MmpL3
AU1235 targets MmpL3 (mycobacterial membrane protein large 3), an essential protein in Mycobacterium tuberculosis. MmpL3 is a membrane transporter that plays a critical role in cell wall synthesis by mediating the transport of trehalose monomycolate across the inner membrane. By inhibiting MmpL3, AU1235 disrupts cell wall assembly, leading to bacterial death. The compound has a minimum inhibitory concentration (MIC) of 0.1 μg/mL (0.3 μM) against M. tuberculosis. It is active against isoniazid-resistant strains, indicating a distinct mechanism of action from first-line anti-TB drugs.

AU1235 与氟喹诺酮类、乙胺丁醇和/或链霉素联用时，对耐多药结核分枝杆菌分离株表现出相似的疗效。AU1235 还可用于治疗结核病患者对吡嗪酰胺、利福平和异烟肼的耐药性。AU1235 具有良好的药用特性。尽管 AU1235 的最低抑菌浓度 (MIC) (3.2 至 6.4 μg/ml) 远高于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌卡介苗，但它仍然能够抑制耻垢分枝杆菌和偶发分枝杆菌 [2]。体外实验表明，AU1235 对结核分枝杆菌具有强效活性，最低抑菌浓度 (MIC) 为 0.1 μg/mL (0.3 μM)。该 MIC 与最低杀菌浓度 (MBC) 相同，表明其具有杀菌活性。该化合物对异烟肼耐药菌株具有活性。虽然关于其对MmpL3抑制的IC₅₀值的详细报道不多，但该化合物强大的抗分枝杆菌活性已得到充分证实。

现有文献中关于AU1235的详细体内活性数据报道较少。作为一种强效的MmpL3抑制剂，AU1235对结核分枝杆菌具有活性，预计其在结核病动物模型中具有体内疗效。然而，现有文献中并未提供具体的动物体内疗效数据。需要开展进一步的研究来证实其治疗潜力。

结核分枝杆菌自发产生AU1235抗性突变株的筛选[2]
在添加了OADC和0.2至0.4 μg ml−1抑制剂（2至4 × MIC）的7H11平板上，于37°C（结核分枝杆菌H37Rv）或30°C（结核分枝杆菌H37Ra）下筛选AU1235抗性突变株，并在接种后3至7周评估其抗性。

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霉菌酰转移酶活性测定[2]
采用参考文献24中描述的TMM酯交换法测定纯化的FbpA、FbpB和FbpC蛋白在结核分枝杆菌中纯化的冷TMM、[U-14C]海藻糖和不同浓度AU1235存在下的霉菌酰转移酶活性（见补充图5）。纯化的FbpA和FbpB蛋白是通过美国国立卫生研究院（NIH）结核病疫苗测试和研究材料合同以及NIH生物防御和新发传染病研究资源库（隶属于NIH国家过敏症和传染病研究所）获得的：Ag85A，来自结核分枝杆菌H37Rv的纯化天然蛋白（NR-14856）；Ag85B，来自结核分枝杆菌H37Rv的纯化天然蛋白（NR-14857）。纯化的重组FbpC（Ag85C）由K. Dobos博士惠赠。
由于AU1235的作用机制涉及抑制细菌膜转运蛋白，因此非细胞检测方法并不常见。然而，可以使用膜制剂或重组系统进行MmpL3活性测定，以测量海藻糖单霉菌酸酯的转运。该化合物的效力主要通过细菌培养物中的最小抑菌浓度（MIC）测定来评估。

