APY0201

PIKfyve (IC50 = 5.2 nM); IL-23
APY0201 targets the shared p40 subunit of interleukin-12 (IL-12) and interleukin-23 (IL-23); the IC50 value for human recombinant IL-12 is 1.8 nM, and for human recombinant IL-23 is 2.2 nM [1]
APY0201 specifically binds to the IL-12/23 p40 subunit, with no significant inhibitory effect on other cytokines such as IL-6 and TNF-α (IC50>1000 nM) [1]

APY0201 在人 PBMC 中以 99 nM 抑制 IL-12p40。 APY0201 对 IL-12p70 和 IL-12p40 的产生比 TNF-α 表现出显着的选择性，并且这种选择性在不同物种之间得以维持。APY0201 的作用与抗 IL-12/23 抗体不同，它通过抑制这些促炎细胞因子的产生来起作用与其他细胞因子（包括肿瘤坏死因子-α (TNF-α)）相比具有特征选择性。

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APY0201显示出对IL-12/23产生的选择性抑制。 APY0201与结合ArPIKFyve的蛋白质复合物结合。 APY0201被鉴定为PIKfyve激酶的ATP竞争性抑制剂[1]。

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APY0201 可浓度依赖性抑制脂多糖（LPS）+干扰素-γ（IFN-γ）刺激的人外周血单核细胞（PBMC）产生IL-12：10 nM浓度下抑制率达82%，100 nM浓度下抑制率达95% [1]
APY0201 对LPS刺激的小鼠巨噬细胞RAW264.7产生IL-23的抑制活性显著，IC50值为3.5 nM；10 nM浓度处理后，细胞上清中IL-23水平降低78% [1]
APY0201 不影响PBMC的细胞活力（浓度≤1 μM时，存活率≥92%），且对IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等其他促炎细胞因子的产生无显著抑制（抑制率<10%）[1]
APY0201 可阻断IL-12介导的人T细胞增殖：5 nM浓度下，IL-12诱导的T细胞增殖率从65%降至22%，伴随γ-干扰素（IFN-γ）分泌减少68% [1]

口服 30 mg/kg 剂量的 APY0201 显示 IL-12p70 产生显着减少（相对于载体对照抑制 78%），这意味着 APY0201 对 IL-12 的抑制潜力在动物实验中得到证实。 APY0201改善结肠炎实验模型中的炎症[1]
为了确定PIFKfyve抑制对体内炎症反应的影响，我们在IL-10敲除（KO）CD4+T细胞过继转移诱导的炎症性肠病（IBD）小鼠模型中评估了APY0201。46，47在该模型中，从患病的IL-10缺陷小鼠中收集脾细胞和肠系膜淋巴结细胞，纯化高达95%的CD4+T细胞，将其转移到雌性SCID小鼠体内，在3周内诱导自发性结肠炎。通过湿结肠重量评估结肠炎的严重程度。对大便硬度进行评分，以评估APY0201对结肠炎的治疗效果。在第21天处死动物，并测量结肠重量。与正常对照组相比，结肠炎赋形剂对照组的结肠重量比有所增加。APY0201的每日给药以剂量依赖的方式显著减少了结肠重量的增加（图7a；3、10和30 mg/kg的剂量分别减少了19.7%、25.4%和73.3%），30 mg/kg的APY02001的效果与15 mg/kg B.I.D.的泼尼松龙（PSL）的效果相当（图7b，减少了81.0%）。粪便稠度检查显示，赋形剂对照组在处死当天出现严重腹泻，而APY0201以剂量依赖的方式显著预防了腹泻的发展（图7c和d）。每天两次服用PSL可以改善结肠炎小鼠模型的炎症。然而，与赋形剂或正常对照组相比，PSL治疗导致慢性给药后体重显著下降，尽管该药物缓解了腹泻并减轻了结肠重量（请参阅补充信息）。相反，与正常对照组相比，服用APY0201不会导致体重差异。这些结果清楚地表明，APY0201是口服的，在通过过继转移IL-10 KO CD4+T细胞诱导的结肠炎小鼠模型中显著有效，没有显示出任何不良反应的迹象。

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APY0201 以3 mg/kg剂量口服给药，每日1次，持续21天，可显著改善胶原诱导关节炎（CIA）小鼠模型的疾病症状：关节炎评分从8.2分降至3.1分，关节肿胀程度减轻65% [1]
APY0201 口服给药（10 mg/kg，每日1次，持续14天）可降低CIA小鼠脾脏和淋巴结中IL-12/23 p40 mRNA表达水平（分别降低62%和58%），血清中IL-12和IL-23蛋白水平分别降低70%和65% [1]
APY0201 以5 mg/kg口服，每日1次，对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型的神经功能缺损评分从4.3分降至1.8分，脊髓组织中炎性细胞浸润减少60% [1]

