| 规格 | 价格 | 库存 | 数量 |
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| 10 mM * 1 mL in DMSO |
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| 1mg |
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| 5mg |
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| 10mg |
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| 25mg |
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| 50mg |
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| 100mg |
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| 250mg |
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| 500mg |
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| Other Sizes |
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| 靶点 |
ATR ( IC50 = 5 nM ); mTOR ( IC50 = 38 nM ); PI3Kα ( IC50 = 13000 nM )
ATR kinase (IC50 = 16 nM, determined by in vitro kinase activity assay); no significant inhibition on ATM (IC50 > 10 μM), DNA-PKcs (IC50 > 10 μM), or other 45 tested kinases (IC50 > 1 μM), showing high selectivity for ATR [2] |
|---|---|
| 体外研究 (In Vitro) |
体外活性：AZ20 对所有 PI3K 亚型以及 ATM 和 DNA-PK 均表现出良好的选择性。在体外，AZ20 以浓度依赖性方式降低 pChk1 Ser345、pChk1 Ser317 和 pChk1 Ser296 水平。长时间暴露于 AZ20 会增加 γH2AX 泛核染色，表明存在复制应激。这与 S 期停滞和磷酸组蛋白 H3 的增加有关。 AZ20 在体外诱导生长抑制和细胞死亡，其活性特征与其他细胞毒剂不同。 AZ20与选择性ATM抑制剂KU-60019联合使用可增强细胞毒作用。激酶测定：用于体外酶测定的 ATR 通过免疫沉淀从 HeLa 核提取物中获得，用兔多克隆抗血清提高到 ATR 氨基酸 400 ~ 480，包含在以下缓冲液中：25 mM HEPES (pH 7.4)、2 mM MgCl2 、250 mM NaCl、0.5 mM EDTA、0.1 mM Na3VO4、10% v/v 甘油和 0.01% v/v Tween 20。通过与 Protein A-Sepharose 珠一起孵育 1 小时，从核提取物中分离出 ATR-抗体复合物。然后通过离心回收珠子。在 96 孔板的孔中，将 10 μL 含有 ATR 的琼脂糖珠与 1 μg 底物谷胱甘肽 S-转移酶-p53N66 在 ATR 测定缓冲液（50 mM HEPES (pH 7.4)、150 mM NaCl、6 mM MgCl2）中孵育、4 mM MnCl2、0.1 mM Na3VO4、0.1 mM DTT 和 10% (v/v) 甘油），37°C，存在或不存在抑制剂。轻轻摇动 10 分钟后，添加 ATP 至终浓度 3 μM，反应在 37°C 下再继续 1 小时。通过添加 100 μL PBS 终止反应，并将反应转移至白色不透明谷胱甘肽包被的 96 孔板中，并在 4°C 下孵育过夜。然后用 PBS/0.05% (v/v) Tween 20 洗涤该板，吸干，并使用磷酸丝氨酸 15 p53 抗体通过标准 ELISA 技术进行分析。磷酸化谷胱甘肽S-转移酶βp53N66底物的检测是与山羊抗小鼠辣根过氧化物酶缀合的二抗组合进行的。使用增强化学发光溶液产生信号，并通过 TopCount 读板器进行化学发光检测。然后使用所得的计算％酶活性来确定化合物的IC50值。细胞测定：AZ20抑制BT-474细胞中的pAKT T308，并抑制HT29细胞中的pATM Ser-1981和pDNA-PK Ser-2056。在 LoVo 结直肠腺癌细胞中，AZ20 诱导生长抑制，GI50 值为 0.20 μM。
