IL-6; IL-10; IL-17A
The compound targets the interaction between the T cell receptor (TCR) and the adaptor protein Nck. Specifically, it binds to a non-canonical "DY pocket" in the SH3.1 domain of Nck (Nck1 or Nck2), inhibiting the recruitment of Nck to the proline-rich sequence (PRS) in the cytoplasmic tail of the CD3ε subunit of the TCR [1].

与先导化合物AX-000相比，盐酸AX-024在抑制TCR触发的T细胞增殖方面效力高出10,000倍以上。盐酸AX-024在浓度低于1 pM时即可发挥抑制作用，但其在本实验中的IC50值为1 nM。在10 nM浓度下，盐酸AX-024作为抗CD3刺激的人外周血单核细胞细胞因子释放抑制剂，其抑制效果显著优于AX-000，并能显著降低白细胞介素-6 (IL-6)、肿瘤坏死因子-α (TNFα)、干扰素-γ (IFN-γ)、IL-10和IL-17A的产生。在携带野生型 (WT) CD8+ T 细胞的小鼠中，浓度为 0.1 nM 的 AX-024 盐酸盐可强烈抑制携带 PRS 突变的 OT1Tg T 细胞的增殖。在这些细胞中，共免疫沉淀实验表明，在没有药物的情况下，刺激可诱导 Nck 募集至 TCR，但在 AX-024 盐酸盐存在的情况下，从 1 nM 开始，Nck 募集以剂量依赖的方式受到抑制[1]。

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抑制 T 细胞增殖：AX-024 HCl选择性抑制 TCR 触发的 T 细胞增殖。在用抗 CD3 抗体刺激的人外周血 T 细胞中，其 IC50（半数抑制浓度）约为 1 nM。即使浓度高达 10 μM，该化合物也不会抑制抗 IgM（BCR 刺激）、LPS（TLR4 激动剂）或抗 CD40 加 IL-4 诱导的 B 细胞增殖。即使浓度高达 10 μM，该化合物也不会抑制 IL-2 依赖的 T 细胞淋巴母细胞增殖或 PMA 加离子霉素（可绕过 TCR 信号通路）诱导的 T 细胞增殖 [1]。
对 TCR 信号通路的作用机制：该化合物抑制早期 TCR 近端事件。通过鬼笔环肽染色检测，该化合物可阻断抗 CD3 刺激的人外周血 T 细胞中 TCR 触发的肌动蛋白聚合。它还能抑制ZAP70在Tyr319位点的磷酸化，并部分抑制抗CD3抗体刺激的Jurkat T细胞中CD3ζ链（Tyr142）的磷酸化[1]。
靶向特异性确认：在使用GST融合蛋白的下拉实验中，AX-024 HCl以浓度依赖的方式抑制刺激的Jurkat T细胞裂解液中的CD3ζ与GST-Nck(SH3.1)蛋白的结合。它不抑制CD3与Eps8L1的SH3结构域的结合，也不抑制c-Cbl与Nck(SH3.1)结构域的结合。在OT1 TCR转基因小鼠T细胞中，该化合物（浓度为0.1 nM）能强烈抑制野生型细胞的抗原依赖性增殖，但对PRS敲入小鼠（KI-PRS）的T细胞没有额外的抑制作用，这些小鼠的种系突变阻止了Nck募集到TCR。表面等离子共振（SPR）分析表明，该化合物改变了CD3ε PRS肽与Nck1(SH3.1)结构域的结合动力学，提高了解离常数（KD）[1]。
对T细胞分化的影响：在极化条件下，使用初始人CD4+ T细胞进行的体外分化实验表明，AX-024 HCl（1-100 nM）抑制其分化为促炎亚群。在Th1条件下，AX-024可降低IFN-γ+和IL-2+细胞的比例；在Th2条件下，可降低IL-4+细胞的比例；在Th17条件下，可降低IL-17A+细胞的比例。相反，在Treg极化条件下，AX-024可促进Treg向FOXP3+调节性T细胞（Treg）的分化。在1 nM AX-024存在下分化的Treg表现出增强的抑制功能，比未使用该化合物分化的Treg更有效地抑制初始CD4+ T细胞的增殖[1]。基因表达分析：对纯化的人外周血T细胞在1 nM AX-024 HCl存在下用抗CD3刺激4小时后进行微阵列分析，结果显示基因表达发生显著变化。预计与辅助性T细胞分化、IL-15信号通路和细胞因子信号通路（例如IL-3、干扰素）相关的通路会发生改变。上游调控因子分析预测TCR/CD3和CD28信号通路受到抑制[1]。