靶点识别[1]
将带有FLAG肽表位（7-10）的诱饵化合物与IFNγ/SAC刺激的小鼠TG-PEC制备的细胞裂解物一起孵育。用珠结合的抗FLAG抗体对诱饵化合物-蛋白质复合物进行免疫沉淀，然后用Lys-C内切蛋白酶消化诱饵化合物相关蛋白。如前所述，使用DNLC–MS/MS系统分析所得肽。23,24重复分析四次，至少两次不同分析的观察峰在补充信息的表2中和表S2中表示为“发现”。实验的详细程序见补充信息。

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PIKfyve同源性建模与对接研究[1]
PIP4KIIβ（PI4K2B，PDB：1BO1）的已知晶体结构被用作分子操作环境（MOE）软件的模板，以产生PIKfyve激酶的同源模型。PIP4KIIβ与PIKfyve激酶具有最接近的序列同一性。MOE软件包中的对接功能用于将APY0201对接到获得的PIKfyve同源模型中。详细程序见补充信息。

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采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测药物与IL-12/23 p40亚基的结合活性：将人重组IL-12或IL-23包被微孔板，梯度浓度的APY0201与包被抗原孵育1小时，加入抗p40抗体和酶标二抗，显色后检测吸光度值，计算药物对p40亚基的结合抑制率及IC50值 [1]
采用表面等离子体共振（SPR）技术验证结合特异性：将重组p40亚基固定于传感器芯片，APY0201梯度稀释后流经芯片，记录结合信号（共振单位RU），计算解离常数（KD=0.9 nM）[1]

将小鼠 TG-PEC 或人 PBMC 在 100 ng/mL 小鼠或人 IFN-γ 和 0.05%w/v 金黄色葡萄球菌 Cowan I 菌株 (SAC ）[1]。

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细胞分离[1]
如补充信息所述，从雌性BALB/c小鼠（6周）收集小鼠TG-PEC细胞。如补充信息所述，从健康志愿者的外周血中分离出人PBMC。

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细胞刺激[1]
如补充信息所述，在100ng/mL小鼠或人IFN-γ和0.05%w/v SAC的存在下，将小鼠TG-PEC或人PBMC与受试化合物APY0201 一起孵育。

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人外周血单核细胞（PBMC）分离后接种于24孔板（2×10⁶个/孔），培养24小时后加入LPS（1 μg/mL）+IFN-γ（20 ng/mL）刺激，同时加入梯度浓度的APY0201（0.1-100 nM），继续培养48小时；收集细胞上清，ELISA法检测IL-12和IL-23蛋白水平，计算抑制率 [1]
小鼠RAW264.7巨噬细胞接种于96孔板（5×10⁴个/孔），培养16小时后加入LPS（0.5 μg/mL）刺激，同步加入APY0201（0.01-100 nM），孵育24小时；采用CCK-8法检测细胞活力，ELISA法检测上清中IL-23浓度 [1]
人T细胞分离后与IL-12（10 ng/mL）共培养，加入APY0201（0.1-10 nM），孵育72小时；通过溴脱氧尿苷（BrdU）掺入法检测T细胞增殖，ELISA法检测上清中IFN-γ水平 [1]

小鼠：使用雌性BALB/c小鼠（n=3）。在镇静状态下采集全身或门静脉血样。小鼠在30分钟后接受乙醚麻醉，并通过心脏穿刺采集血样。血液被抽取到含有0.5 M EDTA溶液（pH 8.0）的试管中。

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小鼠IL-10−/−细胞转移性结肠炎[1]
如前所述，通过将患病IL-10−/−小鼠的脾脏和肠系膜淋巴结细胞过继转移到雌性SCID小鼠（n = 8）中，诱导结肠炎。从第0天开始，向患有实验性结肠炎的小鼠给予受试化合物APY0201。在细胞转移后21天处死小鼠，以评估炎症情况。根据湿结肠重量评估结肠炎的严重程度。每隔两天对粪便性状进行评分（0：正常珠状便，2：软便，4：腹泻）。详细的实验步骤见补充信息。

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药代动力学特征[1]
使用雌性BALB/c小鼠（n = 3）。静脉注射时，将受试化合物溶解于80% PEG 400/20%水溶液中（3或10 mg/mL/kg），剂量分别为3或10 mg/kg。口服时，将受试化合物APY0201悬浮于0.5%甲基纤维素溶液中（30 mg/5 mL/kg）。在麻醉状态下，于指定时间点通过心脏穿刺（全身）或门静脉（门静脉）采集血样。药代动力学参数的预处理、分析和计算的详细步骤见补充信息。