激酶活性抑制：AZ20 可强效抑制重组ATR-ATRIP复合物活性，IC50为16 nM。对ATM（IC50 > 10 μM）、DNA-PKcs（IC50 > 10 μM）及45种其他激酶（IC50 > 1 μM）无显著抑制，证实其高靶点选择性 [2] - 癌细胞增殖抑制：AZ20 以剂量依赖性方式抑制多种人癌细胞系增殖。MTT法检测72小时处理后的IC50值为：HCT116（结直肠癌细胞，0.8 μM）、A549（肺癌细胞，1.2 μM）、MCF-7（乳腺癌细胞，1.5 μM）、U2OS（骨肉瘤细胞，0.9 μM） [2] - ATR下游信号抑制：Western blot分析显示，AZ20（0.5-2 μM，处理24小时）可降低HCT116细胞中ATR下游底物的磷酸化水平，包括Chk1（Ser345）、RPA32（Ser4/8）及H2AX（Ser139，γH2AX）；而总Chk1、RPA32、H2AX水平无变化，表明其特异性抑制ATR介导的磷酸化 [2] - 克隆形成抑制：AZ20（0.25-1 μM）可降低HCT116细胞的克隆形成能力。1 μM浓度下，克隆数较溶剂对照组减少约70%（培养14天后经结晶紫染色并计数克隆） [2] |
| 体内研究 (In Vivo) |
携带LoVo肿瘤的雌性裸鼠口服AZ20，剂量为25 mg/kg，每日两次或50 mg/kg，每日一次，持续13天，导致显着的肿瘤生长抑制。这与异种移植组织中 γH2AX 全核染色的持续升高有关，但在治疗剂量下小鼠骨髓中的短暂增加，表明有利的治疗指数。评估 AZ20 的药物相互作用 (DDI) 潜力，特别是通过抑制细胞色素 P450 酶。研究发现，10 μM 的 AZ20 可抑制细胞色素 3A4 介导的咪达唑仑代谢达 50%。在低剂量大鼠 PK 研究中，AZ20 具有良好的生物利用度。
异种移植模型抗肿瘤疗效：裸鼠（BALB/c nu/nu）皮下接种HCT116细胞，待肿瘤体积达~100 mm³后，分别给予AZ20（50 mg/kg，腹腔注射，每日1次，连续14天）或溶剂处理。AZ20 显著抑制肿瘤生长：第14天，AZ20 处理组平均肿瘤体积约为450 mm³，而溶剂组约为900 mm³（每2天用卡尺测量肿瘤体积，计算公式：体积=长×宽²/2） [2] - 体内安全性：AZ20 处理组小鼠无显著体重下降（较基线变化<5%），主要器官（肝、肾、脾）无明显病理改变；血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平处于正常范围，提示无明显肝毒性 [2] |
| 酶活实验 |
为了获得用于体外酶测定的 ATR，从 HeLa 核提取物中免疫沉淀了 ATR 氨基酸 400-480 的兔多克隆抗血清。该缓冲区包含 ATR。将 pH 7.4、250 mM NaCl、0.5 mM EDTA、0.1 mM Na3VO4、10% v/v 甘油和 0.01% v/v Tween 20 混合以制备 25 mM HEPES (pH 7.4)。将 Protein A-Sepharose 珠子与来自核提取物的 ATR-抗体复合物一起孵育 1 小时，然后通过离心回收珠子。将 ATR 测定缓冲液（50 mM HEPES (pH 7.4)、150 mM NaCl、6 mM MgCl2、4 mM MnCl2、0.1 mM Na3VO4、0.1 mM DTT 和 10% (v/v) 甘油）与 1 μg 底物谷胱甘肽一起孵育S-转移酶-p53N66 在 96 孔板的孔中。这是在存在或不存在抑制剂的情况下进行的。适度摇动 10 分钟后，反应在 37°C 下再进行一小时，在此期间添加 ATP 至终浓度为 3 μM。使用涂有白色不透明谷胱甘肽的 96 孔板转移反应物并在 4°C 下孵育过夜。加入100μL PBS终止反应。用 PBS/0.05% (v/v) Tween 20 洗涤后，将该板吸干并使用磷酸丝氨酸 15 p53 抗体进行 ELISA 分析。利用与山羊抗小鼠辣根过氧化物酶缀合的二抗，检测磷酸化谷胱甘肽S-转移酶p53N66底物。使用增强化学发光溶液产生信号后，使用 TopCount 读板器进行化学发光检测。然后使用计算所得的酶活性百分比计算化合物的IC50值。
ATR激酶活性实验： 1. 制备反应体系：将重组ATR-ATRIP复合物（0.2 μg）、GST-RPA32（1-120）底物（1 μg）、ATP（50 μM）及激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl2、1 mM DTT、0.1 mg/mL BSA）混合，总体积30 μL。 2. 向体系中加入AZ20（系列浓度：0.1 nM-10 μM）或溶剂（DMSO），30°C孵育60分钟。 3. 加入4×SDS上样缓冲液（10 μL）终止反应，95°C煮沸5分钟。 4. 进行12% SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，用5%脱脂牛奶室温封闭1小时。 5. 加入抗磷酸化RPA32（Ser4/8）一抗，4°C孵育过夜；次日加入HRP标记二抗，室温孵育1小时。 6. 化学发光法检测信号，ImageJ定量条带强度；通过GraphPad Prism拟合剂量-效应曲线计算IC50 [2] |
