Fexagratinib (AZD-4547; ADSK-091)

FGFR1 (IC50 = 0.2 nM); FGFR2 (IC50 = 2.5 nM); FGFR3 (IC50 = 1.8 nM); FGFR4 (IC50 = 165 nM)

体外活性：与 FGFR1-3 相比，AZD4547 对 FGFR4 的活性较弱，IC50 为 165 nM。在针对多种代表性人类激酶的体外选择性测试中，AZD4547 仅抑制重组 VEGFR2 (KDR) 激酶活性，IC50 为 24 nM。 0.1 μM 的 AZD4547 对一系列重组激酶没有活性，包括 ALK、CHK1、EGFR、MAPK1、MEK1、p70S6K、PDGFR、PKB、Src、Tie2 和 PI3 激酶。一致地，在细胞磷酸化测定中也观察到 AZD4547 对 FGFR1-3 的选择性优于 FGFR4、IGFR 和 KDR。 AZD4547 仅针对表达失调的 FGFR 的肿瘤细胞系（例如 KG1a、Sum52-PE 和 KMS11）具有有效的体外抗增殖活性，IC50 为 18-281 nM，并且对 MCF7 以及 100 多种其他肿瘤细胞系无活性。 AZD4547 治疗以剂量依赖性方式有效抑制人肿瘤细胞系中的 FGFR 和 MAPK 磷酸化。 AZD4547 还有效抑制 FRS2 和 PLCγ（FGFR 信号传导下游标记）的磷酸化。值得注意的是，AZD4547 影响乳腺细胞系 MCF7 和 Sum52-PE 中的 AKT 磷酸化，但不影响 KG1a 和 KMS11 系中的 AKT 磷酸化。 AZD4547 处理显着诱导 Sum52-PE 和 KMS11 细胞凋亡，显着增加 KG1a 细胞 G1 期阻滞，但不增加细胞凋亡，并且对 MCF7 细胞的细胞周期分布或细胞凋亡没有影响。激酶测定：AZD4547 抑制 FGFR1-3 人重组激酶活性的能力是使用等于或略低于各自 Km 的 ATP 浓度进行测试的。细胞测定：将细胞（KG1a、Sum52-PE、KMS11 和 MCF7）暴露于不同浓度的 AZD4547 中 72 小时。通过MTS增殖测定获得抗增殖IC50值。对于荧光激活细胞分选 (FACS)，细胞用 70% 乙醇固定，然后与碘化丙啶/RNase A 标记溶液一起孵育。使用 FACSCalibur 仪器和 CellQuest 分析软件评估细胞周期概况。对于细胞凋亡分析，轻轻收获细胞和培养基并离心，然后洗涤细胞沉淀。然后对细胞进行膜联蛋白 V-异硫氰酸荧光素 (FITC) 染色和碘化丙啶摄取。然后使用 FACSCalibur 仪器评估膜联蛋白 V 染色阳性的细胞比例，并通过 CellQuest 分析软件进行象限排序。

与媒介物处理的对照组相比，在荷有 KMS11 肿瘤的小鼠中口服 3 mg/kg 每日两次 AZD4547 可使肿瘤生长显着抑制 53%，并且 AZD4547 12.5 mg/kg 每日一次或 6.25 mg/kg 每日两次领先完成肿瘤停滞，这与磷酸 FGFR3 的剂量比例药效调节和减少 KMS11 肿瘤细胞增殖有关。此外，每日一次口服 12.5 mg/kg AZD4547 可在 FGFR1 融合 KG1a 异种移植模型中抑制 65% 的肿瘤生长。在有效剂量水平下，AZD4547 不表现出抗血管生成作用。 AZD4547 对血压没有显着影响，因此缺乏体内抗 KDR 活性。一致地，每天两次口服 6.25 mg/kg 剂量的 AZD4547 在西地尼布敏感的异种移植模型（包括 Calu-6、HCT-15 和 LoVo）中没有活性。

AZD4547在ATP浓度等于或略低于相应Km的情况下进行测试，看看它是否可以抑制FGFR1-3的人重组激酶活性。
体外蛋白质表达分析和激酶抑制研究[1]
细胞用AZD4547或对照在37°C下处理3小时，然后用10 ng/mL aFGF/bFGF和10μg/mL肝素刺激20分钟。用标准SDS-PAGE程序进行蛋白质印迹，并在4°C下进行抗体孵育过夜。抗体来源如下：FGFR1、FGFR2和FRS2、FGFR3蛋白、α-微管蛋白-B512和Bcl2以及BIM。根据制造商的说明，应用二级抗体并用“SuperSignal West Dura”化学发光底物观察免疫反应蛋白。