最小抑菌浓度 (MIC) 的测定。[1]
MIC 的测定方法如文献 (31, 32) 所述，分别在固体培养基和液体培养基上进行。对于固体培养基，将 5 μl 浓度为 1 × 10⁵ CFU/ml 的菌液接种于 24 孔板中。培养板于 37°C 培养 4 周，MIC 定义为抑制细菌生长的最低浓度。对于液体培养基，将 35 μl 浓度为 0.06 至 0.10 的菌液接种于 96 孔板中，于 37°C 培养 5 天后，通过测定 OD590 值来评估细菌生长情况。MIC₉₀ (IC₉₀) 定义为抑制 90% 细菌生长的浓度。所有化合物均溶于二甲基亚砜 (DMSO)。 SQ109 和 AU1235 的合成按照已发表的方案进行 (4)。MIC 测定至少进行生物学重复。药物敏感性试验[2] 在 37°C 下，使用 96 孔微量滴定板，在 7H9-OADC-Tween 80 或 7H9-S-OADC-Tween 80 肉汤中，采用比色法刃天青微量滴定法和目测菌落生长情况，测定了各种抗生素对分枝杆菌临床分离株和重组菌株的 MIC 值。低氧张力实验采用快速厌氧休眠 (RAD) 模型进行，具体方法如前所述。对照管中含有亚甲蓝染料 (1.5 μg ml−1) 作为氧气消耗的指示剂。将不同浓度的AU1235和对照药物（异烟肼、利福平、乙胺丁醇和甲硝唑）通过隔膜注入缺氧培养物中，并在37℃下搅拌培养4天。之后移除隔膜，将培养物用生理盐水进行系列稀释，并涂布于7H11-OADC琼脂平板上进行菌落形成单位（CFU）计数。
使用结核分枝杆菌培养物进行AU1235的细胞活性测定。将细菌培养于合适的培养基中，并用不同浓度的化合物处理。采用肉汤微量稀释法或琼脂稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）。通过将MIC孔中的菌液接种到不含药物的琼脂平板上进行传代培养，测定最小杀菌浓度（MBC）。评估该化合物对耐药菌株（例如异烟肼耐药菌株）的活性。

需要建立AU1235的体内动物模型来评估其治疗潜力。基于其作为MmpL3抑制剂对结核分枝杆菌的活性机制，相关模型可包括结核病感染的小鼠模型。该化合物将通过适当的给药途径（例如，灌胃或腹腔注射）以不同剂量给药。疗效评估将通过测量肺和脾脏中的细菌载量、生存率以及组织病理学分析来进行。

AU1235 的分子量为 324.34 g/mol，分子式为 C₁₇H₁₉F₃N₂O。CAS 编号为 1338780-86-1。该化合物在 DMSO 中的溶解度为 25 mg/mL。HPLC 纯度 >98%。储存条件：粉末 -20°C 可保存 3 年；4°C 可保存 2 年；溶剂 -80°C 可保存 6 个月，-20°C 可保存 1 个月。该化合物仅供研究使用。

现有文献中关于AU1235的详细毒理学数据报道并不多。作为一种研究化合物，其安全性需要通过标准的临床前毒性评估来确定。该化合物仅供研究使用，不得用于人体。鉴于其靶向细菌特异性蛋白的作用机制，预计该化合物具有良好的选择性。处理该化合物时应遵循标准的实验室安全操作规程。

[1]. McNeil MB, et al. Multiple Mutations in Mycobacterium tuberculosis MmpL3 Increase Resistance to MmpL3 Inhibitors. mSphere. 2020;5(5):e00985-20. Published 2020 Oct 14.
[2]. Grzegorzewicz AE, et al. Inhibition of mycolic acid transport across the Mycobacterium tuberculosis plasma membrane. Nat Chem Biol. 2012;8(4):334-341. Published 2012 Feb 19.

