ARV-771

BRD2 (Kd = 4.7~34 nM); BRD3 (Kd = 8.3 nM); BRD4 (Kd = 9.6 nM)
ARV-771 targets bromodomain and extra-terminal (BET) family proteins (BRD2, BRD3, BRD4) and von Hippel-Lindau (VHL) E3 ubiquitin ligase. It also modulates androgen receptor (AR) signaling and AR levels [1]

与 BET 抑制相比，ARV-771（一种基于蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC) 技术的小分子泛 BET 降解剂）在 CRPC 细胞模型中显示出显着增强的功效。 ARV-771 的 DC50 小于 5 nM，可有效破坏 22Rv1 细胞中的 BRD2/3/4。 BET 蛋白的下游效应器之一是 c-MYC 蛋白。当 c-MYC 用 ARV-771 治疗时，其水平降低，IC50 小于 1 nM。 ARV-771 对 22Rv1、VCaP 和 LnCaP95 细胞系具有有效的抗增殖作用。 ARV-771 治疗以与细胞凋亡一致的方式显着改变细胞形状。用 10 nM ARV-771 处理会导致 VCaP 细胞中 FL-AR 和 AR-V7 mRNA 下调。在 VCaP 细胞中，ARV-771 对多个 AR 调节基因表现出抗雄活性[1]。

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1. ARV-771是强效泛BET降解剂：去势抵抗性前列腺癌（CRPC）细胞系（22Rv1、VCaP、LnCaP95）与ARV-771孵育16小时后，Western blot检测显示BRD2、BRD3、BRD4蛋白水平显著降低（n=3次独立实验）。[1]

2. ARV-771抑制c-MYC表达：处理16小时后，ELISA检测（n=3次三重重复）显示细胞内c-MYC蛋白水平降低；qPCR检测（2次生物学重复，每次三重重复，n=3）证实c-MYC mRNA水平下调。1μM ARV-771对c-MYC的抑制效果优于无活性非对映异构体ARV-766（1μM）及BET抑制剂OTX015（1μM）。[1]

3. ARV-771减弱AR信号并降低AR水平：处理16小时后，ELISA（n=3次三重重复）和Western blot（n=2次独立实验）显示全长AR（FL-AR）蛋白水平降低；在VCaP细胞中，qPCR检测（2次生物学重复，每次三重重复，n=3）显示FL-AR和AR-V7的mRNA水平下降，雄激素应答基因表达受抑；提前1小时用ARV-771预处理，可阻断R1881诱导的VCaP细胞ERG表达。[1]

4. ARV-771诱导CRPC细胞死亡：处理72小时后具有抗增殖活性（n=3次三重重复）；处理24小时后激活半胱天冬酶（caspase）（n=3次三重重复），并在22Rv1细胞中诱导PARP切割（Western blot检测）。[1]

5. ARV-771介导的BRD4降解依赖VHL和蛋白酶体：细胞提前30分钟用VHL配体ARV-056（10μM）或蛋白酶体抑制剂卡非佐米（1μM）预处理，可阻断ARV-771处理8小时诱导的BRD4降解（Western blot，n=2次独立实验）。[1]

6. ARV-771可导致22Rv1细胞出现凋亡相关形态学改变（20倍显微镜观察）。[1]

当带有 AR-V7+ 22Rv1 肿瘤异种移植物的未去势雄性 Nu/Nu 小鼠每天以 10 mg/kg 的剂量皮下注射 ARV-771，连续三天，肿瘤组织中 BRD4 和 c-MYC 的水平分别下调 37% 和 76%。 ARV-771 治疗后，22Rv1 肿瘤中 AR-V7 水平显着下调[1]。

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1. ARV-771在体内下调BRD4并抑制c-MYC：Nu/Nu小鼠接种22Rv1肿瘤异种移植模型后，每日皮下注射ARV-771（10mg/kg），连续3天，可降低肿瘤组织中BRD4水平及c-MYC表达（每组9只小鼠）。[1]

