ANA-12

TrkB (Kd = 10 nM)

体外活性：ANA-12 直接且选择性地与 TrkB 结合，并抑制 TrkB 下游过程，而不改变 TrkA 和 TrkC 功能。在 nnr5 PC12-TrkB 细胞中，ANA-12 在浓度低至 10 nM 时即可阻止脑源性神经营养因子 (BDNF) 诱导的神经突生长。在 DRG 神经元中，ANA-12 消除了 BDNF 对增加内向电流的影响。激酶测定：Maxisorp ELISA 96 孔板用碳酸盐缓冲液 (pH 9.6) 中的不同浓度的 Trk BECD -Fc、20 mg/ml BSA 或 1 mg/mL IgG-Fc（多克隆抗 TrkB）包被过夜。 4°C。将板用 0.5% BSA 的 PBS 溶液在室温下饱和 2 小时，并在 PBS-Tween 0.05% 中彻底清洗。然后将 Bodipy–ANA-12 在 0.5% PBS-BSA 中室温孵育 1 小时，然后添加 0.5% PBS-BSA 中的 BDNF 再孵育 1 小时。在 PBS-Tween 0.05% 中进行大量洗涤后，通过 520 ± 10 nm 处的荧光对结合的 bodipy-ANA-12 量进行定量。外推分析的可检测范围通过用 bodipy-ANA-12 包被 ELISA 板并在 520 ± 10 nm 处读取荧光来评估。细胞测定：分别添加 BDNF (1 nM)、NGF (2 nM) 和 NT-3 (10 nM) 后，在 nnr5 PC12–TrkB、–TrkA 和 –TrkC 细胞中评估分子对神经突生长的调节。通过显微镜确定每个计数视野中具有直径超过 2 个细胞的神经突的细胞数量（每孔 2 个视野，每个条件 3 个孔）。连续 3 天，每 24 小时进行一次盲计数。

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N-T19类似物的筛选揭示了一种有效的TrkB拮抗剂。[1]
KIRA-ELISA和神经突生长评估显示，只有N-T19能够维持其在神经元和神经元样系统中的作用。然而，尽管N-T19在抑制TrkB活性方面表现出很高的功效，但其相对较低的效价促使我们寻找能保持N-T19原有的高效但效价更高的类似物。为此，使用Bioinfo-DB数据库进行第二轮计算机筛选，以鉴定共享相同分子支架的N-T19类似物（图4A）。14个新分子被鉴定为接近类似物，并在第一组使用KIRA-ELISA检测的功能筛选中进行了测试。四种化合物的活性最高，但只有1种（ANA-12）在重组细胞中表现出亚微摩尔效力。ANA-12的深入药理表征证实了该分子的高效（完全抑制）和效力（亚微摩尔）（图4B）。与母体化合物NT-19一样，ANA-12在神经元中显示出2位点的作用模式，但令人惊讶的是，它也在重组细胞中发挥作用。两种细胞体系（分别为50 μM和50 nM）在低亲和力位点和高亲和力位点上的电位具有可比性。 值得注意的是，在测试的14个分子中，ANA-12的结构与母体先导化合物的结构最接近，两个分子的区别只是在ANA-12中多了一个苯片段（图4A）。

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ANA-12直接选择性结合TrkB。[1]
然后，我们通过将荧光标记的化合物（见方法）与嵌合的TrkBECD-Fc或BSA或IgG-Fc孵育作为非特异性结合的阴性对照，确定ANA-12是否直接与TrkB结合。如图5A所示，ANA-12以剂量依赖的方式特异性结合到TrkB的细胞外结构域，而不与BSA或IgG-Fc结合。与TrkBECD-Fc的饱和结合研究表明，ANA-12与TrkBECD-Fc结合的Kd值为12 μM（图5B），对应于之前在KIRA-ELISA中观察到的功能性低亲和力位点。检测到的高亲和位点位于荧光检测的非线性范围内，因此表现为小的压痕。线性化和外推分析表明，ANA-12也与高亲和力位点结合，Kd约为10 nM（数据未显示）。ANA-12与TrkB结合的2位点拟合模型显示，高亲和力位点占总结合位点的20%（数据未显示），这一数值与KIRA-ELISA检测中观察到的30%相似（图4B）。
为了进一步研究ANA-12的结合特性，我们将BDNF加入到ANA-12/TrkB复合物中（图5B）。这导致与TrkBECD-Fc结合的ANA-12的最大数量减少了60%，而曲线没有向右移动（Kd, 16 μM），表明这是一种非竞争机制。综上所述，这些数据表明高亲和力和低亲和力的结合位点共存于TrkB的细胞外结构域，BDNF和ANA-12并不竞争TrkB上的相同位点。
新化合物与TrkB-d5的计算对接表明，推测的结合模式与N-T19相似（图5C）： ANA-12的内酰胺部分与TrkB的His299和His300主链原子相互作用，而化合物的无环酰胺部分与TrkB特异性Gln347和Asp298侧链之间形成氢键。该配体的形状适合TrkB-d5 ADEB β-片，特别是通过7元环与可接近的二硫桥Cys302-Cys347之间的疏水接触，以及通过与一束组氨酸残基（His299, His300, His335）的芳香相互作用。