与对照组相比，AX-024盐酸盐治疗组的鳞屑较少，皮肤增厚程度也减轻。AX-024盐酸盐能显著降低皮肤两层的厚度，尤其对真皮层效果最佳，其皮肤状况与使用不含咪喹莫特（IMQ）的对照乳膏治疗的小鼠相似。在两项试验中，AX-024盐酸盐均能显著减少气道内的炎症细胞数量。与接受载体的小鼠相比，接受 AX-024 盐酸盐的小鼠出现持续性共济失调和翻正反射丧失，神经功能障碍和体重减轻迅速恢复，并在第 30 天时症状消失[1]。

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银屑病模型：在咪喹莫特 (IMQ) 诱导的银屑病小鼠模型中，在免疫后第 0、2、4 和 6 天腹腔注射 AX-024 HCl（50 mg/kg 生理盐水）可显著降低临床严重程度评分（耳部增厚、鳞屑和发红），与接受载体治疗的小鼠相比。它还能减少皮肤中的细胞浸润（CD4+ T 细胞、中性粒细胞）和炎症细胞因子（IL-17A、IL-22、IFN-γ）的表达[1]。
过敏性哮喘模型：在卵清蛋白 (OVA) 诱导的过敏性哮喘小鼠模型中，于第 0 天和第 5 天（OVA 致敏前 2 小时）腹腔注射 AX-024 HCl（50 mg/kg，溶于生理盐水）可抑制炎症细胞浸润气道。这可通过 OVA 激发后 24 小时荧光分子断层扫描 (FMT) 成像中 ProSense 680 信号的降低来证实。它还能显著降低卵清蛋白 (OVA) 攻击后 48 小时支气管肺泡灌洗液 (BALF) 中 Gr-1+CD11b+ 炎症细胞的数量以及细胞因子 IL-4、IL-5 和 IL-13 的水平 [1]。
实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 模型 - 预防：在慢性 MOG_35-55 诱导的 EAE 小鼠模型中，免疫后前 10 天每日口服 AX-024 HCl (10 mg/kg) 可显著延缓神经系统症状（临床评分）和体重减轻的发生，并减轻其严重程度。组织学分析显示，CD4+ T 细胞和 F4/80+ 巨噬细胞向小脑和脊髓的浸润减少[1]。
实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 模型 - 治疗：在治疗环境中，从疾病高峰期（第 13 天）开始，每天口服 AX-024 HCl（10 mg/kg），直至第 26 天，可迅速将临床评分降低至 0，与芬戈莫德（0.6 mg/kg）相当。重要的是，在第26天停药后，AX-024治疗组小鼠的临床评分仍为0，而芬戈莫德治疗组小鼠则出现快速且严重的复发[1]。
EAE模型机制：对经MOG免疫并口服AX-024 HCl（10 mg/kg/天，连续6天）的小鼠的引流淋巴结进行分析，结果显示，在神经系统症状出现之前，FOXP3⁺CD4⁺调节性T细胞和双阳性IFN-γ⁺FOXP3⁺细胞的百分比显著增加，而总IFN-γ⁺或IL-17⁺CD4⁺ T细胞的百分比没有显著变化[1]。
病毒感染模型：在感染鼠痘病毒（ECTV）的小鼠中，每日口服AX-024 HCl（10或40 mg/kg）不会增加感染易感性。所有接受AX-024治疗的小鼠在亚致死剂量ECTV感染后的存活率与接受载体治疗的小鼠相似。此外，在首次感染后存活下来的小鼠，无论之前是否接受过AX-024治疗，在60天后再次接受致死剂量ECTV感染时均能得到保护，这表明该化合物不会阻止保护性记忆T细胞反应的建立[1]。