2. ARV-771具有剂量依赖性肿瘤生长抑制（TGI）和退缩效应：在14天22Rv1异种移植研究中（每组9只小鼠），皮下注射ARV-771（3mg/kg、10mg/kg）可下调BRD4和c-MYC（Western blot）；每日皮下注射30mg/kg可诱导肿瘤退缩（每组10只小鼠）。[1]

3. ARV-771降低肿瘤中AR-V7水平：22Rv1异种移植小鼠每日皮下注射ARV-771（10mg/kg），连续14天，肿瘤组织中AR-V7水平降低（每组9只小鼠）。[1]

4. ARV-771在VCaP异种移植模型中有效：CB17 SCID小鼠接种VCaP肿瘤后，采用间歇性给药方案的ARV-771可诱导TGI（每组10只小鼠）；该药物可降低VCaP肿瘤中BRD4和c-MYC水平（Western blot），并抑制血清前列腺特异性抗原（PSA）水平（ELISA，各处理组重复数分别为8、5、8、8）。[1]

5. ARV-771疗效优于BET抑制剂OTX015：在22Rv1异种移植模型中，ARV-771对BRD4的下调作用和c-MYC的抑制效果显著优于OTX015（Western blot，每组9只小鼠）。[1]

c-MYC ELISA。[1]
22Rv1细胞（每孔30000个细胞）被给予以1:3比例连续稀释的化合物，形成八点剂量曲线。吸取培养基，用PBS洗涤细胞一次。使用补充了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液（50μL）裂解细胞。将裂解物离心并转移到96孔c-MYC ELISA板上。

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AR-ELISA。[1]
VCaP细胞（每孔40000个细胞）被给予以1:3比例连续稀释的化合物，形成八点剂量曲线。吸出培养基，在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的细胞裂解缓冲液中裂解细胞。将裂解物离心并转移到96孔雄激素受体ELISA板上。

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1. BET蛋白结合实验：采用结合实验测定ARV-771对BRD1和BRD2的Kd值（具体方法未详述），以无法结合VHL的ARV-766作为无活性对照。[1]

2. 蛋白水平ELISA检测：CRPC细胞经ARV-771处理16小时后，通过ELISA定量细胞内c-MYC或FL-AR蛋白水平，实验设三重重复以保证可重复性。[1]

3. mRNA水平qPCR检测：CRPC细胞经ARV-771（或对照ARV-766、OTX015）在指定浓度下处理16小时后，提取总RNA并逆转录为cDNA，采用特异性引物对c-MYC、FL-AR、AR-V7及雄激素应答基因进行qPCR定量，以GAPDH为内参；实验包含2次生物学重复，每次设三重重复。[1]

ARV-771 溶解在 DMSO 中。 22Rv1 细胞（每孔 5,000 个细胞）使用按 1:3 连续稀释的 ARV-771 给药，以获得 72 小时的 10 点剂量曲线。添加 CellTiter-Glo 发光细胞活力测定，并在光度计上读取板的读数。使用 GraphPad Prism 软件[1] 分析并绘制数据。

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1. 蛋白降解/切割Western blot检测：CRPC细胞（22Rv1、VCaP、LnCaP95）经ARV-771处理16小时（检测BET/AR）、8小时（检测BRD4降解机制）或24小时（检测PARP切割）后，制备细胞裂解液，通过Western blot检测BRD2/3/4、FL-AR、PARP及内参蛋白；机制验证实验中，细胞在ARV-771处理前30分钟用ARV-056（10μM）或卡非佐米（1μM）预处理。[1]

2. 细胞增殖实验：CRPC细胞接种于96孔板，经ARV-771处理72小时后，采用标准方法定量增殖能力，实验设三重重复。[1]

3. 半胱天冬酶（caspase）激活实验：CRPC细胞经ARV-771处理24小时后，检测caspase活性以评估凋亡诱导效果（n=3次三重重复）。[1]