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ANA-12影响与TrkB相关的细胞功能，但不影响TrkA和TrkC。[1]
神经突生长被用来验证ANA-12对细胞过程的影响（图5、D和E）。我们观察到，在表达trkb的细胞中，浓度低至10 nM的ANA-12可以阻止bdnf诱导的神经突生长，证实了KIRA-ELISA检测中观察到的高效效（图5D）。在浓度高达10-100 μM时，ANA-12完全消除了BDNF的作用，因为即使在3天后也没有观察到单个神经突起或分支。为了评估该化合物对TrkB的选择性，我们使用了另外两种表达TrkA或TrkC的nnr5-PC12细胞系，它们的神经突生长分别依赖于NGF和NT-3（图5E）。在这些细胞系中，ANA-12对神经突的生长没有影响。浓度高达100 μM的ANA-12孵育3天后，对NGF-和nt -3依赖性的神经突长度和分支没有影响，证实了其对trkb相关信号的特异性。

在成年 C57BL6/129SveV F1s 小鼠中，ANA-12（0.5 mg/kg，腹腔注射）可降低大脑中的 TrKB 活性，减少焦虑和抑郁相关行为，而不影响神经元存活。在雄性 C57BL/6 小鼠中，ANA-12（0.5 mg/kg，腹腔注射）对脂多糖诱导的抑郁样行为显示出抗抑郁样作用。在雄性 Sprague-Dawley 大鼠中，ANA-12（3 μg/剂）可阻断内侧孤束核 (mNTS) BDNF 减少食物摄入的作用。在雄性野生型小鼠中，ANA-12 逆转乙醇摄入并诱导 D3 受体下调，但在 D3R-/- 小鼠中无效。在雄性 CocSired 大鼠中，ANA-12（0.5 mg/kg，腹腔注射）可逆转可卡因自我给药的减少。

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初级传入末端的NMDA受体可以通过增加神经递质释放来促进痛觉过敏。在大鼠和小鼠中，我们发现鞘内NMDA诱导神经激肽1受体（NK1R）内化（测量P物质释放）的能力需要事先注射BDNF。在原发性传入神经中选择性敲除NMDA受体可减少NMDA诱导的NK1R内化，从而证实了这些受体在突触前的位置。BDNF的作用是由原肌球蛋白相关激酶B （trkB）受体介导，而不是由p75神经营养因子受体（p75(NTR)）介导，因为它不是由proBDNF产生的，并且被trkB拮抗剂ANA-12抑制，而不被p75（NTR）抑制剂t1 - pep5抑制。这些作用可能是通过trkB受体的截断形式介导的，因为在背根神经节（DRG）神经元中几乎没有全长trkB的表达。Src家族激酶抑制剂阻断BDNF的作用，表明trkB受体通过Src家族激酶磷酸化促进这些NMDA受体的激活。培养DRG神经元的Western blot结果显示，BDNF增加了NMDA受体NR2B亚基的Tyr（1472）磷酸化，已知具有增强作用。膜片钳记录显示，BDNF而非proBDNF增加了培养的DRG神经元的NMDA受体电流。在神经性疼痛模型中，nmda诱导的NK1R内化也可以通过脂多糖激活背角小胶质细胞来实现。这些作用被BDNF清道夫、trkB受体拮抗剂和Src家族激酶抑制剂所减弱，这表明小胶质细胞释放的BDNF在神经性疼痛的初级传入事件中增强了NMDA受体。[1]

