AZ20

ATR ( IC50 = 5 nM ); mTOR ( IC50 = 38 nM ); PI3Kα ( IC50 = 13000 nM )
ATR kinase (IC50 = 16 nM, determined by in vitro kinase activity assay); no significant inhibition on ATM (IC50 > 10 μM), DNA-PKcs (IC50 > 10 μM), or other 45 tested kinases (IC50 > 1 μM), showing high selectivity for ATR
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体外活性：AZ20 对所有 PI3K 亚型以及 ATM 和 DNA-PK 均表现出良好的选择性。在体外，AZ20 以浓度依赖性方式降低 pChk1 Ser345、pChk1 Ser317 和 pChk1 Ser296 水平。长时间暴露于 AZ20 会增加 γH2AX 泛核染色，表明存在复制应激。这与 S 期停滞和磷酸组蛋白 H3 的增加有关。 AZ20 在体外诱导生长抑制和细胞死亡，其活性特征与其他细胞毒剂不同。 AZ20与选择性ATM抑制剂KU-60019联合使用可增强细胞毒作用。激酶测定：用于体外酶测定的 ATR 通过免疫沉淀从 HeLa 核提取物中获得，用兔多克隆抗血清提高到 ATR 氨基酸 400 ~ 480，包含在以下缓冲液中：25 mM HEPES (pH 7.4)、2 mM MgCl2 、250 mM NaCl、0.5 mM EDTA、0.1 mM Na3VO4、10% v/v 甘油和 0.01% v/v Tween 20。通过与 Protein A-Sepharose 珠一起孵育 1 小时，从核提取物中分离出 ATR-抗体复合物。然后通过离心回收珠子。在 96 孔板的孔中，将 10 μL 含有 ATR 的琼脂糖珠与 1 μg 底物谷胱甘肽 S-转移酶-p53N66 在 ATR 测定缓冲液（50 mM HEPES (pH 7.4)、150 mM NaCl、6 mM MgCl2）中孵育、4 mM MnCl2、0.1 mM Na3VO4、0.1 mM DTT 和 10% (v/v) 甘油），37°C，存在或不存在抑制剂。轻轻摇动 10 分钟后，添加 ATP 至终浓度 3 μM，反应在 37°C 下再继续 1 小时。通过添加 100 μL PBS 终止反应，并将反应转移至白色不透明谷胱甘肽包被的 96 孔板中，并在 4°C 下孵育过夜。然后用 PBS/0.05% (v/v) Tween 20 洗涤该板，吸干，并使用磷酸丝氨酸 15 p53 抗体通过标准 ELISA 技术进行分析。磷酸化谷胱甘肽S-转移酶βp53N66底物的检测是与山羊抗小鼠辣根过氧化物酶缀合的二抗组合进行的。使用增强化学发光溶液产生信号，并通过 TopCount 读板器进行化学发光检测。然后使用所得的计算％酶活性来确定化合物的IC50值。细胞测定：AZ20抑制BT-474细胞中的pAKT T308，并抑制HT29细胞中的pATM Ser-1981和pDNA-PK Ser-2056。在 LoVo 结直肠腺癌细胞中，AZ20 诱导生长抑制，GI50 值为 0.20 μM。