4. 细胞形态学观察：22Rv1细胞经ARV-771处理后，在20倍显微镜下观察凋亡相关形态学变化。[1]

5. ERG诱导抑制实验：VCaP细胞经ARV-771预处理1小时后，加入R1881处理，检测ERG表达以评估AR信号抑制效果。[1]

Mice were implanted subcutaneously with 5 × 106 22Rv1 or VCaP cells in Matrigel. Dosing was carried out for up to 3 wk, depending on the experiment. Mice were sacrificed 8 h after the final dose. Plasma and tissues were harvested and flash frozen for further analysis. All PK analysis was carried out at Drumetix Laboratories. Plasma PSA was analyzed by the PathScan Total PSA/KLK3 Sandwich ELISA Kit following the manufacturer’s protocol.[1]

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1. 22Rv1 xenograft model (Nu/Nu mice): Tumor xenografts are established by implanting 22Rv1 cells into Nu/Nu mice. Mice are divided into treatment cohorts (n=9–10 per cohort) and administered ARV-771 via subcutaneous injection at doses of 3 mg/kg, 10 mg/kg, or 30 mg/kg. Dosing is performed once daily for 14 days (or 3 days for short-term studies). Tumors and plasma are harvested 8 hours after the last dose for Western blot, ELISA, and qPCR analysis. [1]

2. VCaP xenograft model (CB17 SCID mice): VCaP tumor xenografts are established in CB17 SCID mice. Mice are treated with ARV-771 via subcutaneous injection using intermittent dosing schedules (n=10 per cohort). The study duration is 14 days, with tumors, plasma, and serum collected 8 hours after the last dose for BRD4/c-MYC detection (Western blot) and PSA quantification (ELISA). [1]

1. ARV-771 has a well-defined pharmacokinetic (PK) profile: ARV-771 was administered to mice via different routes and at different concentrations, and its plasma concentration was monitored over time (Figure S4A). Specific PK parameters (e.g., half-life, oral bioavailability) were not provided. [1]

1. ARV-771 did not show obvious toxicity in mice: In the 22Rv1 and VCaP xenograft studies, the weight of mice did not show obvious abnormalities (Figures S5A and S5B), indicating that it was well tolerated. [1]

[1]. PROTAC-induced BET protein degradation as a therapy for castration-resistant prostate cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Jun 28;113(26):7124-9.

This study demonstrates that the BET PROTAC inhibitor ARV-771, based on the von Hippel-Landau (VHL) E3 ligase, exhibits high activity against a castration-resistant prostate cancer (CRPC) cell model. ARV-771 induces rapid degradation of BET protein in these cells, with a DC50 value (drug concentration resulting in 50% protein degradation) <1 nM. Notably, ARV-771-mediated BET degradation leads to decreased transcriptional levels of FL-AR and AR-V7. In contrast, treatment of CRPC cells with BET inhibitors suppresses AR-V7 expression but does not affect FL-AR expression. Furthermore, ARV-771-induced apoptosis is significantly higher than that induced by BET inhibitors. Finally, subcutaneous injection of ARV-771 is effective in two different CRPC mouse models and induces regression of enzalutamide-resistant 22Rv1 xenografts. Therefore, this study confirms that BET protein degradation is a promising clinical strategy for treating metastatic castration-resistant prostate cancer (CRPC) and demonstrates the feasibility of using PROTACs-mediated small molecule protein degradation to treat solid tumors. [1] 1. ARV-771 is a protein hydrolysis-targeting chimera (PROTAC) based on pan-BET degradation technology. [1] 2. Its inactive diastereomer is ARV-766, which cannot bind to VHL and cannot induce BET degradation. [1] 3. ARV-771 was developed for the treatment of castration-resistant prostate cancer (CRPC), a disease that depends on the androgen receptor (AR) signaling pathway and has a poor prognosis after anti-androgen resistance. [1] 4. Unlike BET inhibitors, ARV-771 can simultaneously inhibit AR signaling and AR levels, showing significantly improved efficacy in CRPC models. [1]
5. This study is the first to demonstrate the efficacy of small molecule BET degraders in solid tumors. [1]