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LPS导致海马CA3和齿状回（DG）和前额叶皮质（PFC）的BDNF减少，而LPS增加伏隔核（NAc）的BDNF。地塞米松抑制实验显示lps处理小鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴活动过度。腹腔注射7,8- dhf对lps诱导的抑郁样行为有抗抑郁作用，腹腔注射ANA-12可阻断其抗抑郁作用。令人惊讶的是，单独的ANA-12对lps诱导的抑郁样行为表现出抗抑郁样作用。此外，双侧向NAc输注ANA-12具有抗抑郁作用。此外，LPS导致CA3、DG和PFC的脊柱密度降低，而LPS增加了NAc的脊柱密度。有趣的是，7,8- dhf显著减弱了lps诱导的CA3、DG和PFC中p-TrkB和脊柱密度的降低，而ANA-12显著减弱了lps诱导的NAc中p-TrkB和脊柱密度的增加。 结论：lps诱导的炎症可能通过改变CA3、DG、PFC和NAc的BDNF和脊柱密度导致抑郁样行为，这可能参与了7,8- dhf和ANA-12的抗抑郁作用。[2]

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为了定位介导后脑室传递BDNF能量平衡效应的神经元，将脑室阈下剂量直接递送至内侧孤束核（mNTS）。mNTS BDNF可显著减少食物摄入，而这一作用被预先给予高选择性TrkB受体拮抗剂{[n2 -2-2-氧氮平-3-基氨基]羰基苯基苯并(b)噻吩-2-carboxamide (ANA-12)}阻断，表明TrkB受体激活介导了后脑BDNF对食物摄入的影响。由于BDNF和瘦素都与黑素皮质素信号相互作用以减少食物摄入，我们还研究了后脑瘦素的摄入抑制作用是否涉及后脑特异性BDNF/TrkB激活。后脑瘦素递送可显著增加后脑背迷走神经复合体内BDNF蛋白含量。为了评估BDNF/TrkB受体信号是否在瘦素信号的下游作用以控制能量平衡，瘦素和ANA-12被共同给予mNTS。TrkB受体拮抗剂可减弱瘦素的摄入抑制作用，提示mNTS TrkB受体激活有助于调解后脑瘦素的厌食作用。总的来说，这些结果表明，trkb介导的mNTS信号负调控食物摄入，部分地，瘦素给药到NTS的摄入抑制作用。[3]

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事实上，TrkB选择性拮抗剂ANA-12阻断BDNF通路逆转了慢性稳定的乙醇摄入，并强烈降低了D3R的纹状体表达。最后，我们对丁螺环酮进行了评估，丁螺环酮是一种被批准用于治疗焦虑症的药物，具有D3R拮抗剂活性（经分子模型分析证实），可有效抑制乙醇摄入。因此，通过D3R的DA信号对于乙醇相关的奖励和消耗是必不可少的，并且可能代表了断奶的新治疗靶点。[4]

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给药BDNF受体拮抗剂（TrkB受体拮抗剂ANA-12）逆转了雄性可卡因遗传大鼠的可卡因自我给药减少。此外，在自我服用可卡因的男性精子中，乙酰化组蛋白H3与Bdnf启动子的关联增加。综上所述，这些发现表明，父亲自愿摄入可卡因会导致种系的表观遗传重编程，对雄性后代的mPFC基因表达和对可卡因强化的抵抗力产生深远影响。[5]

将不同浓度的 Trk ^BECD -Fc、20 mg/ml BSA 或 1 mg/mL IgG-Fc（多克隆抗 TrkB）涂在 Maxisorp ELISA 96 孔板上，并在 4° 下放置过夜C，pH 为 9.6 的碳酸盐缓冲液。室温下在 0.5% BSA 的 PBS 溶液中溶解两小时后，将板在 0.05% PBS-Tween 中彻底清洗。在 0.5% PBS-BSA 中室温孵育一小时后，将 BDNF 添加到溶液中并再孵育一小时。使用 Bodipy-ANA-12 重复此过程。在 PBS-Tween 0.05% 中彻底洗涤后，通过 520 ± 10 nm 处的荧光测量结合的 bodipy-ANA-12 的量。为了确定外推分析的检测范围，将 ELISA 板涂有 bodipy-ANA-12，并测量 520 ± 10 nm 处的荧光。

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ANA-12 binding assay [1]
在4°C的碳酸盐缓冲液（pH 9.6）中，用不同浓度的TrkBECD-Fc（如图所示）、20 mg/ml BSA或1 mg/ml IgG-Fc（多克隆抗trkb）包被Maxisorp ELISA 96孔板，过夜。在室温下，用0.5%的BSA在PBS中饱和2小时，并用0.05%的PBS- tween广泛洗涤。将Bodipy-ANA-12在0.5% PBS-BSA中室温孵育1小时，再加入BDNF在0.5% PBS-BSA中孵育1小时，如图所示。在0.05% PBS-Tween中广泛洗涤后，在520±10 nm处荧光定量体脂- ana -12结合量。外推分析的检测范围通过在ELISA板上涂覆bodipy-ANA-12并在520±10 nm处读取荧光来评估。