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激酶活性抑制：AZ20 可强效抑制重组ATR-ATRIP复合物活性，IC50为16 nM。对ATM（IC50 > 10 μM）、DNA-PKcs（IC50 > 10 μM）及45种其他激酶（IC50 > 1 μM）无显著抑制，证实其高靶点选择性
[2]
- 癌细胞增殖抑制：AZ20 以剂量依赖性方式抑制多种人癌细胞系增殖。MTT法检测72小时处理后的IC50值为：HCT116（结直肠癌细胞，0.8 μM）、A549（肺癌细胞，1.2 μM）、MCF-7（乳腺癌细胞，1.5 μM）、U2OS（骨肉瘤细胞，0.9 μM）
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- ATR下游信号抑制：Western blot分析显示，AZ20（0.5-2 μM，处理24小时）可降低HCT116细胞中ATR下游底物的磷酸化水平，包括Chk1（Ser345）、RPA32（Ser4/8）及H2AX（Ser139，γH2AX）；而总Chk1、RPA32、H2AX水平无变化，表明其特异性抑制ATR介导的磷酸化
[2]
- 克隆形成抑制：AZ20（0.25-1 μM）可降低HCT116细胞的克隆形成能力。1 μM浓度下，克隆数较溶剂对照组减少约70%（培养14天后经结晶紫染色并计数克隆）
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携带LoVo肿瘤的雌性裸鼠口服AZ20，剂量为25 mg/kg，每日两次或50 mg/kg，每日一次，持续13天，导致显着的肿瘤生长抑制。这与异种移植组织中 γH2AX 全核染色的持续升高有关，但在治疗剂量下小鼠骨髓中的短暂增加，表明有利的治疗指数。评估 AZ20 的药物相互作用 (DDI) 潜力，特别是通过抑制细胞色素 P450 酶。研究发现，10 μM 的 AZ20 可抑制细胞色素 3A4 介导的咪达唑仑代谢达 50%。在低剂量大鼠 PK 研究中，AZ20 具有良好的生物利用度。

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异种移植模型抗肿瘤疗效：裸鼠（BALB/c nu/nu）皮下接种HCT116细胞，待肿瘤体积达~100 mm³后，分别给予AZ20（50 mg/kg，腹腔注射，每日1次，连续14天）或溶剂处理。AZ20 显著抑制肿瘤生长：第14天，AZ20 处理组平均肿瘤体积约为450 mm³，而溶剂组约为900 mm³（每2天用卡尺测量肿瘤体积，计算公式：体积=长×宽²/2）
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- 体内安全性：AZ20 处理组小鼠无显著体重下降（较基线变化<5%），主要器官（肝、肾、脾）无明显病理改变；血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平处于正常范围，提示无明显肝毒性
[2]

为了获得用于体外酶测定的 ATR，从 HeLa 核提取物中免疫沉淀了 ATR 氨基酸 400-480 的兔多克隆抗血清。该缓冲区包含 ATR。将 pH 7.4、250 mM NaCl、0.5 mM EDTA、0.1 mM Na3VO4、10% v/v 甘油和 0.01% v/v Tween 20 混合以制备 25 mM HEPES (pH 7.4)。将 Protein A-Sepharose 珠子与来自核提取物的 ATR-抗体复合物一起孵育 1 小时，然后通过离心回收珠子。将 ATR 测定缓冲液（50 mM HEPES (pH 7.4)、150 mM NaCl、6 mM MgCl2、4 mM MnCl2、0.1 mM Na3VO4、0.1 mM DTT 和 10% (v/v) 甘油）与 1 μg 底物谷胱甘肽一起孵育S-转移酶-p53N66 在 96 孔板的孔中。这是在存在或不存在抑制剂的情况下进行的。适度摇动 10 分钟后，反应在 37°C 下再进行一小时，在此期间添加 ATP 至终浓度为 3 μM。使用涂有白色不透明谷胱甘肽的 96 孔板转移反应物并在 4°C 下孵育过夜。加入100μL PBS终止反应。用 PBS/0.05% (v/v) Tween 20 洗涤后，将该板吸干并使用磷酸丝氨酸 15 p53 抗体进行 ELISA 分析。利用与山羊抗小鼠辣根过氧化物酶缀合的二抗，检测磷酸化谷胱甘肽S-转移酶p53N66底物。使用增强化学发光溶液产生信号后，使用 TopCount 读板器进行化学发光检测。然后使用计算所得的酶活性百分比计算化合物的IC50值。