| 细胞实验 |
使用 Labcyte Echo 声学分配装置，通过在 100% DMSO 中稀释，然后进一步加入测定介质（EMEM、10% FCS、1% 谷氨酰胺）中来创建化合物剂量范围。细胞板在 40 μL EMEM、10% FCS 和 1% 谷氨酰胺中生长 24 小时。将细胞以每 mL 9×104 细胞铺板于 384 孔 Costar 板中。添加化合物后，将细胞孵育六十分钟。使用 Labcyte Echo，添加终浓度 3 μM 4NQO（在 100% DMSO 中制备），并将细胞再孵育 60 分钟。向细胞中添加 40 μL 3.7% v/v 甲醛溶液，固定细胞 20 分钟。从细胞中除去固定物，然后将其在含有 0.1% Triton X-100 的 40 μL PBS 中透化，并用 PBS 清洗。洗涤后，将 15 μL pChk1 Ser345 一抗溶液添加到细胞中。将托盘在 4°C 下孵育整夜。消除一抗后，加入 20 μL 二抗溶液和 1 μM Hoechst 33258，并在室温下静置 90 分钟。清洗后，将板置于 40 μL PBS 中。之后，使用 ArrayScan VTI 仪器测量板上的染色强度。然后收集剂量反应并用于计算化合物的 IC50 值。
细胞增殖实验（MTT法）： 1. 将癌细胞（HCT116/A549/MCF-7/U2OS）以3×10³个/孔接种于96孔板，37°C、5% CO₂孵育过夜。 2. 加入AZ20（系列浓度：0.1 μM-10 μM）或溶剂（DMSO，终浓度0.1%），孵育72小时。 3. 每孔加入MTT试剂（10 μL/孔，5 mg/mL PBS溶液），孵育4小时。 4. 吸除上清，加入DMSO（150 μL/孔）溶解甲瓒结晶，振荡10分钟。 5. 酶标仪检测570 nm处吸光度，计算细胞活力：（处理组吸光度/对照组吸光度）×100%；通过剂量-效应曲线拟合IC50 [2] - ATR下游信号Western blot实验： 1. 将HCT116细胞以2×10⁵个/孔接种于6孔板，孵育过夜。 2. 用AZ20（0.5 μM、1 μM、2 μM）或溶剂处理24小时。 3. 收集细胞，冷PBS洗涤，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液，冰上裂解30分钟。 4. 4°C、12,000 × g离心15分钟，收集上清（总蛋白）。 5. BCA法测定蛋白浓度，用上样缓冲液调整至等浓度。 6. 进行10% SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1小时。 7. 加入一抗（抗p-Chk1 Ser345、抗Chk1、抗p-RPA32 Ser4/8、抗RPA32、抗γH2AX、抗β-actin），4°C孵育过夜；次日加入HRP标记二抗，室温孵育1小时。 8. ECL试剂检测信号，ImageJ成像并定量 [2] - 克隆形成实验： 1. 将HCT116细胞以500个/孔接种于6孔板，孵育过夜。 2. 用AZ20（0.25 μM、0.5 μM、1 μM）或溶剂处理24小时后，更换为不含AZ20的新鲜培养基。 3. 37°C、5% CO₂孵育14天，待克隆形成。 4. 4%多聚甲醛固定15分钟，0.1%结晶紫染色30分钟，水洗后晾干。 5. 计数克隆（每个克隆≥50个细胞），计算存活率：（处理组克隆数/对照组克隆数）×100% [2] |
| 动物实验 |
Negative pressure isolators are used to house female Swiss nu/nu mice. To create LoVo tumor xenografts, 8–12 week old mice are given a subcutaneous injection of 1×107 tumor cells (100 μL in serum-free medium) in the left dorsal flank. When tumors are palpable, animals are randomly assigned to treatment groups. AZ20 is taken orally and is prepared in a 10% DMSO/40% propylene glycol/50% water solution. Calipers are used to measure tumors up to three times a week. Plotting the data using the geometric mean for each group against time yields the tumor volumes.
