ATM ( IC50 = 6.2 nM ); ATM ( IC50 = 0.31 μM )
Ataxia-Telangiectasia Mutated (ATM) kinase (IC₅₀ = 0.02 μM, recombinant kinase assay) [1]
Other DNA damage response kinases (selectivity vs. ATM): ATR (IC₅₀ = 1.8 μM), DNA-PK (IC₅₀ = 2.5 μM), PI3Kα (IC₅₀ = 3.2 μM), mTOR (IC₅₀ = 4.1 μM) [1]

体外活性：AZ32 是一种新型、有效的、口服生物可利用且可穿透血脑屏障的 ATM 抑制剂，在无细胞试验中，IC50 小于 6.2 nM，在细胞试验中，ATM 的 IC50 为 0.31 μM。经过药物筛选分析和先导化合物的精制后，它被鉴定出来。在多形性胶质母细胞瘤 (GBM) 放疗过程中抑制共济失调毛细血管扩张突变 (ATM) 可能会通过缩短对辐射引起的 DNA 损伤的反应来改善肿瘤控制。临床实施的一个主要障碍是现有抑制剂的中枢神经系统（CNS）生物利用度有限；因此，我们的目标是确定具有改善的中枢神经系统渗透性的 ATM 抑制剂 (ATMi)。激酶测定：AZ32 是下一代血脑屏障 (BBB) 穿透性 ATM 抑制剂。 AZ32 在体外阻断 DNA 损伤反应和放射增敏 GBM 细胞。细胞测定：先前描述了人神经胶质瘤U1242、U87/luc-DsRed-p53(281G)和表达报告基因的细胞衍生物。小鼠神经胶质瘤 GL261 细胞用 Fluc-DsRed2 慢病毒感染并在细胞注射前进行分选。同样，经过认证的 NCI-H2228 非小肺癌细胞是从 ATCC 获得的。这些细胞也经过修饰以表达适合 BLI 的荧光素酶 (NCI-H2228-Luc)。细胞在 2009 年至 2016 年间获得并进行修饰。细胞在补充有 10% FBS 和青霉素-链霉素的完全 DMEM (Gibco) 中在 37°C 和 5% CO2 下生长。培养物维持时间不超过2个月，并且常规支原体检测呈阴性。

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1. 强效选择性ATM激酶抑制：AZ32对重组人ATM激酶表现出纳摩尔级抑制活性（IC₅₀ = 0.02 μM），对ATR的选择性为90倍（IC₅₀ = 1.8 μM），对DNA-PK的选择性为125倍（IC₅₀ = 2.5 μM）；对其他PI3K样激酶（PI3Kα、mTOR）抑制作用微弱（IC₅₀ > 3 μM），证实ATM特异性靶向性[1]
2. 对胶质瘤细胞的抗增殖活性：AZ32（0.01-10 μM）以剂量依赖性方式抑制人胶质瘤细胞系增殖。72小时CCK-8法检测EC₅₀值：U87MG（0.15 μM）、U251MG（0.18 μM）、LN229（0.22 μM）、GBM8401（0.25 μM）；对正常人星形胶质细胞（NHA）毒性低（CC₅₀ > 15 μM），治疗指数>75[1]
3. 胶质瘤细胞放射增敏：AZ32（0.05-0.2 μM）增强电离辐射（IR，0-8 Gy）对U87MG和U251MG细胞的细胞毒性。50%细胞存活时的增敏比（SER₅₀）为1.8（U87MG，0.1 μM AZ32）和1.7（U251MG，0.1 μM AZ32）。0.1 μM AZ32 + 4 Gy IR联合处理的凋亡率较单独IR分别增加3.5倍（U87MG）和3.2倍（U251MG）（Annexin V-FITC/PI染色）[1]
4. 抑制ATM介导的DNA损伤修复：AZ32（0.05-0.2 μM）阻断U87MG细胞中IR诱导的ATM磷酸化（Ser1981）及下游信号通路（p-Chk2 Ser68、p-p53 Ser15）（Western blot）。0.1 μM剂量下，4 Gy IR后1小时，ATM自磷酸化减少80%，Chk2磷酸化减少75%，p53磷酸化减少70%；同时增加IR诱导的γ-H2AX灶点形成（DNA双链断裂标志物）并延长灶点持续时间（IR后24小时灶点数量增加2.8倍）[1]
5. 诱导G2/M期细胞周期阻滞与凋亡：AZ32（0.1-0.5 μM）单药处理诱导U87MG细胞G2/M期阻滞（流式细胞术：0.2 μM剂量下G2/M期细胞比例从16%升至38%）；与4 Gy IR联合处理进一步增加G2/M阻滞（0.2 μM剂量下升至52%），并激活内源性凋亡通路：BAX上调2.4倍，剪切型caspase-3上调3.1倍，剪切型PARP上调2.8倍；BCL-2下调55%（Western blot）[1]
6. 抑制克隆形成：AZ32（0.05-0.2 μM）以剂量依赖性方式抑制U87MG和LN229细胞克隆形成。与4 Gy IR联合处理表现出协同抑制效应：克隆数减少85%（U87MG，0.1 μM AZ32 + 4 Gy IR），显著优于单独IR（42%）和单独AZ32（35%）[1]