在 nnr5 PC12-TrkB、-TrkA 和 -TrkC 细胞中，分别添加 BDNF (1 nM)、NGF (2 nM) 和 NT-3 (10 nM) 后评估分子对神经突生长的影响。显微镜对每个计数区域（每个条件三个孔，每个孔两个区域）中的细胞数量进行计数，其中神经突的直径超过两个细胞。三天内，每 24 小时在黑暗中进行一次计数。

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KIRA-ELISA [1]
如前所述，使用改良版KIRA-ELISA定量TrkB受体自磷酸化。将TetOn-rhTrkB细胞接种于96孔平板（每孔4 × 104个细胞），用1000 ng/ml强力霉素孵育过夜，诱导TrkB受体的表达。将皮质神经元接种于多聚氮薄包被的96孔平底培养板（每孔12 × 104个细胞），在37℃、5% CO2中培养7 - 8天。每次检测前验证TetOn-rhTrkB细胞的荧光水平。细胞用DMEM仔细清洗4次，然后用化合物处理20分钟，用BDNF刺激20分钟(重组细胞，4 nM；神经元，0.4 nM)，在含有0.5% BSA和25 mM HEPES（对照培养基）的DMEM中，在37°C， 5% CO2中。在冰上去除培养基停止实验，在室温下，通过添加增溶缓冲液（150 mM NaCl, 50 mM Hepes, 0.5% Triton X-100, 0.01%硫柳汞，2mm原钒酸钠，添加蛋白酶抑制剂混合物）使膜溶解1小时。将裂解液转移到预先包被抗gfp（1:5000）用于rhTrkB或抗TrkB （1 μg/ml）用于神经元TrkB的ELISA微滴板上。生物素化抗磷酸酪氨酸（0.5 μg/ml）和酶标链霉亲和素（1:4000）孵育后发现磷酸化。加入TMB后，用1 N盐酸酸化，在450 nm处读取吸光度。总TrkB也使用KIRA-ELISA定量，使用rhTrkB的单克隆抗gfp（1:3000）或神经元TrkB的单克隆抗TrkB（1:1000）沉淀受体，并使用rhTrkB的多克隆抗gfp（1:5000）或神经元TrkB的多克隆抗TrkB （1 μg/ml）检测受体。在细胞培养中，总TrkB信号在所有处理条件下都没有变化。在脑组织中，总TrkB的数量是可变的，用于对磷酸化TrkB获得的信号进行归一化。

在17%二甲基亚砜（DMSO）磷酸盐缓冲液中，于注射当日配制氯胺酮（盐酸氯胺酮，10 mg/kg）、7,8-二羟基黄酮（7,8-DHF；10 mg/kg）和ANA-12，N2-(2-{[(2-氧代氮杂环庚烷-3-基)氨基]羰基}苯基)苯并[b]噻吩-2-甲酰胺（0.5 mg/kg）。所选剂量为氯胺酮（10 mg/kg）、7,8-DHF（10 mg/kg）和ANA-12（0.5 mg/kg）。小鼠接受所有化合物的腹腔注射 (ip)。\n

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\n\nANA-12 的给药及体内 KIRA-ELISA 分析 [1]
\n根据 Banbury 会议关于小鼠行为学遗传背景的建议，使用 C57BL/6 和 129SveV 小鼠杂交获得的 F1 代杂交小鼠。将 3 月龄的成年 C57BL/6/129SveV F1 小鼠随机分为生理盐水组（1% DMSO 溶于 0.9% NaCl 溶液）和 ANA-12 组（溶于生理盐水）。生理盐水组和 ANA-12 组（0.5 mg/kg 体重）均以 10 μl/g 体重的剂量腹腔注射。2 或 4 小时后，将小鼠断头处死，并在冰上迅速取出脑组织。必要时，随后解剖纹状体、皮层和海马。组织样本迅速用冰冷的PBS缓冲液洗涤，转移至冰冷的KIRA-ELISA溶解缓冲液中，并在4℃下过夜。测定蛋白质浓度，上样等量蛋白质，并按上述方法进行KIRA-ELISA检测。\n