表面等离子共振 (SPR) 检测：采用 SPR 技术表征化合物与 Nck1(SH3.1) 结构域的相互作用。将重组 GST-Nck1(SH3.1) 融合蛋白固定在传感器芯片上。以含有 CD3ε 富脯氨酸序列 (PRS) 的合成肽作为溶液中的分析物。在浓度递增的 AX-024 HCl (0、0.1、1、10 和 100 nM) 存在下，测定肽的结合和解离速率。结果表明，该化合物以浓度依赖的方式改变了结合动力学。例如，在 0.1 nM AX-024 浓度下，计算得到的 KD 值从 7.5×10⁻⁶ M（无药物）增加到 5.7×10⁻⁴ M [1]。
核磁共振 (NMR) 波谱：通过 NMR 证实了 AX-024 HCl 与 Nck1(SH3.1) 结构域的结合。用 AX-024 滴定 ¹⁵N 标记的 Nck1(SH3.1) 蛋白，导致 SH3.1 结构域“DY 口袋”中特定氨基酸残基（例如 W229、K230、R236、Y253、W254、Y257）的 ¹H-¹⁵N HSQC 谱中出现显著的化学位移扰动，证实了该位点的直接特异性结合 [1]。

Cell Trace Violet 用于标记 C57BL/6 小鼠的脾脏 B 细胞。然后将细胞与抗 IgM (10 mg/mL) 或抗 CD40 (5 mg/mL) 以及 IL-4 (5 ng/mL) 或 LPS (2.5 mg/mL) 在不同浓度的 AX-024 盐酸盐存在下孵育 72 小时。根据细胞分裂总数计算增殖[1]。

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人 T 细胞增殖实验：将新鲜的人外周血淋巴细胞 (PBL) 用 CFSE 标记，并在包被抗 CD3 抗体 (OKT3) 的 96 孔板中，于 37°C 下孵育 4 天，同时加入不同浓度的 AX-024 HCl。采用基于CFSE稀释的流式细胞术分析CD4+ T细胞的增殖，计算得出IC50约为1 nM。作为特异性对照，将CFSE标记的PBL在化合物存在下用PMA（10 ng/ml）和离子霉素（1 μM）刺激4天，结果显示，浓度高达10 μM时，增殖未受到抑制[1]。
IL-2依赖性T细胞增殖实验：用植物血凝素刺激PBL，然后在含IL-2的培养基中扩增，生成人T细胞淋巴母细胞。然后用CFSE标记这些淋巴母细胞，并在不同浓度的AX-024 HCl（或其母体化合物AX-000）存在下，用IL-2（100 ng/ml）刺激3天。采用流式细胞术分析增殖情况，在浓度高达 10 μM 时未观察到抑制作用 [1]。
小鼠 OT1 T 细胞增殖实验：将 OT1 TCR 转基因野生型 (WT) 或 PRS 敲入 (KI-PRS) 小鼠的淋巴结 T 细胞用 CellTrace Violet 标记。先用不同浓度的 AX-024 HCl 预孵育 1 小时，然后用负载不同 OVA 肽衍生物的骨髓来源树突状细胞刺激 3 天：弱激动剂 Q4H7 (10 nM) 或强激动剂 OVAp (100 pM)。通过染料稀释法分析增殖情况。该化合物在皮摩尔浓度下即可有效抑制 WT T 细胞对 Q4H7 的增殖反应，但需要更高的浓度才能抑制对更强激动剂的反应。它对KI-PRS T细胞未显示出额外的抑制作用[1]。
TCR信号通路Western Blot分析：将富集的人类T细胞或Jurkat细胞用可溶性抗CD3抗体（OKT3，10 μg/ml）刺激不同时间（例如5分钟），并加入或不加入AX-024 HCl（1 nM至10 μM）。制备核后裂解液，并用特异性抗体进行Western blot分析。该化合物抑制了ZAP70在Tyr319位的磷酸化，并部分抑制了CD3ζ在Tyr142位的磷酸化。在下拉实验中，将刺激或未刺激的Jurkat细胞的核后裂解液与GST-Nck(SH3.1)、GST-Eps8L1(SH3)或单独的GST以及不同浓度的AX-024一起孵育。通过蛋白质印迹法检测结合蛋白，结果表明AX-024特异性抑制CD3ζ与Nck(SH3.1)的结合[1]。
人CD4+ T细胞分化实验：将初始人CD4+ T细胞在0、1或100 nM AX-024 HCl存在下，用包被于培养板上的抗CD3抗体（5 μg/ml）和抗CD28抗体（5 μg/ml）激活3天，诱导不同的极化条件（Th1、Th2、Th17、Treg）。洗涤后，细胞在无刺激条件下继续培养两天。第5天，用PMA和离子霉素再次刺激细胞，并通过流式细胞术分析细胞内谱系特异性细胞因子和FOXP3的表达。结果显示，细胞从促炎亚群向Treg表型转变[1]。