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ATR激酶活性实验：
1. 制备反应体系：将重组ATR-ATRIP复合物（0.2 μg）、GST-RPA32（1-120）底物（1 μg）、ATP（50 μM）及激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl2、1 mM DTT、0.1 mg/mL BSA）混合，总体积30 μL。
2. 向体系中加入AZ20（系列浓度：0.1 nM-10 μM）或溶剂（DMSO），30°C孵育60分钟。
3. 加入4×SDS上样缓冲液（10 μL）终止反应，95°C煮沸5分钟。
4. 进行12% SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，用5%脱脂牛奶室温封闭1小时。
5. 加入抗磷酸化RPA32（Ser4/8）一抗，4°C孵育过夜；次日加入HRP标记二抗，室温孵育1小时。
6. 化学发光法检测信号，ImageJ定量条带强度；通过GraphPad Prism拟合剂量-效应曲线计算IC50
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使用 Labcyte Echo 声学分配装置，通过在 100% DMSO 中稀释，然后进一步加入测定介质（EMEM、10% FCS、1% 谷氨酰胺）中来创建化合物剂量范围。细胞板在 40 μL EMEM、10% FCS 和 1% 谷氨酰胺中生长 24 小时。将细胞以每 mL 9×10⁴ 细胞铺板于 384 孔 Costar 板中。添加化合物后，将细胞孵育六十分钟。使用 Labcyte Echo，添加终浓度 3 μM 4NQO（在 100% DMSO 中制备），并将细胞再孵育 60 分钟。向细胞中添加 40 μL 3.7% v/v 甲醛溶液，固定细胞 20 分钟。从细胞中除去固定物，然后将其在含有 0.1% Triton X-100 的 40 μL PBS 中透化，并用 PBS 清洗。洗涤后，将 15 μL pChk1 Ser345 一抗溶液添加到细胞中。将托盘在 4°C 下孵育整夜。消除一抗后，加入 20 μL 二抗溶液和 1 μM Hoechst 33258，并在室温下静置 90 分钟。清洗后，将板置于 40 μL PBS 中。之后，使用 ArrayScan VTI 仪器测量板上的染色强度。然后收集剂量反应并用于计算化合物的 IC50 值。

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细胞增殖实验（MTT法）：
1. 将癌细胞（HCT116/A549/MCF-7/U2OS）以3×10³个/孔接种于96孔板，37°C、5% CO₂孵育过夜。
2. 加入AZ20（系列浓度：0.1 μM-10 μM）或溶剂（DMSO，终浓度0.1%），孵育72小时。
3. 每孔加入MTT试剂（10 μL/孔，5 mg/mL PBS溶液），孵育4小时。
4. 吸除上清，加入DMSO（150 μL/孔）溶解甲瓒结晶，振荡10分钟。
5. 酶标仪检测570 nm处吸光度，计算细胞活力：（处理组吸光度/对照组吸光度）×100%；通过剂量-效应曲线拟合IC50
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- ATR下游信号Western blot实验：
1. 将HCT116细胞以2×10⁵个/孔接种于6孔板，孵育过夜。
2. 用AZ20（0.5 μM、1 μM、2 μM）或溶剂处理24小时。
3. 收集细胞，冷PBS洗涤，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液，冰上裂解30分钟。
4. 4°C、12,000 × g离心15分钟，收集上清（总蛋白）。
5. BCA法测定蛋白浓度，用上样缓冲液调整至等浓度。
6. 进行10% SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1小时。
7. 加入一抗（抗p-Chk1 Ser345、抗Chk1、抗p-RPA32 Ser4/8、抗RPA32、抗γH2AX、抗β-actin），4°C孵育过夜；次日加入HRP标记二抗，室温孵育1小时。
8. ECL试剂检测信号，ImageJ成像并定量
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- 克隆形成实验：
1. 将HCT116细胞以500个/孔接种于6孔板，孵育过夜。
2. 用AZ20（0.25 μM、0.5 μM、1 μM）或溶剂处理24小时后，更换为不含AZ20的新鲜培养基。
3. 37°C、5% CO₂孵育14天，待克隆形成。
4. 4%多聚甲醛固定15分钟，0.1%结晶紫染色30分钟，水洗后晾干。
5. 计数克隆（每个克隆≥50个细胞），计算存活率：（处理组克隆数/对照组克隆数）×100%
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Negative pressure isolators are used to house female Swiss nu/nu mice. To create LoVo tumor xenografts, 8–12 week old mice are given a subcutaneous injection of 1×10⁷ tumor cells (100 μL in serum-free medium) in the left dorsal flank. When tumors are palpable, animals are randomly assigned to treatment groups. AZ20 is taken orally and is prepared in a 10% DMSO/40% propylene glycol/50% water solution. Calipers are used to measure tumors up to three times a week. Plotting the data using the geometric mean for each group against time yields the tumor volumes.