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\n\nANA-12在小鼠脑组织中的稳定性和生物利用度分析[1]
\n小鼠血清中的稳定性分析和小鼠脑组织中的定量分析由TechMedILL实验室（法国斯特拉斯堡高等生物技术学院，伊尔基尔希）完成。稳定性评估方法为：将ANA-12在小鼠血清中于37℃孵育15、30、45和60分钟。将混合物均质化，并用乙腈沉淀蛋白质，然后通过液相色谱-质谱联用仪（Agilent LC-MS ESI qTOF，连接 C18-1 × 10 × 1.9 色谱柱）进行分析。如上所述，通过腹腔注射小鼠 ANA-12 (0.5 mg/kg) 来评估其在小鼠脑内的生物利用度。分别在注射后 30 分钟、1 小时、2 小时、4 小时和 6 小时（每个时间点 3 只小鼠）取出脑组织，并在 0.9% NaCl 溶液中研磨，然后用乙腈处理。混合物经超速离心澄清后，使用一系列脱水和乙腈/水 (1/1 v/v) 重悬步骤提取化合物，最后进行 LC-MS 检测和分析。通过向空白混合物（生理盐水处理小鼠的脑组织）中添加已知量的化合物来制备参考样品。 ANA-12 的浓度（ng/g 脑组织）是通过计算检测峰下的面积从参考样品中得出的。\n

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\n\n体内细胞死亡分析[1]
\n使用 TUNEL 检测法评估亚慢性 ANA-12 处理对小鼠脑组织细胞死亡的影响。将小鼠随机分为 4 组，每天腹腔注射一次生理盐水（含 1% DMSO）或 0.5、1.0 或 2.0 mg/kg 的 ANA-12，持续 1 周。末次注射后 24 小时处死小鼠，经心脏灌注 PBS，随后灌注 4% 多聚甲醛。将脑组织在 4% 多聚甲醛中固定过夜，并使用振动切片机获得 50 μm 厚的冠状切片。将游离切片用PBS充分洗涤，并在室温下用含0.5% Triton X-100的PBS进行90分钟的透化处理。之后，将切片冲洗并贴于载玻片上。根据制造商的说明，使用DeadEnd荧光TUNEL系统对3′ OH-DNA链断裂进行标记。反应通过用2×SSC溶液冲洗载玻片并用PBS充分洗涤来终止。切片用VECTASHIELD plus DAPI封片剂封片，并在520 nm波长下使用荧光显微镜观察荧光素染色。阳性对照的制备方法为：将生理盐水处理动物的切片在含0.5% Triton X-100的PBS中，于37℃下用DNA酶（10 U/ml）预处理90分钟。阴性对照（无荧光斑点）的制备方法与上述相同，只是不使用末端转移酶处理切片。\n

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\n\nANA-12 的行为学测试 [1]
\n所有行为学测试均在同一时间（下午 1:00）于安静且独立的房间内进行，环境光照条件明亮（800–900 lux，旷场实验除外，300–400 lux）。注射 0.5 mg/kg ANA-12 4 小时后，采用与上述相同的程序进行行为学测试。为了消除气味线索，每次动物实验后，所有测试设备均使用消毒剂 Roccal 进行彻底清洁。\n

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\n\nANA-12 对焦虑相关行为的影响 [1]
\n使用旷场实验、高架十字迷宫和新奇抑制进食范式测试焦虑相关行为。\n

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\n\n给药 [2]
\nANA-12，N2-(2-{[(2-氧代氮杂环庚烷-3-基)氨基]羰基}苯基)苯并[b]噻吩-2-甲酰胺（0.5mg/kg，腹腔注射），溶于 1% 二甲基亚砜生理盐水中。 7,8-DHF 和 ANA-12 的剂量也按照先前报道的方法选择（Ren 等，2013、2014；Cazorla 等，2011）。\n