C49H60CLN9O7S2

986.6398

985.374

C, 59.65; H, 6.13; Cl, 3.59; N, 12.78; O, 11.35; S, 6.50

1949837-12-0

126619980

Typically exists as White to light yellow solids at room temperature

1.4±0.1 g/cm3

1.674

3.84

259Ų

4

13

19

68

1750

5

ClC1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1[H])C1C2C(C([H])([H])[H])=C(C([H])([H])[H])SC=2N2C(C([H])([H])[H])=NN=C2[C@]([H])(C([H])([H])C(N([H])C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])C(N([H])[C@]([H])(C(N2C([H])([H])[C@@]([H])(C([H])([H])[C@@]2([H])C(N([H])[C@@]([H])(C([H])([H])[H])C2C([H])=C([H])C(C3=C(C([H])([H])[H])N=C([H])S3)=C([H])C=2[H])=O)O[H])=O)C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=O)=O)N=1

HJGNHEQIOZDQRW-VZRXUJQISA-N

InChI=1S/C50H63N9O7S2/c1-28-11-13-35(14-12-28)43-42-29(2)32(5)68-49(42)59-33(6)56-57-46(59)38(54-43)24-40(61)51-19-22-65-20-10-21-66-26-41(62)55-45(50(7,8)9)48(64)58-25-37(60)23-39(58)47(63)53-30(3)34-15-17-36(18-16-34)44-31(4)52-27-67-44/h11-18,27,30,37-39,45,60H,10,19-26H2,1-9H3,(H,51,61)(H,53,63)(H,55,62)/t30-,37+,38-,39-,45+/m0/s1

(2S,4R)-1-((S)-2-(tert-butyl)-4,14-dioxo-15-((S)-2,3,9-trimethyl-4-(p-tolyl)-6H-thieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-6-yl)-6,10-dioxa-3,13-diazapentadecanoyl)-4-hydroxy-N-((S)-1-(4-(4-methylthiazol-5-yl)phenyl)ethyl)pyrrolidine-2-carboxamide

ARV771; ARV 771; CHEMBL4215078; (2S,4R)-1-[(2S)-2-[[2-[3-[2-[[2-[(9S)-7-(4-chlorophenyl)-4,5,13-trimethyl-3-thia-1,8,11,12-tetrazatricyclo[8.3.0.02,6]trideca-2(6),4,7,10,12-pentaen-9-yl]acetyl]amino]ethoxy]propoxy]acetyl]amino]-3,3-dimethylbutanoyl]-4-hydroxy-N-[(1S)-1-[4-(4-methyl-1,3-thiazol-5-yl)phenyl]ethyl]pyrrolidine-2-carboxamide; (2S,4R)-1-((2S)-2-(tert-butyl)-15-((6S)-4-(4-Chlorophenyl)-2,3,9-trimethyl-6H-thieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-6-yl)-4,14-dioxo-6,10-dioxa-3,13-diazapentadecan-1-oyl)-4-hydroxy-N-((S)-1-(4-(4-methylthiazol-5-yl)phenyl)ethyl)pyrrolidine-2-carboxamide; (2S,4R)-1-((S)-2-(tert-butyl)-15-((S)-4-(4-chlorophenyl)-2,3,9-trimethyl-6H-thieno[3,2-f][1,2,4]triazolo[4,3-a][1,4]diazepin-6-yl)-4,14-dioxo-6,10-dioxa-3,13-diazapentadecanoyl)-4-hydroxy-N-((S)-1-(4-(4-methylthiazol-5-yl)phenyl)ethyl)pyrrolidine-2-carboxamide; ARV771; SCHEMBL18551355; ARV-771.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 50 mg/mL (~50.68 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (2.53 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (2.53 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (2.53 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。