Apiin   中文名称: 芹菜苷

NO production (IC50 = 0.08 mg/mL);iNOS (IC50 = 0.049 mg/ mL)

A.gravelolens var.dulce的提取物含有Apiin作为主要成分（提取物的1.12%，w/w）。提取物和Apiin对LPS激活的J774.A1细胞中的亚硝酸盐（NO）体外产生（提取物和Apiin的IC50分别为0.073和0.08 mg mL（-1））和iNOS表达（提取物和Apiin的IC50各自为0.095和0.049 mg mL（-1））显示出显著的抑制活性。我们的结果清楚地表明，在J774.A1细胞培养基中LPS刺激前加入提取物和芹菜素，对iNOS表达和亚硝酸盐产生具有体外抑制活性。[1]

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化合物1用作提取物的生物标志物，用于通过直接校准法进行定量HPLC分析。我们发现整个提取物由高比例（1.12%w/w）的Apiin（1）组成。众所周知，在炎症性疾病中，组成型和诱导型一氧化氮合酶会提高NO的产生，iNOS产生的NO是一种重要的炎症介质。因此，我们研究了提取物和化合物1对诱导型一氧化氮合酶表达（iNOS）和LPS刺激的J744.A1巨噬细胞产生NO的体外活性。使用细胞培养物（J774.A1（小鼠单核细胞/巨噬细胞）和HEK-293（人上皮肾））评估细胞毒性。在LPS（6×103UmL−1）攻击后24小时，评估了LPS刺激前1小时与化合物1（0.005-0.05 mg mL−l）或提取物（0.01-0.1 mg mL-1）一起孵育的J774.A1巨噬细胞的细胞培养基中NO的释放。结果以与对照组相比计算的抑制百分比表示（Aquino等人，2002）。如图2和图3所示，提取物（0.01、0.05和0.1 mg mL−1）和Apiin（1；0.01和0.05 mgmL−2）在LPS前1小时同时加入，以浓度相关的方式显著抑制了NO的释放；因此IC50值计算为0.073 mgmL-1提取物和0.08 mgmL-1芹菜素。为了确定化合物1和提取物对NO释放的抑制作用是否与iNOS诱导的调节有关，通过Western blot分析J774.A1在LPS前1小时和同时与1（0.005~0.05mgmL-1）或提取物（0.01~0.1mg mL-1）孵育的细胞裂解物上iNOS的表达。化合物1（IC500.049 mgmL-1）和提取物（IC50 0.095 mgmL-1）显示出对iNOS表达的显著和浓度依赖性抑制作用（P<0.1，化合物1 0.05和0.01 mg mL-1；P<0.01，提取物0.1和0.05 mg mL-1）（图4和图5）。为了验证对细胞存活率的影响，使用MTT试验在两种不同的细胞系J774.A1（小鼠巨噬细胞）和HEK-293（人上皮肾细胞）上测试了提取物（0.01-0.1 mgmL−1）和化合物1（芹菜素）（0.005-0.05 mgmL-1）。我们的结果表明，它们不影响细胞存活率（数据未显示）。[1]

小鼠巴豆油耳试验表明，提取物在体内具有抗炎活性（ID50 730微克/厘米（-2）），效力比用作参考的非甾体抗炎药吲哚美辛（ID50 93微克/厘米）低七倍。提取物在体内显示的抗炎特性可能是由于iNOS酶表达的减少[1]
关于提取物的体内局部抗炎活性，使用巴豆油耳试验在小鼠身上进行了测试，表2报告了提取物在100、300或900mgcm-2剂量下的抗水肿作用。与吲哚美辛相比，研究了提取物的剂量-活性关系（ID50，剂量诱导50%水肿抑制=93mgcm-2）。该提取物引起了显著的剂量依赖性水肿抑制，其效力比吲哚美辛低七倍（ID50 730mgcm−2）[1]。

细胞毒性活性[1]
如前所述（Mosmann 1983；Picerno等人2005），通过MTT法在细胞培养物（J774.A1和HEK-293细胞系）中评估了PBS溶液中提取物（0.01-0.1 mg mL-1）和化合物1（0.005-0.05 mg mL-1）的潜在细胞毒性活性。用配备620nm滤光片的微孔板分光光度计测量每个孔的光密度（OD）。每个细胞系对受试化合物和6-MP处理的存活率计算为：死细胞百分比=100−（OD处理/OD对照）×100。细胞存活率的数据以存活率与阴性对照（PBS处理的细胞）的百分比表示。