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\n\n手术及双侧 ANA-12 注射入伏隔核 [2]
\n小鼠用戊巴比妥钠（5mg/kg）麻醉，并固定于立体定位仪上。将微量注射针双侧插入伏隔核壳部（+1.7 AP，±0.75 ML，-3.6 DV）（Paxinos 和 Watson，1998）。术后24小时，腹腔注射LPS（0.5mg/kg）或生理盐水（10ml/kg）。注射LPS（或生理盐水）23小时后，双侧注射ANA-12（0.1 nmol/L，0.1 μL/min，持续5分钟）或载体。在最后一次注射后4小时和6小时进行行为学评估（图3B）。实验4：mNTS内的BDNF/TrkB受体信号传导。[3]所有大鼠（n = 9）均接受两次单侧NTS实质内注射，两次注射间隔约20分钟，并在第二次注射后1、3、6和24小时测定食物摄入量。实验条件采用平衡设计，具体如下：对照组（先注射100 nl DMSO，再注射100 nl aCSF）、ANA-12组（先注射1或3 μg ANA-12，再注射aCSF）、BDNF组（先注射DMSO，再注射0.2 μg BDNF）以及联合组（先注射1或3 μg ANA-12，再注射0.2 μg BDNF）。分别在注射药物前和注射后24小时测量体重。\n

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\n\n实验6：后脑TrkB受体信号传导和瘦素。[3]
\n所有大鼠（n = 9）均接受两次单侧孤束核（NTS）实质注射，两次注射间隔约20分钟，并在第二次注射后1、3、6和24小时测量食物摄入量。四个平衡条件如下：对照条件（100 nl DMSO，随后 100 nl 碳酸氢钠）、ANA-12条件（3 μg ANA-12，随后碳酸氢钠）、瘦素条件（DMSO，随后 0.2 μg 瘦素）和组合条件（3 μg ANA-12，随后 0.2 μg 瘦素）。在注射药物之前和注射后 24 小时立即测量体重。\n

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\n\n\n药物和治疗[4]
\n乙醇、马来酸 U99194A、盐酸 SB277011A、盐酸丁螺环酮、8-OH-DPAT 和ANA-12溶于生理盐水中，并进行腹腔注射（ip）（剂量为 10 ml/kg），但 ANA-12 溶于 10% 二甲基亚砜中。 U99194A 的使用剂量为 10 mg/kg（Harrison 和 Nobrega，2009），SB277011A 的使用剂量为 10 mg/kg（Song 等，2012），丁螺环酮的使用剂量范围为 0.1–10 mg/kg（Martin 等，1992），8-OH-DPAT 的使用剂量为 1 mg/kg（Martin 等，1992），ANA-12 的使用剂量为 0.5 mg/kg（Cazorla 等，2011）。\n
\n在双瓶选择范式中，经过 30 天的自愿饮酒程序后，D3R−/− 和 WT 小鼠被随机分配到八个实验组（每组 n=6/10）：WT/载体组、WT/U99194A 组、WT/SB277011A 组、 WT/buspirone、D3R−/−/vehicle、D3R−/−/U99194A、D3R−/−/SB277011A 和 D3R−/−/buspirone。动物每天腹腔注射一次，连续14天。第14天，在最后一次给药后1小时处死动物并取脑组织。在另一组实验中，小鼠经过30天的自愿饮酒程序后，随机分为五组（每组n=5/7）：WT naïve、WT/vehicle、WT/ANA-12、D3R−/−/vehicle 和 D3R−/−/ANA-12。动物连续4天每天腹腔注射一次选择性Trkb拮抗剂ANA-12，剂量为0.5 mg/kg（Cazorla等人，2011；Vassoler等人，2013）。第4天，在最后一次给药后1小时处死动物并取脑组织。

全身给药ANA-12可抑制脑内TrkB活性。[1]
本研究旨在开发一种全身给药后可抑制成年哺乳动物脑内TrkB活性的小分子。我们首先检测了ANA-12在到达脑组织前是否在小鼠血清中稳定且未降解为代谢产物。为此，我们将ANA-12在37℃下于小鼠血清中孵育15、30、45和60分钟。液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析结果表明，混合物中未检测到代谢产物，且未观察到ANA-12随时间的降解（图6A）。
随后，我们检测了全身给药后ANA-12是否能穿过血脑屏障并到达脑组织。为此，我们向成年小鼠腹腔注射了ANA-12（0.5 mg/kg）。动物分别于注射后0.5、1、2、4或6小时处死，并提取脑组织，采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）法定量分析ANA-12。图6B显示，腹腔注射ANA-12后，最早可在30分钟（~400 nM）至6小时内（~10 nM）在脑组织中检测到活性浓度的ANA-12。
随后，我们检测了ANA-12是否抑制成年动物脑组织中的TrkB活性，并在注射0.5 mg/kg ANA-12后2小时和4小时测定了脑组织中TrkB的抑制程度。选择此时间点是基于我们之前对环磷酰胺B（cyclotraxin-B）的观察结果，环磷酰胺B至少需要3小时才能使脑组织中的TrkB失活。 KIRA-ELISA定量分析磷酸化TrkB的结果显示，0.5 mg/kg的ANA-12可部分抑制全脑内源性TrkB的总活性（2小时时抑制8%，4小时时抑制25%；图6C）。
尽管TrkB广泛分布于脑内，但ANA-12对不同脑区受体的抑制作用可能并不均匀。这可能导致全脑TrkB活性呈现表观上的部分抑制，某些脑区TrkB活性被完全抑制，而其他脑区TrkB活性则未受影响或仅受影响很小。因此，我们测定了不同脑区之间的抑制幅度。我们再次向成年小鼠注射0.5 mg/kg的ANA-12，并在2小时或4小时后收集不同脑区（纹状体、皮层和海马）的样本（图6D）。KIRA-ELISA分析表明，注射2小时后，纹状体中TrkB的抑制效果优于海马和皮层。 4小时后，所有分析结构的抑制程度相当（25%–30%），但纹状体中的TrkB抑制程度似乎略高于海马和皮层。综上所述，这些观察结果表明，极低剂量的ANA-12足以在4小时后均匀地部分抑制整个大脑中的TrkB活性。