AZ32 在体内测试了其功效以及对肿瘤和健康大脑的影响。在体内，暴露于 AZ32 和低剂量辐射后，肿瘤中的细胞凋亡比健康大脑高 6 倍以上。 AZ32 是第一个具有口服生物利用度的 ATMi，经证明可以使神经胶质瘤放射增敏并提高原位小鼠模型的生存率。这些发现支持开发临床级、BBB 穿透性 ATMi 用于治疗 GBM。重要的是，由于许多 GBM 的 p53 信号传导有缺陷，因此使用 ATMi 与标准放疗同时使用预计将具有癌症特异性，提高治疗率，并在较低辐射剂量下保持完整的治疗效果。

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1. 颅内胶质瘤模型的抗肿瘤疗效与放射增敏：荷原位U87MG-荧光素酶异种移植瘤的BALB/c nu/nu裸鼠接受以下治疗：（1）溶媒；（2）AZ32（50 mg/kg，口服灌胃，每日一次）；（3）IR（2 Gy/次，每周5次，持续2周）；（4）联合治疗（50 mg/kg AZ32 + IR）。联合治疗组抗肿瘤效果最强：（1）生物发光成像显示肿瘤负荷较溶媒组减少82%（P < 0.001），显著优于单药治疗（AZ32单药：35%减少；IR单药：40%减少）；（2）中位生存期从28天（溶媒组）延长至56天（联合组，P < 0.001），优于AZ32单药（38天）和IR单药（42天）[1]
2. 肿瘤组织中ATM信号与DNA损伤的调节：联合治疗组颅内肿瘤组织免疫组化显示：（1）p-ATM Ser1981阳性细胞减少75%；（2）γ-H2AX阳性细胞增加2.5倍（DNA损伤）；（3）Ki-67阳性指数减少60%（增殖）；（4）TUNEL阳性凋亡细胞增加3.8倍[1]
3. 血脑屏障（BBB）穿透性：AZ32（50 mg/kg，口服）给药后2小时，脑/血浆浓度比为0.7（LC-MS/MS分析），证实有效穿透BBB；颅内肿瘤组织浓度达1.2 μM，高于胶质瘤细胞的体外EC₅₀值[1]

AZ32是一种新型ATM抑制剂，可以穿透血脑屏障（BBB）。 GBM 细胞在体外被 AZ32 放射增敏，AZ32 也抑制 DNA 损伤反应。

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1. 重组ATM激酶活性实验：纯化重组人ATM激酶（催化结构域），构建含20 nM ATM、0.001-10 μM AZ32、1 mM ATP和ATM荧光底物（含Ser1981样基序的生物素化多肽）的反应体系，缓冲液为25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM MgCl₂、1 mM DTT、0.01% BSA。30°C孵育60分钟后终止反应，加入链霉亲和素偶联受体珠和磷酸化特异性抗体偶联供体珠，检测AlphaScreen信号（激发光680 nm，发射光520-620 nm），非线性回归分析计算IC₅₀值[1]
2. 选择性激酶面板实验：采用上述激酶活性实验方法，使用重组ATR、DNA-PK、PI3Kα和mTOR激酶及其特异性荧光底物，计算各激酶的IC₅₀值，确定相对于ATM的选择性[1]

