MmpL3

AU1235 与氟喹诺酮类、乙胺丁醇和/或链霉素联合使用，对 MDR 分离株表现出类似的功效。结核病患者对吡嗪酰胺、利福平和异烟肼的耐药性。药用品质。尽管AU1235的最低抑菌浓度（MIC）（3.2至6.4 μg/ml）显着高于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG，但它仍然抑制耻垢分枝杆菌和偶发分枝杆菌[2]。

结核分枝杆菌AU1235自发抗性突变体的筛选[2]
在37°C（结核分枝杆菌H37Rv）或30°C（结核病分枝杆菌H37Ra）下，在补充了OADC和0.2至0.4μg ml-1抑制剂（2至4×MIC）的7H11平板上选择AU1235抗性突变体，并在接种后3至7周进行抗性评分。

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霉菌转移酶测定[2]
参考文献24中描述的TMM酯交换试验用于在从结核分枝杆菌纯化的冷TMM、[U-14C]海藻糖和不同浓度的AU1235存在下测量纯化的FbpA-FbpB和FbpC蛋白的分枝杆菌转移酶活性（见图5）。纯化的FbpA和FbpB蛋白是通过美国国立卫生研究院结核病疫苗测试和研究材料合同和美国国立卫生院生物防御和新兴感染研究资源库获得的，NIAID，NIH:Ag85A，来自结核分枝杆菌H37Rv（NR-14856）的纯化天然蛋白；Ag85B，来自结核分枝杆菌H37Rv（NR-14857）的纯化天然蛋白。纯化的重组FbpC（Ag85C）由K.Dobos博士提供。

MIC的测定。[1]
如所述（31，32），在固体或液体介质上测定MIC。对于固体培养基，在接种了5μl 1×105 CFU/ml培养物的24孔平板中测定MIC。平板在37°C下孵育4周，MIC定义为阻止生长的最小浓度。对于液体培养基，在接种了35μl培养物的96孔板上进行检测，在590 nm（OD590）的光密度为0.06至0.10；在37°C下放置5天后，通过OD590测量生长。MIC90（IC90）被定义为90%的生长受到抑制的浓度。将所有化合物溶解在二甲亚砜（DMSO）中。SQ109和AU1235是根据已发表的方案合成的（4）。MIC测定至少在生物复制品中进行。

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药物敏感性试验[2]
使用比色刃天青微量滴定法和生长目视读数法，在37°C下在96孔微量滴定板上的7H9 OADC吐温80或7H9-S-OADC-吐温80肉汤中测定各种抗生素对分枝杆菌临床分离株和重组菌株的MIC值。如所述，使用快速厌氧休眠（RAD）模型进行低氧张力实验。对照管中含有亚甲基蓝染料（1.5μg ml−1），作为氧气消耗的指示剂。通过缺氧培养物的隔膜注射不同浓度的AU1235和对照药物（异烟肼、利福平、乙胺丁醇和甲硝唑），让培养物在37℃下搅拌生长4天，然后取出隔膜，用生理盐水连续稀释培养物，并将其铺在7H11-OADC琼脂平板上，以计数CFU。

[1]. McNeil MB, et al. Multiple Mutations in Mycobacterium tuberculosis MmpL3 Increase Resistance to MmpL3 Inhibitors. mSphere. 2020;5(5):e00985-20. Published 2020 Oct 14.
[2]. Grzegorzewicz AE, et al. Inhibition of mycolic acid transport across the Mycobacterium tuberculosis plasma membrane. Nat Chem Biol. 2012;8(4):334-341. Published 2012 Feb 19.