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亚硝酸盐分析[1]
J774.A1细胞的单层通常通过用特氟纶细胞刮刀轻轻刮擦来收获，在新鲜培养基中稀释，并在37°C下培养至融合。在每个实验细胞被收获之前，在P60孔板上以1.5×106的接种密度进行接种。细胞粘附2小时后，在LPS（6×103 U mL−1/24小时）之前和同时，将PBS溶液中的提取物（0.01-0.1 mg mL−1）或1（0.005-0.05 mg mL−1）加入培养基中。根据Picerno等人（2005）的研究，在LPS攻击后24小时，通过Griess反应（Green等人，1982）在培养基中测量亚硝酸盐积累，这是一氧化氮（NO）释放的指标。使用在培养基中新制备的亚硝酸钠标准曲线计算样品中的亚硝酸盐含量。结果以单独用LPS处理的细胞对NO产生的抑制百分比表示。

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iNOS的蛋白质印迹分析[1]
用LPS孵育24小时后，取出培养基，裂解细胞，并根据Picerno等人（2005）进行蛋白质印迹分析。

局部抗炎活性[1]
局部抗炎活性通过抑制巴豆油诱导的小鼠耳廓水肿来评估（Tubaro 等，1985）。所有实验均符合 1992 年 1 月 27 日意大利第 116 号法令以及 1986 年 11 月 24 日欧洲共同体理事会指令 (86/609 ECC) 中的相关指南。雄性 CD-1 小鼠（28–32 g）用盐酸氯胺酮（145 mg kg−1，腹腔注射）麻醉。在麻醉小鼠的右耳内表面（面积：约 1 cm−2）涂抹 80 mg 巴豆油（溶于 42% 乙醇水溶液，v/v），该溶液用作提取物及其对照的溶剂。对照组小鼠仅接受刺激溶液，而其他小鼠接受刺激溶液和测试物质。在水肿反应达到峰值后（6 小时），处死小鼠，并从治疗侧（右耳）和未治疗侧（左耳）取出直径为 6 毫米的耳塞。水肿反应以两个耳塞的重量差来衡量。抗炎活性以治疗组小鼠水肿较对照组小鼠水肿减少的百分比表示。非甾体抗炎药（NSAID）吲哚美辛用作参考药物。

[1]. An extract of Apium graveolens var. dulce leaves: structure of the major constituent, apiin, and its anti-inflammatory properties. J Pharm Pharmacol. 2007 Jun;59(6):891-7.

阿皮因是一种β-D-葡萄糖苷，其2位上有一个β-D-芹糖基残基，异头位上有一个5,4'-二羟基黄酮-7-基部分。它是一种EC 3.2.1.18（外切α-唾液酸酶）抑制剂和植物代谢产物。它是一种β-D-葡萄糖苷、二羟基黄酮和糖基氧基黄酮。它在功能上与芹菜素相关。它是阿皮因(1-)的共轭酸。
据报道，阿皮因存在于猪屎豆（Crotalaria micans）、红花苋菜（Ageratina calophylla）和其他有相关数据的生物体中。
另见：洋甘菊（部分）；中华绒螯蟹（Chamaemelum nobile）花（部分）。

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黄酮类化合物是广泛分布于植物界的天然化合物，据报道其能够影响炎症过程，并在体外和体内均具有抗炎和免疫调节活性。由于诱导型一氧化氮合酶（iNOS）产生的一氧化氮（NO）是炎症介质之一，因此本研究评估了芹菜（Apium graveolens var. dulce）叶片乙醇/水（1:1）提取物对经大肠杆菌脂多糖（LPS）刺激24小时的J774.A1巨噬细胞系中iNOS表达和NO生成的影响。芹菜提取物的主要成分是芹菜素（占提取物重量的1.12%）。提取物和芹菜素在体外对LPS激活的J774.A1细胞中亚硝酸盐（NO）的产生（提取物和芹菜素的IC50值分别为0.073和0.08 mg mL⁻¹）和iNOS的表达（提取物和芹菜素的IC50值分别为0.095和0.049 mg mL⁻¹）均表现出显著的抑制活性。小鼠巴豆油耳试验表明，该提取物在体内具有抗炎活性（ID50值为730 μg cm⁻²），其效力比作为参考的非甾体抗炎药吲哚美辛（ID50值为93 μg cm⁻²）低7倍。我们的结果清楚地表明，在LPS刺激J774.A1细胞之前加入提取物和芹菜素，可有效抑制iNOS的表达和亚硝酸盐的产生。该提取物在体内表现出的抗炎特性可能归因于iNOS酶表达的降低。[1]