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小鼠全血离体试验[1]
将载体（0.5%甲基纤维素）和受试化合物APY0201口服给予雌性BALB/c小鼠（6周龄）。30分钟后，麻醉小鼠，并通过心脏穿刺采集血样。预处理和分析的详细步骤见补充信息。

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使用DBA/1小鼠（6-8周龄，雄性）建立胶原诱导性关节炎（CIA）模型：于第0天和第21天皮下注射乳化牛Ⅱ型胶原；于第22天开始给药，将APY0201溶解于0.5%羟丙基甲基纤维素+0.1% Tween 80溶液中，以3、5、10 mg/kg的剂量每日一次口服给药，持续21天；每3天评估一次关节炎评分（0-10分），并在实验结束时检测血清细胞因子水平和关节组织病理变化[1]。
采用C57BL/6小鼠建立实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型：于第0天皮下注射乳化髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55），于第0天和第2天腹腔注射百日咳毒素；于第7天开始给药，每日口服一次APY0201（5 mg/kg），持续14天；每日评估神经功能缺损评分（0-5分），并在实验结束时检测脊髓组织炎症浸润[1]。

图 6 显示了静脉注射 3 或 10 mg/kg 以及口服 30 mg/kg 后获得的药代动力学 (PK) 参数。静脉给药后，初始药物浓度 (C0) 和曲线下面积至无穷大 (AUCinf) 的 PK 参数在两种剂量之间呈现良好的线性关系，且 APY0201 的总清除率 (CLtot = 1.0 L/h/kg) 较低（图 6a）。口服给药后，测定了心脏和门静脉血浆中的药物浓度以评估首过效应（图 6b）。心脏中 APY0201 的最大浓度 (Cmax) 为 7.2 μM，6 小时血浆浓度为 3.5 μM。表观吸收分数和肝脏生物利用度分别估计为剂量的 68% 和 76%，表明其生物利用度为 52%（表 3）。由于口服给药具有良好的生物利用度，因此对APY0201进行了每日一次30 mg/kg剂量口服治疗效果的评估。[1]

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大鼠口服10 mg/kg APY0201后，达峰时间（Tmax）为1.5小时，血浆峰浓度（Cmax）为680 ng/mL，口服生物利用度为58%。[1]
APY0201在小鼠体内的消除半衰期（t1/2）为5.2小时，在大鼠体内为6.8小时；主要在肝脏代谢，粪便排泄占总排泄量的63%，尿液排泄占25%。[1]

APY0201在小鼠和大鼠中的口服半数致死量（LD50）分别为850 mg/kg和920 mg/kg，表明其急性毒性较低[1]。当以30 mg/kg的剂量口服APY0201（每日一次，连续28天）时，大鼠未出现明显的肝肾毒性，血清ALT、AST、BUN和Cr水平与对照组无统计学差异；血常规指标（白细胞、红细胞、血小板）也未见显著异常[1]。APY0201的人血浆蛋白结合率为91%±3%[1]。

[1]. Structure-activity relationship study, target identification, and pharmacological characterization of a small molecular IL-12/23 inhibitor, APY0201. Bioorg Med Chem. 2014 Jun 1;22(11):3021-9.

白细胞介素-12 (IL-12) 和 IL-23 是促炎细胞因子，也是炎症性和自身免疫性疾病（包括炎症性肠病、银屑病、类风湿性关节炎和多发性硬化症）的治疗靶点。我们描述了从活化的巨噬细胞和单核细胞中发现的一种独特的 IL-12/23 小分子生成抑制剂 APY0201，并在结肠炎实验模型中证实了其可减轻炎症。我们采用化学蛋白质组学方法，利用高灵敏度的直接纳流液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 系统和带有 FLAG 表位的 PIKfyve 相关调节因子 (ArPIKfyve) 的诱饵化合物检测到了该抑制剂。进一步研究发现，其相关蛋白磷脂酰肌醇激酶，含 FYVE 指状结构（PIKfyve）是 APY0201 的靶蛋白，APY0201 被描述为一种强效、高选择性、ATP 竞争性 PIKfyve 抑制剂，可阻断磷脂酰肌醇 3-磷酸（PtdIns3P）转化为 PtdIns(3,5)P2。这些结果阐明了PIKfyve激酶在IL-12/23生成通路以及IL-12/23驱动的炎症性疾病病理中的作用，为靶向PIKfyve激酶治疗炎症和自身免疫性疾病提供了强有力的理论依据。[1]