结核分枝杆菌蛋白MmpL3在细胞壁合成中发挥着至关重要的作用，因为它影响着海藻糖单霉菌酸酯跨内膜的转运。许多结构各异的药效团已被鉴定为MmpL3抑制剂，这主要基于对携带MmpL3突变的耐药菌株的鉴定。对于某些化合物，可能存在不同的主要或次要靶点。本文研究了螺旋胺类化合物的耐药性。对耐药突变株的分离和测序表明，所有突变株均存在MmpL3突变。我们假设，如果该药效团存在其他靶点，那么通过连续筛选耐药菌株可能会发现其他位点的突变。由于化合物对耐药菌株仍然有效，尽管效力有所降低，因此我们在此背景下，以更高的浓度分离了耐药突变株。在用螺旋胺进行第二轮筛选后，我们发现了MmpL3中的其他突变。为了提高发现替代靶点的几率，我们使用不同的分子骨架（AU1235，一种金刚烷基脲）进行了第三轮分离。出乎意料的是，我们获得了MmpL3的更多突变。MmpL3的多个突变提高了对不同药效团的耐药水平和耐药谱，但并未在体外造成适应性代价。这些结果支持了MmpL3是主要耐药机制且可能是这些药效团靶点的假设。重要性：结核分枝杆菌是全球主要的人类病原体，迫切需要新的药物和新的药物靶点。细胞壁生物合成是目前结核病药物和正在研发的新药的主要靶点。几种新型分子似乎具有相同的靶点MmpL3，该靶点参与分枝杆菌细胞壁的输出和合成。然而，MmpL3是否是这些分子的主要或唯一靶点仍存在争议。我们希望确认其中一系列分子的耐药机制。我们鉴定出MmpL3基因的突变，这些突变导致了对螺旋胺系列化合物的耐药性。同一蛋白（MmpL3）中的多个突变赋予了菌株对这些化合物以及另外两个系列化合物的高水平耐药性。这些突变并未降低培养中的生长速率。这些结果支持了MmpL3是主要耐药机制且可能是这些药效团靶点的假设。[1] MmpL3基因的额外突变扩大了耐药谱。在我们之前的两轮耐药突变体分离中，我们没有发现任何MmpL3基因以外的耐药菌株。由于携带两个突变的菌株现在对我们最初的两种化合物均具有相对较高的耐药性（>50 μM）（表1和表2），我们无法尝试对IDR-0334448或IDR-0033216进行进一步的耐药菌株分离。然而，SQ109 和 AU1235 的交叉耐药谱存在差异（表 2），这与化合物与 MmpL3 具有独特相互作用的预期相符。因此，我们利用菌株对这些化合物并非完全耐药这一观察结果，进行了第三轮耐药突变株的分离。我们筛选出两株对 SQ109 表现出不同程度耐药性且对 AU1235 无明显耐药性的菌株：（i）LP-0334448-RM102 携带 F255L 和 L567P 突变，对 SQ109 的耐药性提高了 5.5 倍；（ii）LP-0334448-RM107 携带 F255L 和 V646M 突变，对 SQ109 的耐药性提高了 3.3 倍。选择这些突变是因为它们能够提供对其他药效团的耐药性，并且是功能上重要的残基（5, 24, 25）。由于AU1235的MIC值变化小于2倍，我们得以像之前一样，在固体培养基上以5倍MIC浓度分离出耐药突变株。我们再次假设，如果其他靶点发生突变，那么这些分离出的耐药突变株不会在MmpL3中出现突变。然而，对9株菌株（3株来自LP-0334448-RM102菌株，6株来自LP-0334448-RM107菌株）的测序结果表明，所有菌株在F644位点均存在额外的突变，即F644L或F644I（表3），并且对AU1235具有高度耐药性（MIC值分别变化16倍和100倍）。这些菌株也对SQ109存在交叉耐药性，但程度较低（分别为5倍和6.7倍）。 F644L突变并未导致对结构相关的螺旋胺（即IDR-0541243）的耐药性增加，而F644I突变则使耐药性提高了7倍（表3）。这与F644位点的预测功能重要性以及多个药效团对该位点的靶向作用相符。[1]

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总之，在表达mmpL3-G253E的结核分枝杆菌细胞中AU1235的积累量未发生改变，且mmpL3表达降低模拟了用AU1235处理分枝杆菌的表型效应，这些事实驳斥了MmpL3作为金刚烷基脲外排泵的假设，并证实该转运蛋白是我们原型抑制剂的直接靶点。[2]

C17H19F3N2O

324.3408

324.144

C, 62.95; H, 5.90; F, 17.57; N, 8.64; O, 4.93

1338780-86-1

941678-49-5;

54752297

Solid powder

3.9

41.1

2

4

2

23

445

0

FRRHMLGKNPFRKT-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H19F3N2O/c18-12-1-2-13(15(20)14(12)19)21-17(23)22-16-10-4-8-3-9(6-10)7-11(16)5-8/h1-2,8-11,16H,3-7H2,(H2,21,22,23)

1-(2-Adamantyl)-3-(2,3,4-trifluorophenyl)urea

AU1235; AU-1235; AU1235; 1338780-86-1; 1-(1-adamantyl)-3-(2,3,4-trifluorophenyl)urea; CHEMBL1818385; SCHEMBL18423981; SCHEMBL18464994; SCHEMBL18464996; AU 1235

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

Ethanol : ~65 mg/mL
DMSO : 10~25 mg/mL ( 30.83~77.08 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.71 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 10% DMSO+90% (20% SBE-β-CD in Saline): ≥ 2.5 mg/mL (7.71 mM)

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。