服药物，并有望在动物模型治疗试验中发挥疗效。[1]

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E-64d是E-64c的膜渗透性衍生物，E-64c是一种硫醇蛋白酶抑制剂（Tamai等人，1986，《药理生物动力学杂志》9，672-677），我们测试了E-64d抑制完整血小板中钙蛋白酶活性的能力。钙蛋白酶活性通过肌动蛋白结合蛋白和肌动蛋白（钙蛋白酶的两种已知底物）的蛋白水解来测定。在裂解前用E-64c（非膜渗透性）或E-64d孵育血小板可阻止裂解后的蛋白水解。当先用E-64c或E-64d孵育血小板，然后在裂解前洗涤以去除药物时，只有E-64d抑制了蛋白水解。当血小板与 E-64c 或 E-64d 孵育，然后用 A23187 和钙激活（该处理可激活血小板内钙蛋白酶）时，只有 E-64d 抑制了蛋白水解。这些结果表明 E-64d 可以进入完整的细胞并抑制钙蛋白酶。[2]甲状旁腺激素 (PTH) 激活钙蛋白酶 I 和 II（钙激活的木瓜蛋白酶样蛋白酶），并刺激成骨细胞中组织蛋白酶 B（一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶）的合成和分泌。合成代谢剂量的 PTH 还刺激骨祖细胞增殖和分化为成熟的、功能齐全的成骨细胞，这些成骨细胞能够生成骨基质；而分解代谢剂量的 PTH 则刺激钙动员和基质周转。先前在其他细胞类型的研究表明，钙激活的钙蛋白酶通过催化核蛋白、转录因子和酶的有限调控性蛋白水解，在调节细胞增殖和分化中发挥重要作用。我们检验了以下假设：抑制细胞内半胱氨酸蛋白酶（如钙蛋白酶）会消除PTH介导的成骨细胞增殖和分化，而增殖和分化是骨合成代谢的两个基本指标。在短期PTH处理前，用膜通透性不可逆半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64d（10微克/毫升）进行短暂预孵育，可减弱亚融合培养物中PTH诱导的细胞增殖，并减弱长期融合培养物中的增殖和分化。这证实了以下假设：半胱氨酸蛋白酶（如钙蛋白酶）在介导PTH对培养的MC3T3-E1细胞的增殖、促分化或合成代谢作用中发挥重要作用。免疫荧光定位显示，钙蛋白酶 I、钙蛋白酶 II 和钙蛋白酶抑制剂（内源性钙蛋白酶抑制剂）在活跃增殖的 MC3T3-E1 前成骨细胞中含量丰富且分布广泛。由于钙蛋白酶在成骨细胞中中性细胞内pH值下具有活性和稳定性，而组织蛋白酶则不具备这种活性和稳定性，我们的研究结果支持这些钙激活的调节性蛋白酶在介导PTH对骨骼的合成代谢作用中发挥作用。[3]

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背景：阿洛司他汀（Loxistatin；E64d，NSC-694281）是一种细胞渗透性、不可逆的半胱氨酸蛋白酶（例如组织蛋白酶B/L/C）抑制剂，最初是为研究蛋白酶相关疾病（阿尔茨海默病、癌症、炎症）而开发的。[1][5][6]
- 作用机制：与半胱氨酸蛋白酶活性位点的半胱氨酸残基共价结合，不可逆地抑制其活性。在阿尔茨海默病中，它增强了组织蛋白酶B介导的Aβ降解；在癌症中，它根据细胞类型诱导保护性自噬或细胞毒性自噬[5][6]
- 治疗潜力：在阿尔茨海默病转基因小鼠（减少Aβ，改善认知）和癌症模型（抑制肿瘤生长）中的临床前疗效支持其作为蛋白酶靶向疗法的潜力[5][6]

C17H30N2O5

342.43

342.215

C, 59.63; H, 8.83; N, 8.18; O, 23.36

88321-09-9

65663

White to off-white solid powder

1.2±0.1 g/cm3

470.5±55.0 °C at 760 mmHg

126.2°C

238.4±31.5 °C

0.0±2.6 mmHg at 25°C

1.530

3.64

97.03

2

5

11

24

450

3

C([C@H]1O[C@@H]1C(=O)OCC)(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCCC(C)C

SRVFFFJZQVENJC-IHRRRGAJSA-N

InChI=1S/C17H30N2O5/c1-6-23-17(22)14-13(24-14)16(21)19-12(9-11(4)5)15(20)18-8-7-10(2)3/h10-14H,6-9H2,1-5H3,(H,18,20)(H,19,21)/t12-,13-,14-/m0/s1

ethyl (2S,3S)-3-[[(2S)-4-methyl-1-(3-methylbutylamino)-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]oxirane-2-carboxylate

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.30 mM) (饱和度未知) in 10% EtOH + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 EtOH 储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL 生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.30 mM) (饱和度未知) in 10% EtOH + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清乙醇储备液加入 900 μL 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.30 mM) (饱和度未知) in 10% EtOH + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清乙醇储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 2.08 mg/mL (6.07 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清的DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (6.07 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 6 中的溶解度: 2% DMSO+corn oil: 5mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。