ANA-12不影响神经元存活。[1]
由于抑制BDNF/TrkB信号通路可诱导中枢神经系统神经元死亡，我们验证了ANA-12能否长期给药而不对大脑产生毒性作用。为此，我们给成年小鼠每日注射不同剂量的ANA-12（0.5、1.0和2.0 mg/kg）或生理盐水，持续一周。末次注射后，处死小鼠，取脑组织进行TUNEL荧光染色检测细胞凋亡（图9）。在注射生理盐水或0.5或1.0 mg/kg ANA-12的小鼠脑组织中，几乎检测不到TUNEL阳性细胞。值得注意的是，全脑检查显示，凋亡细胞仅存在于海马齿状回。然而，在接受 2.0 mg/kg ANA-12 的小鼠的齿状回中观察到 TUNEL 阳性细胞数量略有增加。在其他任何研究区域（皮质、纹状体、海马 CA1-3 区、下丘脑、丘脑、黑质、腹侧被盖区、苍白球和中缝核）均未检测到染色。

[1]. J Clin Invest. 2011 May 2; 121(5): 1846–1857.

[2]. Eur J Neurosci . 2014 May;39(9):1439-54.

[3]. Int J Neuropsychopharmacol . 2014 Oct 31;18(4):pyu077.

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[5]. Neuropsychopharmacology . 2014 Jul;39(8):2017-28.

[6]. Nat Neurosci . 2013 Jan;16(1):42-7.

ANA-12 是一种仲酰胺，其结构为邻氨基苯甲酸，其中羧基与α-氨基-ε-己内酰胺的伯氨基发生缩合反应，而芳基氨基与1-苯并噻吩-2-羧酸的羧基发生缩合反应。它是原肌球蛋白受体激酶B（TrkB，又称酪氨酸受体激酶B）的选择性非竞争性拮抗剂。它可作为原肌球蛋白相关激酶B受体拮抗剂、抗抑郁药和抗焦虑药发挥作用。它是一种仲酰胺，属于己内酰胺类化合物和1-苯并噻吩类化合物。它在功能上与 2-氨基己基-6-内酰胺和邻氨基苯甲酸相关。

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最后，其他与 N-T19 和 ANA-12 具有相同 3-(酰氨基)-ε-己内酰胺骨架的化合物已被描述为小鼠的促认知剂，尽管其确切的作用机制尚未阐明。鉴于 BDNF/TrkB 偶联在认知和记忆中的核心作用，评估这些化合物对 TrkB 受体的影响并将其与 ANA-12 和 N-T19 进行比较将很有意义。据我们所知，ANA-12 是第一个在体内产生强效且特异性作用的非肽类 TrkB 受体拮抗剂。这种蛋白水解稳定的小分子是一种有价值的药理学工具，能够帮助我们更好地研究BDNF/TrkB信号通路在病理生理条件下的作用，并将作为设计高效口服生物利用度高的TrkB调节剂的先导化合物。[1]