急性毒性试验方案：** 将不同剂量的AX-024 HCl盐酸盐溶于0.5 ml生理盐水中，腹腔注射至8周龄CD-1小鼠体内。每天两次对动物进行临床观察，记录不良反应，持续14天。在第14天对每只动物进行尸检，检查腹腔、胸腔、颅腔及其相关器官[1]。
* **EAE模型方案（预防性）：** 通过皮下注射乳化于弗氏完全佐剂中的MOG_35-55，在雌性C57BL/6小鼠中诱导慢性EAE。从免疫当天开始，小鼠每天接受腹腔注射（或口服，具体剂量视情况而定）AX-024 HCl（例如，10 mg/kg，溶于PBS或生理盐水中），持续10天。由一位对治疗分组不知情的观察者每日监测临床评分和体重[1]。
* **EAE模型方案（治疗组）：** EAE的诱导方法如上所述。当超过50%的动物临床评分高于2分时（约第13天），开始治疗。从第13天到第26天，小鼠每日口服AX-024 HCl（10 mg/kg）或芬戈莫德（0.6 mg/kg）。每日监测临床评分和体重[1]。
* **银屑病模型方案（咪喹莫特诱导组）：** 通过在BALB/c小鼠剃毛后的背部和右耳上连续6天涂抹咪喹莫特乳膏，诱导银屑病样皮肤炎症。在第0、2、4和6天，腹腔注射AX-024 HCl（50 mg/kg，溶于生理盐水）。每日对疾病严重程度进行评分，并在研究结束时采集皮肤样本进行组织学和细胞因子分析[1]。* **哮喘模型方案（OVA诱导）：** 在第0、5和12天，通过腹腔注射明矾佐剂中的OVA对BALB/c小鼠进行致敏。在第0和5天，于OVA给药前2小时腹腔注射AX-024 HCl（50 mg/kg，溶于生理盐水）。在第12天，用雾化OVA溶液对小鼠进行激发。感染后24小时通过FMT成像评估肺部炎症，感染后48小时通过支气管肺泡灌洗液（BALF）分析评估肺部炎症[1]。
* **鼠痘病毒感染方案：** C57BL/6小鼠经鼻内感染不同剂量（10²至10⁵ PFU）的ECTV。感染后，小鼠每日口服AX-024 HCl（10或40 mg/kg）或载体，持续至感染后10天。监测小鼠存活情况。首次感染后存活的小鼠在60天后再次接受致死剂量（10⁵ PFU）的ECTV鼻内感染，不进行进一步治疗，以评估其记忆反应[1]。