结核分枝杆菌蛋白MmpL3在细胞壁合成中起着至关重要的作用，因为它影响海藻糖单霉素的跨膜转运。许多结构各异的药效团已被鉴定为MmpL3抑制剂，这主要基于对携带MmpL3突变的耐药菌株的鉴定。对于某些化合物，可能存在不同的主要或次要靶点。本文研究了螺胺类化合物的耐药性。对耐药突变株的分离和测序表明，所有突变株均存在MmpL3突变。我们假设，如果该药效团存在其他靶点，那么对耐药菌株的连续筛选可能会发现其他位点的突变。由于这些化合物对耐药菌株仍然有效，尽管效力有所降低，因此我们在此背景下分离了更高浓度的耐药突变株。经过第二轮螺胺类化合物筛选后，我们发现了MmpL3中的其他突变。为了提高发现替代靶点的概率，我们使用不同的分子骨架（AU1235，一种金刚烷基脲）进行了第三轮分离。出乎意料的是，我们在MmpL3中获得了更多的突变。MmpL3中的多个突变提高了耐药水平和对不同药效团的耐药谱，且未在体外诱导适应性代价。这些结果支持了MmpL3是主要耐药机制且可能是这些药效团靶点的假设。重要性：结核分枝杆菌是全球主要的人类病原体，迫切需要新的药物和药物靶点。细胞壁生物合成是目前结核病药物和正在研发的新药的主要靶点。一些新型分子似乎共享同一个靶点MmpL3，该靶点参与分枝杆菌细胞壁的输出和合成。然而，MmpL3是否是这些分子的主要或唯一靶点仍存在争议。我们的目标是验证一系列分子的耐药机制。我们发现MmpL3基因的突变导致了对螺胺类化合物的耐药性。同一蛋白（MmpL3）的多个突变赋予了菌株对这些化合物以及另外两类化合物的高水平耐药性。这些突变并未降低培养中的生长速率。这些结果支持了MmpL3是主要耐药机制且可能是这些药效团靶点的假设。[1] MmpL3基因的其他突变拓宽了耐药谱。在我们之前两轮耐药突变株的分离中，除了携带MmpL3基因的菌株外，我们没有发现其他耐药菌株。由于携带这两个突变的菌株现在对我们最初的两种化合物（表1和表2）均表现出相对较高的耐药性（>50 μM），我们无法尝试进一步分离IDR-0334448或IDR-0033216的耐药菌株。然而，SQ109 和 AU1235 的交叉耐药谱存在差异（表 2），这与化合物与 MmpL3 具有独特相互作用的预期相符。因此，我们利用菌株对这些化合物并非完全耐药这一观察结果，进行了第三轮耐药突变株的分离。我们筛选了两个对 SQ109 表现出不同程度耐药性但对 AU1235 无明显耐药性的菌株：（i）LP-0334448-RM102 携带 F255L 和 L567P 突变，对 SQ109 的耐药性提高了 5.5 倍；（ii）LP-0334448-RM107 携带 F255L 和 V646M 突变，对 SQ109 的耐药性提高了 3.3 倍。选择这些突变是因为它们能使菌株对其他药效团产生耐药性，并且是功能上重要的残基（5、24、25）。由于AU1235的MIC值变化小于2倍，我们能够像之前一样，在固体培养基上以5倍MIC浓度分离出耐药突变株。我们再次假设，如果其他靶位点发生突变，这些分离出的耐药突变株不会在MmpL3中发生突变。然而，对9株菌株（3株来自LP-0334448-RM102，6株来自LP-0334448-RM107）的测序结果表明，所有菌株在F644位点均存在额外的突变，即F644L或F644I（表3），并且对AU1235表现出高度耐药性（MIC值分别变化了16倍和100倍）。这些菌株也表现出对SQ109的交叉耐药性，但程度较轻（分别为5倍和6.7倍）。F644L突变并未导致对结构相关螺旋胺（即IDR-0541243）的耐药性增加，而F644I突变则使耐药性增加了7倍（表3）。这与F644位点的预测功能重要性以及多个药效团靶向该位点的情况相符。[1] 总之，在表达mmpL3-G253E的结核分枝杆菌细胞中，AU1235的积累并未改变，而mmpL3表达的降低模拟了用AU1235治疗分枝杆菌的表型效应。这些事实驳斥了MmpL3是金刚烷基脲外排泵的假设，并证实该转运蛋白是我们原型抑制剂的直接靶点。 [2]
AU1235 是一种金刚烷基脲化合物，对结核分枝杆菌蛋白 MmpL3 具有强效抑制活性。其对结核分枝杆菌的最低抑菌浓度 (MIC) 为 0.1 μg/mL (0.3 μM)，与最低杀菌浓度 (MBC) 相同。该化合物对异烟肼耐药菌株也有效。AU1235 是一种新型的特异性 MmpL3 抑制剂，MmpL3 是结核分枝杆菌细胞壁合成所必需的蛋白质。它用于结核病研究和抗菌药物开发。本品仅供研究使用。

C17H19F3N2O

324.3408

324.144

C, 62.95; H, 5.90; F, 17.57; N, 8.64; O, 4.93

1338780-86-1

941678-49-5;

54752297

Solid powder

3.9

41.1

2

4

2

23

445

0

C1C2CC3CC1CC(C2)(C3)NC(=O)NC4=C(C(=C(C=C4)F)F)F

FRRHMLGKNPFRKT-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H19F3N2O/c18-12-1-2-13(15(20)14(12)19)21-17(23)22-16-10-4-8-3-9(6-10)7-11(16)5-8/h1-2,8-11,16H,3-7H2,(H2,21,22,23)

1-(2-Adamantyl)-3-(2,3,4-trifluorophenyl)urea

AU1235; AU-1235; AU1235; 1338780-86-1; 1-(1-adamantyl)-3-(2,3,4-trifluorophenyl)urea; CHEMBL1818385; SCHEMBL18423981; SCHEMBL18464994; SCHEMBL18464996; AU 1235

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

Ethanol : ~65 mg/mL
DMSO : 10~25 mg/mL ( 30.83~77.08 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 10% DMSO+90% (20% SBE-β-CD in Saline): ≥ 2.5 mg/mL (7.71 mM)

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。