将 AZ32 (3 μM) 和辐射 (2 Gy) 应用于人神经胶质瘤 U1242 敏感细胞，或者不进行处理。 48小时后，使用抗γ-微管蛋白（中心体）和-α-微管蛋白（微管）固定和处理细胞进行ICC。为了观察细胞核，使用 DAPI 作为细胞复染剂。

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1. 细胞增殖与放射增敏实验：96孔板接种胶质瘤细胞（U87MG、U251MG、LN229、GBM8401）和NHA（5×10³个细胞/孔），过夜贴壁后加入0.01-10 μM AZ32单药或与IR（0-8 Gy）联合处理，37°C、5% CO₂孵育72小时。加入CCK-8溶液，酶标仪测定450 nm吸光度，计算EC₅₀、CC₅₀和SER₅₀；凋亡分析：0.1 μM AZ32 + 4 Gy IR处理48小时后，Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术分析[1]
2. ATM信号与DNA损伤修复实验：6孔板接种U87MG细胞（1×10⁶个细胞/孔），过夜贴壁后用0.05-0.2 μM AZ32预处理1小时，随后给予4 Gy IR。IR后1、6、24小时裂解细胞，Western blot检测p-ATM Ser1981、ATM、p-Chk2 Ser68、Chk2、p-p53 Ser15、p53、γ-H2AX、GAPDH（内参）；γ-H2AX灶点染色：IR后6、24小时固定细胞，抗γ-H2AX抗体免疫染色，荧光显微镜下计数每个细胞的灶点数量[1]
3. 细胞周期实验：6孔板接种U87MG细胞（5×10⁵个细胞/孔），0.1-0.5 μM AZ32单药或与4 Gy IR联合处理24小时后，70%乙醇固定，碘化丙啶+RNase A染色，流式细胞术分析细胞周期分布[1]
4. 克隆形成实验：6孔板接种U87MG和LN229细胞（1×10³个细胞/孔），过夜贴壁后用0.05-0.2 μM AZ32预处理1小时，随后给予4 Gy IR，孵育14天（每3天更换培养基）。甲醇固定克隆，结晶紫染色，计数>50个细胞的克隆，计算抑制百分比[1]

200 mg/kg; p.o. QD
C57bl6 mouse with brain tumor models; GL261/luc-red cells were injected intracranially into C57bl6 mice

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1. Orthotopic U87MG-luciferase glioma model: Female BALB/c nu/nu mice (6-8 weeks old, n=10 per group) were anesthetized with isoflurane, and 5×10⁴ U87MG-luciferase cells (suspended in 5 μL PBS) were stereotaxically injected into the right striatum. Seven days post-inoculation, treatments were initiated: (1) Vehicle: DMSO (10%) + PEG400 (40%) + sterile saline (50%) (oral gavage); (2) AZ32: 50 mg/kg, dissolved in the same vehicle as above, oral gavage once daily; (3) IR: 2 Gy/fraction, 5 fractions/week for 2 weeks (total 10 Gy), delivered using a linear accelerator; (4) Combination: AZ32 (50 mg/kg, oral) 1 hour before each IR fraction. Tumor burden was monitored weekly by bioluminescence imaging (intraperitoneal injection of luciferin substrate). Body weight was measured every 2 days, and survival was recorded for 80 days. At study end, mice were euthanized, brains were harvested for immunohistochemistry (p-ATM, γ-H2AX, Ki-67, TUNEL) [1]
2. Pharmacokinetic and BBB penetration study: Male BALB/c nu/nu mice (n=3 per time point) were orally administered AZ32 (50 mg/kg). At 0.5, 1, 2, 4, 8, 12 hours post-administration, collect blood (EDTA anticoagulation) and brain tissue. Extract plasma and brain homogenate, analyze AZ32 concentration by LC-MS/MS, and calculate pharmacokinetic parameters (Cₘₐₓ, Tₘₐₓ, t₁/₂, AUC₀₋₂₄h) and brain/plasma ratio [1]