In vitro toxicity to normal cells: AZ20 showed low toxicity to normal human foreskin fibroblasts (HFFs), with an IC50 > 10 μM (MTT assay, 72 h treatment), significantly higher than IC50 values in cancer cell lines
[2]
- In vivo safety: In the HCT116 xenograft model, AZ20 (50 mg/kg, ip, 14 days) caused no significant body weight loss (mean weight change: -2.3% vs. +1.5% in vehicle group) and no obvious histological abnormalities in liver, kidney, and spleen (H&E staining of tissue sections)
[2]
- Serum biochemistry: Serum levels of ALT (28 ± 5 U/L vs. 25 ± 4 U/L in vehicle group) and AST (45 ± 6 U/L vs. 42 ± 5 U/L in vehicle group) in AZ20-treated mice were within normal ranges, indicating no hepatotoxicity
[2]

[1]. Cancer Res 2012;72(8 Suppl):Abstract nr 1823.

[2]. J Med Chem . 2013 Mar 14;56(5):2125-38.

(3R)-4-[2-(1H-indol-4-yl)-6-(1-methylsulfonylcyclopropyl)-4-pyrimidinyl]-3-methylmorpholine is a member of indoles.

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Mechanism of action: AZ20 is a selective ATR kinase inhibitor. ATR is a key regulator of the DNA damage response (DDR) pathway; upon DNA replication stress or damage, ATR phosphorylates downstream substrates (Chk1, RPA32, H2AX) to activate cell cycle checkpoints and promote DNA repair. AZ20 blocks ATR-mediated DDR, leading to unresolved DNA damage, cell cycle arrest, and ultimately cancer cell death
[2]
- Rationale for antitumor activity: Cancer cells often have defective ATM or p53 pathways, making them more dependent on ATR for DDR. AZ20 selectively targets this dependency, resulting in preferential killing of cancer cells while sparing normal cells
[2]

C21H24N4O3S

412.51

412.156

C, 61.14; H, 5.86; N, 13.58; O, 11.64; S, 7.77

1233339-22-4

46244454

White solid powder

1.4±0.1 g/cm3

634.6±55.0 °C at 760 mmHg

337.6±31.5 °C

0.0±1.9 mmHg at 25°C

1.687

0.5

93.13

1

6

4

29

707

1

S(C([H])([H])[H])(C1(C2=C([H])C(=NC(C3C([H])=C([H])C([H])=C4C=3C([H])=C([H])N4[H])=N2)N2C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])[C@@]2([H])C([H])([H])[H])C([H])([H])C1([H])[H])(=O)=O

SCGCBAAYLFTIJU-CQSZACIVSA-N

InChI=1S/C21H24N4O3S/c1-14-13-28-11-10-25(14)19-12-18(21(7-8-21)29(2,26)27)23-20(24-19)16-4-3-5-17-15(16)6-9-22-17/h3-6,9,12,14,22H,7-8,10-11,13H2,1-2H3/t14-/m1/s1

(3R)-4-[2-(1H-indol-4-yl)-6-(1-methylsulfonylcyclopropyl)pyrimidin-4-yl]-3-methylmorpholine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.06 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.06 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。