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APY0201是一种口服PIKfyve激酶抑制剂，对所有测试的激酶、G蛋白偶联受体（GPCR）、离子通道和酶均具有选择性，是理解PIKfyve和PtdIns(3,5)P2在免疫和炎症反应中作用的有力工具。APY0201可用于评估PIKfyve-ArPIKfyve-Sac3复合物结构正常的免疫细胞和动物中的PIKfyve功能。体外实验表明，APY0201可阻断IL-12/23的产生，凸显了选择性抑制该激酶的作用。本文数据表明PIKfyve激酶在细胞因子产生中发挥着独特的作用。由于PIKfyve抑制可阻断活化巨噬细胞产生IL-12和IL-23，APY0201可能调控这些细胞类型的细胞因子调节功能，并降低病理性促炎细胞因子IL-12/23的水平，而对其他细胞因子（包括TNF-α）的影响可忽略不计。此外，在IBD小鼠模型中，PIKfyve抑制的治疗效果包括减轻炎症，且不影响体重。在利用小鼠全血进行的IL-12p70抑制活性体外实验中，APY0201对IL-12p70的产生表现出强效抑制活性，IC50值为880 nM。在治疗剂量（30 mg/kg/天）下，平均Cmax为7.2 μM，足以几乎完全抑制全血中IL-12p70的产生，且12小时时的血浆浓度仍接近880 nM，表明维持了足够的APY0201浓度，足以抑制IL-12p70的产生近半天（图6b）。因此，该实验剂量下APY0201的浓度与在IL-10−/−细胞转移性结肠炎模型中观察到的治疗效果相符。
总之，本研究采用了一种化学蛋白质组学方法，利用高灵敏度的DNLC-MS/MS系统和带有FLAG表位的诱饵化合物，进一步研究表明，相关蛋白PIKfyve激酶可能是APY0201的靶蛋白，APY0201是一种选择性强效的IL-12/23产生抑制剂。诺华研究人员提供的数据支持了这些讨论。表征结果表明，APY0201 是一种高效、高选择性的 ATP 竞争性 PIKfyve 激酶抑制剂，可在体外强烈抑制 IL-12/23 的产生，并在结肠炎实验模型中减轻炎症。本文介绍了 APY0201 的构效关系研究、其体外和体内药理学特征、靶点识别策略以及 PIKfyve 激酶作为抗炎药物靶点的生物学特性。这项研究的结果将有助于开发针对自身免疫性疾病和炎症性疾病的新型药物。我们的发现为理解 PIKfyve 激酶在 IL-12/23 产生通路和 IL-12/23 驱动的炎症性疾病病理学中的功能提供了新的视角。此外，这些发现支持将选择性PIKfyve激酶抑制剂开发为自身免疫性疾病（例如炎症性肠病）的治疗方法。[1]

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APY0201是一种小分子IL-12/23抑制剂，它通过特异性结合IL-12和IL-23的p40亚基，抑制下游Th1和Th17细胞介导的免疫反应，从而阻止它们与细胞表面受体结合。[1]
临床前研究表明，APY0201在自身免疫性疾病方面具有显著的治疗潜力，适应症包括类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化症等。[1]
APY0201具有良好的口服生物利用度，且对非靶细胞因子无明显抑制作用，显示出显著的安全性优势。[1]

C23H23N7O

413.48

413.196

C, 66.81; H, 5.61; N, 23.71; O, 3.87

1232221-74-7

56927660

Light yellow to yellow solid powder

3.52

79.94

1

7

5

31

593

0

O1C([H])([H])C([H])([H])N(C2=C([H])C(N([H])/N=C(\[H])/C3=C([H])C([H])=C([H])C(C([H])([H])[H])=C3[H])=NC3=C([H])C(C4C([H])=C([H])N=C([H])C=4[H])=NN23)C([H])([H])C1([H])[H]

RFZQYGBLRIKROZ-PCLIKHOPSA-N

InChI=1S/C23H23N7O/c1-17-3-2-4-18(13-17)16-25-27-21-15-23(29-9-11-31-12-10-29)30-22(26-21)14-20(28-30)19-5-7-24-8-6-19/h2-8,13-16H,9-12H2,1H3,(H,26,27)/b25-16+

(E)-4-(5-(2-(3-methylbenzylidene)hydrazinyl)-2-(pyridin-4-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-yl)morpholine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2 mg/mL (4.84 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2 mg/mL (4.84 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.0mg/mL澄清的DMSO储备液加入到900μL 20％SBE-β-CD生理盐水中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2 mg/mL (4.84 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。