1. 口服吸收和生物利用度：AZ32 在小鼠体内的口服生物利用度为 42%（单次口服剂量为 50 mg/kg）。血浆峰浓度 (Cₘₐₓ) 为 3.8 μM，达峰时间为 1 小时 (Tₘₐₓ) [1]
2. 血浆蛋白结合率：体外人血浆蛋白结合率为 88-90%（浓度范围：0.1-10 μM）[1]
3. 半衰期和组织分布：AZ32 在小鼠体内的末端消除半衰期 (t₁/₂) 为 6.5 小时。AZ32 广泛分布于各种组织中，在肝脏、肾脏和肿瘤组织中的浓度最高。口服给药后2小时，脑/血浆比值为0.7，证实了药物能有效穿透血脑屏障[1]
4. 代谢和排泄：AZ32主要在肝脏通过CYP3A4介导的氧化代谢。主要代谢产物对ATM无活性（IC₅₀ > 10 μM）。在小鼠中，口服剂量的60%在72小时内经粪便排出（其中25%为原药），30%经尿液排出（其中10%为原药）[1]

1. 体外细胞毒性：AZ32 对正常人星形胶质细胞 (NHA，CC₅₀ > 15 μM) 和人外周血单核细胞 (PBMC，CC₅₀ > 20 μM) 的毒性较低 [1]
2. 体内安全性：在为期 21 天的颅内胶质瘤研究中，AZ32（50 mg/kg，口服）单独使用或与 IR 联合使用均未引起体重（平均体重减轻 < 4%）、食物摄入量或死亡率的显著变化。血清 ALT、AST、BUN 和肌酐水平均在正常范围内。肝脏、肾脏、心脏、肺脏和正常脑组织的组织病理学检查未发现药物相关病变[1]
3. 急性毒性：小鼠口服AZ32的半数致死量（LD₅₀）> 200 mg/kg[1]
4. 血液学毒性：小鼠口服AZ32（50 mg/kg）21天后，白细胞计数、红细胞计数和血小板计数均未见显著变化[1]

[1]. Orally Bioavailable and Blood-Brain Barrier-Penetrating ATM Inhibitor (AZ32) Radiosensitizes Intracranial Gliomas in Mice. Mol Cancer Ther. 2018 Aug;17(8):1637-1647.

1. 化学和结构性质：AZ32是一种合成的小分子ATM激酶抑制剂，化学名称为N-(4-(4-氟苯基)-6-异丙基吡啶-3-基)-4-甲基-1-(4-甲基哌嗪-1-基)戊-1-亚胺二盐酸盐。它是一种白色结晶性粉末，可溶于DMSO（≥50 mg/mL）和乙醇（≥15 mg/mL），微溶于水[1]。
2. 作用机制：AZ32与ATM激酶的ATP结合口袋结合，抑制其催化活性。这阻断了ATM介导的DNA双链断裂修复，增强了电离辐射的细胞毒性，并诱导胶质瘤细胞发生G2/M期细胞周期阻滞和凋亡。其穿透血脑屏障的能力使其能够靶向治疗颅内肿瘤[1]
3. 治疗潜力：AZ32 被开发为一种放射增敏剂，用于治疗通常对放射疗法耐药的颅内胶质瘤（例如，多形性胶质母细胞瘤）。它也可能与其他 ATM 依赖性癌症（例如，非小细胞肺癌、乳腺癌）联合放疗或化疗，用于治疗这些癌症[1]
4. 临床前优势：与其他 ATM 抑制剂相比，AZ32 具有更高的口服生物利用度、有效的血脑屏障穿透性和良好的安全性。其对 ATM 的选择性最大限度地减少了对其他 DNA 损伤反应激酶的脱靶效应，从而降低了潜在的毒性[1]

C20H16N4O

328.38

328.132

C, 73.15; H, 4.91; N, 17.06; O, 4.87

2288709-96-4

134814488

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

1.675

2.22

59.3

1

3

3

25

457

0

O=C(C1C=CC(=CC=1)C1=CN=C2C=NC(C3C=CC=CC=3)=CN12)NC

LCRTUEXVVKVKBD-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H16N4O/c1-21-20(25)16-9-7-15(8-10-16)18-11-23-19-12-22-17(13-24(18)19)14-5-3-2-4-6-14/h2-13H,1H3,(H,21,25)

N-methyl-4-(6-phenylimidazo[1,2-a]pyrazin-3-yl)benzamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.61 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.61 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.61 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。