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| 毒性/毒理 (Toxicokinetics/TK) |
体外对正常细胞的毒性：AZ20 对正常人包皮成纤维细胞 (HFF) 的毒性较低，IC50 > 10 μM（MTT 法，处理 72 小时），显著高于癌细胞系的 IC50 值。[2] 体内安全性：在 HCT116 异种移植模型中，AZ20（50 mg/kg，腹腔注射，14 天）未引起明显的体重下降（平均体重变化：-2.3% vs. 载体组的 +1.5%），且肝脏、肾脏和脾脏未见明显的组织学异常（组织切片 H&E 染色）。[2] 血清生化指标：血清 ALT 水平（28 ± 5 U/L vs. 载体组的 25 ± 4 U/L）和 AST 水平（45 ± 6 U/L vs. 载体组的 42 ± 5 U/L）均低于载体组。接受AZ20治疗的小鼠中，载体组）的各项指标均在正常范围内，表明未出现肝毒性
[2] |
| 参考文献 | |
| 其他信息 |
(3R)-4-[2-(1H-吲哚-4-基)-6-(1-甲基磺酰基环丙基)-4-嘧啶基]-3-甲基吗啉属于吲哚类化合物。
作用机制：AZ20是一种选择性ATR激酶抑制剂。ATR是DNA损伤反应（DDR）通路的关键调节因子；当DNA复制受到压力或损伤时，ATR会磷酸化下游底物（Chk1、RPA32、H2AX），从而激活细胞周期检查点并促进DNA修复。AZ20阻断ATR介导的DDR，导致DNA损伤无法修复、细胞周期阻滞，最终导致癌细胞死亡。 [2] - 抗肿瘤活性原理：癌细胞通常存在ATM或p53通路缺陷，使其更加依赖ATR进行DDR。 AZ20选择性地靶向这种依赖性，从而优先杀死癌细胞，同时不损伤正常细胞。 [2] |
| 分子式 |
C21H24N4O3S
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|---|---|---|
| 分子量 |
412.51
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| 精确质量 |
412.156
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| 元素分析 |
C, 61.14; H, 5.86; N, 13.58; O, 11.64; S, 7.77
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| CAS号 |
1233339-22-4
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| 相关CAS号 |
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| PubChem CID |
46244454
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| 外观&性状 |
White solid powder
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| 密度 |
1.4±0.1 g/cm3
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| 沸点 |
634.6±55.0 °C at 760 mmHg
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|
| 闪点 |
337.6±31.5 °C
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| 蒸汽压 |
0.0±1.9 mmHg at 25°C
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| 折射率 |
1.687
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| LogP |
0.5
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| tPSA |
93.13
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| 氢键供体(HBD)数目 |
1
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| 氢键受体(HBA)数目 |
6
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| 可旋转键数目(RBC) |
4
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| 重原子数目 |
29
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| 分子复杂度/Complexity |
707
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| 定义原子立体中心数目 |
1
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| SMILES |
S(C([H])([H])[H])(C1(C2=C([H])C(=NC(C3C([H])=C([H])C([H])=C4C=3C([H])=C([H])N4[H])=N2)N2C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])[C@@]2([H])C([H])([H])[H])C([H])([H])C1([H])[H])(=O)=O
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| InChi Key |
SCGCBAAYLFTIJU-CQSZACIVSA-N
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| InChi Code |
InChI=1S/C21H24N4O3S/c1-14-13-28-11-10-25(14)19-12-18(21(7-8-21)29(2,26)27)23-20(24-19)16-4-3-5-17-15(16)6-9-22-17/h3-6,9,12,14,22H,7-8,10-11,13H2,1-2H3/t14-/m1/s1
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| 化学名 |
(3R)-4-[2-(1H-indol-4-yl)-6-(1-methylsulfonylcyclopropyl)pyrimidin-4-yl]-3-methylmorpholine
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| 别名 |
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| HS Tariff Code |
2934.99.9001
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| 存储方式 |
Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month |
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| 运输条件 |
Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)
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| 溶解度 (体外实验) |
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|---|---|---|---|---|
| 溶解度 (体内实验) |
配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.06 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。 *生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。 配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.06 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。 例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。 *20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。 请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。 |
| 制备储备液 | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 2.4242 mL | 12.1209 mL | 24.2418 mL | |
| 5 mM | 0.4848 mL | 2.4242 mL | 4.8484 mL | |
| 10 mM | 0.2424 mL | 1.2121 mL | 2.4242 mL |
1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;
2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;
3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;
4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。
计算结果:
工作液浓度： mg/mL；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH2O，混匀澄清。
(1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。
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ATR-IN-32
ATR kinase-IN-2
ATR kinase-IN-3
CA-M11
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