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总之，我们的研究表明，LPS诱导的炎症会导致抑郁样行为，并引起海马、前额叶皮层（PFC）和伏隔核（NAc）内BDNF蛋白和树突棘密度的改变。此外，TrkB激动剂7,8-DHF和拮抗剂ANA-12分别使海马和PFC中异常的树突棘以及NAc中异常的树突棘恢复正常，从而对LPS诱导的抑郁行为表现出抗抑郁作用。因此，海马、PFC和NAc中异常的BDNF-TrkB信号通路可能在炎症诱导的抑郁症中发挥作用。最后，在重度抑郁症（MDD）中，TrkB激动剂和TrkB拮抗剂可能作为潜在的治疗药物，用于治疗海马和前额叶皮层（PFC）中脑源性神经营养因子（BDNF）水平较低，以及伏隔核（NAc）中BDNF水平较高的患者。[2]

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中脑边缘多巴胺（DA）控制药物和酒精渴求行为，但特定DA受体亚型的作用尚不清楚。我们检验了D3R基因缺失或D3R药理学阻断抑制小鼠乙醇偏好的假设。我们用D3R拮抗剂SB277011A和U99194A处理或不处理D3R缺陷小鼠（D3R^-/-）及其野生型（WT）同窝小鼠，并在长期自由选择乙醇饮用实验（双瓶选择）和类似暴饮的乙醇饮用范式（黑暗饮酒，DID）中进行了测试。通过分子建模进一步评估了D3R拮抗剂的选择性。在双瓶选择和DID范式中，D3R(-/-)小鼠的乙醇摄入量可忽略不计，而野生型(WT)小鼠的乙醇摄入量则很高。D3R拮抗剂治疗可抑制WT小鼠的乙醇摄入，但对D3R(-/-)小鼠无效。乙醇摄入增加了WT和D3R(-/-)小鼠中RACK1和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达；WT小鼠中D3R也显著过表达。因此，与RACK1/BDNF激活相关的D3R表达增加似乎在自愿摄入乙醇的过程中发挥强化机制的作用。事实上，TrkB选择性拮抗剂ANA-12阻断BDNF通路可逆转慢性稳定乙醇摄入，并显著降低纹状体中D3R的表达。最后，我们评估了丁螺环酮，这是一种已获批准用于治疗焦虑症的药物，具有D3受体拮抗活性（经分子建模分析证实），结果显示其能有效抑制乙醇摄入。因此，通过D3受体的多巴胺信号传导对于乙醇相关的奖赏和摄入至关重要，并可能代表一种新的戒断治疗靶点。[4] 我们描述了一种由大鼠可卡因自我给药引起的可遗传表型。我们观察到，在雄性后代中，可卡因自我给药行为的习得延迟且维持能力降低，而雌性后代则未观察到此现象。脑源性神经营养因子（BDNF）mRNA和BDNF蛋白在内侧前额叶皮层（mPFC）中增加，并且仅在有可卡因经验的雄性后代中，乙酰化组蛋白H3与BDNF启动子的结合增加。给予 BDNF 受体拮抗剂（TrkB 受体拮抗剂 ANA-12）可逆转雄性可卡因后代大鼠可卡因自我给药行为的减少。此外，在自我给药可卡因的雄性大鼠的精子中，乙酰化组蛋白 H3 与 Bdnf 启动子的结合增加。综上所述，这些发现表明，父亲自愿摄入可卡因会导致生殖细胞的表观遗传重编程，从而对雄性后代的 mPFC 基因表达和对可卡因强化的抵抗力产生深远影响。[5]

C22H21N3O3S

407.49

407.13

C, 64.85; H, 5.19; N, 10.31; O, 11.78; S, 7.87

219766-25-3

2799722

White to off-white solid powder

4.786

126.01

3

4

4

29

628

0

S1C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C2C([H])=C1C(N([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C(N([H])C1([H])C(N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H])=O)=O)=O

TUSCYCAIGRVBMD-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C22H21N3O3S/c26-20(25-17-10-5-6-12-23-21(17)27)15-8-2-3-9-16(15)24-22(28)19-13-14-7-1-4-11-18(14)29-19/h1-4,7-9,11,13,17H,5-6,10,12H2,(H,23,27)(H,24,28)(H,25,26)

N-[2-[(2-oxoazepan-3-yl)carbamoyl]phenyl]-1-benzothiophene-2-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 1.43 mg/mL (3.51 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 14.3 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1.43 mg/mL (3.51 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 14.3 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 1 mg/mL (2.45 mM) in 5% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 0.45 mg/mL (1.10 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 5 中的溶解度: ≥ 0.45 mg/mL (1.10 mM) (饱和度未知) in 5% DMSO + 95% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 6 中的溶解度: 2% DMSO+30% PEG 300+2% Tween 80+ddH2O: 2mg/mL .

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。