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急性毒性方案：将不同剂量的AX-024盐酸盐溶于0.5 ml生理盐水中，腹腔注射到8周龄的CD-1小鼠体内。每天两次对动物进行临床观察，持续14天，以监测不良反应。在第14天对每只动物进行尸检，检查腹腔、胸腔、颅腔及其相关器官[1]。
EAE模型方案（预防性）：通过皮下注射乳化于弗氏完全佐剂中的MOG_35-55，在雌性C57BL/6小鼠中诱导慢性EAE。小鼠自免疫当日起连续10天，每日腹腔注射（或口服，具体方式见说明）AX-024 HCl（例如，10 mg/kg，溶于PBS或生理盐水）。由一位对分组情况不知情的观察者每日监测小鼠的临床评分和体重[1]。
EAE模型方案（治疗组）：EAE的诱导方法如上所述。当超过50%的动物临床评分高于2分时（约第13天），开始治疗。从第 13 天到第 26 天，小鼠每天口服 AX-024 HCl (10 mg/kg) 或芬戈莫德 (0.6 mg/kg)。每日监测临床评分和体重 [1]。
银屑病模型方案（咪喹莫特诱导）：通过在 BALB/c 小鼠剃毛后的背部和右耳上连续 6 天每天涂抹咪喹莫特乳膏，诱导银屑病样皮肤炎症。在第0、2、4和6天，腹腔注射AX-024 HCl（50 mg/kg，溶于生理盐水）。每日对疾病严重程度进行评分，并在研究结束时采集皮肤样本进行组织学和细胞因子分析[1]。
哮喘模型方案（OVA诱导）：在第0、5和12天，通过腹腔注射明矾佐剂中的OVA对BALB/c小鼠进行致敏。在第0和5天，于OVA给药前2小时腹腔注射AX-024 HCl（50 mg/kg，溶于生理盐水）。在第12天，用雾化OVA溶液对小鼠进行激发。感染后24小时通过FMT成像评估肺部炎症，感染后48小时通过支气管肺泡灌洗液（BALF）分析评估肺部炎症[1]。
鼠痘病毒感染方案：C57BL/6小鼠经鼻内感染不同剂量（10²至10⁵ PFU）的ECTV。感染后，小鼠每日口服AX-024 HCl（10或40 mg/kg）或载体，持续至感染后10天。监测小鼠存活情况。首次感染后存活的小鼠在60天后再次经鼻内感染致死剂量（10⁵ PFU）的ECTV，不再进行任何治疗，以评估记忆反应[1]。

AX-024 HCl 被描述为一种口服有效的低分子量抑制剂[1]。

啮齿动物急性毒性：在急性毒性研究中，对CD-1小鼠单次腹腔注射剂量高达1600 mg/kg的AX-024 HCl，在14天的观察期内未观察到任何肉眼可见的不良反应或死亡。第14天的尸检显示腹腔、胸腔或颅腔均无异常。据报道，该化合物具有较低的急性毒性[1]。
对胸腺细胞分化的影响：对4周龄小鼠连续10天给予AX-024 HCl，未对胸腺细胞亚群数量产生显著影响，表明其不会严重影响胸腺分化[1]。

[1]. First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases. Sci Transl Med. 2016 Dec 21;8(370):370ra184.

AX-024 HCl是一种首创的口服小分子抑制剂，靶向T细胞受体（TCR）与衔接蛋白Nck之间的蛋白-蛋白相互作用，具体而言，是通过与SH3结构域结合发挥作用。它选择性地调节TCR信号传导，抑制弱抗原（例如自身抗原）激活T细胞，但不抑制强抗原（例如病原体来源抗原）激活T细胞。这种选择性使其能够在动物模型中预防和治疗自身免疫性疾病（银屑病、哮喘、多发性硬化症），而不会引起全身免疫抑制或增加病毒感染的易感性。该化合物促进T细胞向抗炎调节性T细胞（Treg）表型分化。研究用药品档案已获批准，并且已开展了Ia/Ib期临床试验（NCT02243683，NCT02546635）[1]。

C21H23CLFNO2

375.864228487015

375.14

C, 67.11; H, 6.17; Cl, 9.43; F, 5.05; N, 3.73; O, 8.51

1704801-24-0

AX-024;1370544-73-2

129909862

White to off-white solid powder

21.7

1

4

4

26

480

0

COC1=CC2=C(C=C1)OCC(=C2C3=CC=C(C=C3)F)CN4CCCC4.Cl

DGBCIMPGYRVTPD-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C21H22FNO2.ClH/c1-24-18-8-9-20-19(12-18)21(15-4-6-17(22)7-5-15)16(14-25-20)13-23-10-2-3-11-23;/h4-9,12H,2-3,10-11,13-14H2,1H3;1H

1-[[4-(4-fluorophenyl)-6-methoxy-2H-chromen-3-yl]methyl]pyrrolidine;hydrochloride

AX-024 hydrochloride; AX-024; AX 024; AX024 HCl

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~75 mg/mL (~199.5 mM)
Water: ~4 mg/mL (~10.6 mM)
Ethanol: ~18 mg/mL (~47.9 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.65 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。