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黄酮类化合物是一类天然产物，在植物中具有大量衍生物，也是人类饮食中的常见成分。据报道，它们具有广泛的生化和药理作用，包括抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌和免疫调节活性（Gryglewski等，1987；Middleton和Kandaswami，1992；Cooks和Samman，1996）。据报道，其作用机制可能与抑制参与炎症过程和肿瘤发生的多种酶（如前列腺素合成酶、脂氧合酶和环氧合酶）以及诱导解毒酶（如谷胱甘肽S-转移酶）有关（Cooks & Samman 1996; Comalada et al 2006; Horinaka et al 2006; Vargo et al 2006）。尽管甜叶菊（A. graveolens var. dulce）在传统疗法中被广泛应用，但文献中关于其叶片成分作为抗炎剂及其作用机制的数据仍然不足。从香芹（A. graveolens）种子中分离得到的不同化学结构的化合物（如芹菜素内酯、senkyunolide-N 和 -J、L-色氨酸、色烯酮和吲哚衍生物）均被报道具有体外环氧合酶和拓扑异构酶抑制活性（Momin & Nair 2002）。香芹的粗乙醇提取物在角叉菜胶诱导的大鼠足爪水肿模型（Atta & Alkofahi 1998）和棉球肉芽肿模型（Al-Hindawi et al 1989）中均显示出体内抗炎活性。然而，该提取物在二甲苯诱导的小鼠耳廓水肿模型中未观察到明显的抗渗出作用（Al-Hindawi et al 1989）。先前研究表明，芹菜水提物（芹菜素的丰富来源）在无脂多糖（LPS）的情况下能增强前列腺素E2（PGE2）的生成；芹菜乙酸乙酯提取物在LPS存在的情况下也能增强RAW264.7细胞中PGE2的生成。Wu和Huang（2001）报道，黄酮苷元芹菜素能抑制PGE2的生成。众所周知，在炎症性疾病中，组成型和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）均能提高一氧化氮（NO）的生成，而iNOS产生的NO是另一种重要的炎症介质。本研究结果表明，芹菜极性提取物的主要成分是芹菜素，且含有丰富的多酚，这些成分可能共同促进了芹菜的生物活性。此外，在LPS刺激前1小时加入芹菜素和芹菜提取物，均能显著且呈浓度依赖性地抑制体外NO释放和iNOS表达，其IC50值分别为0.049 mgmL−1 (86.8 mM)和0.08 mgmL−1 (141.8 mM)。Kim等人(1999)在不同的实验条件下得到了不同的结果。他们发现，在巨噬细胞系RAW264.7中，当黄酮苷类化合物（如芹菜素）与LPS同时加入（浓度范围为1至100 mM）时，并未观察到NO释放和iNOS表达的抑制；然而，在相同的实验条件下，他们报道了黄酮类化合物（如芹菜素）对NO生成的抑制作用（IC50值为23 mM）。我们的体内实验结果证实了芹菜提取物的活性，首次表明芹菜叶提取物具有局部抗炎能力，能够改善炎症或其他可观察到iNOS表达增强的病症。这些结果与近期关于黄酮类化合物作为抗炎和抗氧化剂的研究（Chu et al 2002; Ninfali & Bacchiocca 2003）以及关于其作用机制的研究（Cooks & Samman 1996; Comalada et al 2006; Horinaka et al 2006; Vargo et al 2006）相一致。[1]

C26H28O14

564.4921

564.147

C, 55.32; H, 5.00; O, 39.68

26544-34-3

5280746

White to light yellow solid powder

1.7±0.1 g/cm3

942.2±65.0 °C at 760 mmHg

230ºC (dec.)

316.7±27.8 °C

0.0±0.3 mmHg at 25°C

1.744

0.74

228.97

8

14

7

40

923

8

C1[C@@]([C@H]([C@@H](O1)O[C@@H]2[C@H]([C@@H]([C@H](O[C@H]2OC3=CC(=C4C(=C3)OC(=CC4=O)C5=CC=C(C=C5)O)O)CO)O)O)O)(CO)O

NSVHIOLUPMJKID-RQUVOORVSA-N

InChI=1S/C26H30O14/c27-9-17-20(31)21(32)22(39-25-23(33)26(34,10-28)11-36-25)24(38-17)37-14-7-16(30)15-5-6-18(40(35)19(15)8-14)12-1-3-13(29)4-2-12/h1-4,6-8,17,20-25,27-34H,5,9-11H2/t17-,20-,21+,22-,23+,24-,25+,26?/m1/s1

7-((2-O-beta-D-Apiofuranosyl-beta-D-glucopyranosyl)oxy)-5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyranone

apiin; 26544-34-3; Apigenin-7-apioglucoside; Apioside; UNII-6QU3EZE37U; 6QU3EZE37U; CHEBI:15932; EINECS 247-780-0;

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~177.15 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.43 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.43 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。