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抑制细胞受体磷酸化[1]
对于FGFR磷酸化研究，将FGFR1、3或4转染的Cos-1细胞在补充有2mmol/L L-谷氨酰胺和3%FCS的Dulbecco改良鹰氏培养基（DMEM）中培养。对于FGFR2，将Sum52 PE细胞在RPMI-1640中培养，该培养基补充有2mmol/L L-谷氨酰胺和10%FBS。在与AZD4547孵育1小时后，去除培养基；将细胞固定、透化，然后与单克隆抗磷酸化FGFR抗体（细胞信号技术；1:1000）孵育1小时，然后与抗小鼠Alexa Fluor 594第二抗体（1:500）和Hoechst（1:1000）温育1小时。使用Arrayscan进行荧光测量。
对于KDR磷酸化研究，从PromoCell获得原代人脐静脉内皮细胞，并根据供应商的方案进行培养。将细胞与AZD4547孵育90分钟，然后用VEGF配体（25纳克/孔）刺激5分钟。用含有磷酸酶/蛋白酶抑制剂的标准放射免疫沉淀测定缓冲液裂解细胞。根据制造商的说明，用人磷酸化VEGF R2 ELISA方案分析裂解物。
对于胰岛素样生长因子-1受体（IGF1R）磷酸化研究，R+细胞来源于鼠转基因IGF1R敲除，然后用人IGF1R稳定转染。将在补充有1%热灭活的FCS和1%l-谷氨酰胺的DMEM中培养的细胞与AZD4547孵育，然后用IGF配体刺激，然后固定、阻断，并与兔抗磷酸化IGF1R/IR抗体（1∶350）孵育1小时。用Acumen Explorer HTS阅读器在488nm的激发波长和530nm的发射波长下进行二次检测和测量。

将细胞系与固定浓度的 AZD4547 一起孵育 72 小时。用 70% 乙醇固定细胞，然后与碘化丙啶/RNase A 标记溶液一起孵育，进行荧光激活细胞分选 (FACS)。 CellQuest 分析软件和 FACSCalibur 仪器用于评估细胞周期概况。仔细收集细胞和培养基，离心，然后洗涤细胞沉淀，为细胞凋亡分析做准备。随后，细胞准备用于碘化丙啶摄取和 FITC 染色。然后使用 FACSCalibur 装置确定膜联蛋白 V 染色呈阳性的细胞百分比，并使用 CellQuest 分析软件将细胞分类到象限中[1]。

Mice: The mice used are Swiss-derived nude (nu/nu) and severe combined immunodeficient (SCID). Tumor xenografts are created by injecting 0.1 mL (1×10⁶ for LoVo, 1×10⁷ for HCT-15, and 1×10⁷ for Calu-6) or 0.2 mL (2×10⁷ for KMS11 and KG1a) of tumor cells mixed 1:1 with Matrigel into the left flank, with the exception of LoVo and HCT-15, which do not include Matrigel. Tumors that are larger than 0.2 cm³ are randomly assigned to treatment and control groups, and mice are given AZD4547 (1.5-50 mg/kg) orally once or twice a day. For the duration of the study, tumor condition, animal body weight, and tumor volume (measured using a caliper) are recorded twice a week. One computes the tumor volume.

[1]. AZD4547: an orally bioavailable, potent, and selective inhibitor of the fibroblast growth factor receptor tyrosine kinase family. Cancer Res, 2012, 72(8), 2045-2056.

AZD4547 is a member of the class of benzamides that is a carboxamide resulting from the formal condensation of the carboxy group of 4-(cis-3,5-dimethylpiperazin-1-yl)benzoic acid with the amino substituent of 5-[2-(3,5-dimethoxyphenyl)ethyl]-1H-pyrazol-3-amine. It is an inhibitor of the fibroblast growth factor receptor (FGFR). It has a role as a fibroblast growth factor receptor antagonist. It is a member of pyrazoles, a N-arylpiperazine and a member of benzamides.
AZD4547 has been used in trials studying the treatment of Cancer, LYMPHOMA, Gastric Cancer, Adenocarcinoma, and Solid Neoplasm, among others.
Fexagratinib is an orally bioavailable inhibitor of the fibroblast growth factor receptor (FGFR) with potential antineoplastic activity. fexagratinib binds to and inhibits FGFR, which may result in the inhibition of FGFR-related signal transduction pathways, and, so, the inhibition of tumor cell proliferation and tumor cell death. FGFR, up-regulated in many tumor cell types, is a receptor tyrosine kinase essential to tumor cellular proliferation, differentiation and survival.

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The fibroblast growth factor (FGF) signaling axis is increasingly implicated in tumorigenesis and chemoresistance. Several small-molecule FGF receptor (FGFR) kinase inhibitors are currently in clinical development; however, the predominant activity of the most advanced of these agents is against the kinase insert domain receptor (KDR), which compromises the FGFR selectivity. Here, we report the pharmacologic profile of AZD4547, a novel and selective inhibitor of the FGFR1, 2, and 3 tyrosine kinases. AZD4547 inhibited recombinant FGFR kinase activity in vitro and suppressed FGFR signaling and growth in tumor cell lines with deregulated FGFR expression. In a representative FGFR-driven human tumor xenograft model, oral administration of AZD4547 was well tolerated and resulted in potent dose-dependent antitumor activity, consistent with plasma exposure and pharmacodynamic modulation of tumor FGFR. Importantly, at efficacious doses, no evidence of anti-KDR-related effects were observed, confirming the in vivo FGFR selectivity of AZD4547. Taken together, our findings show that AZD4547 is a novel selective small-molecule inhibitor of FGFR with potent antitumor activity against FGFR-deregulated tumors in preclinical models. AZD4547 is under clinical investigation for the treatment of FGFR-dependent tumors.[1]

C26H33N5O3

463.57

463.258

C, 67.36; H, 7.18; N, 15.11; O, 10.35

1035270-39-3

1035270-39-3;1394854-62-6;

51039095

white solid powder

1.2±0.1 g/cm3

621.7±55.0 °C at 760 mmHg

329.8±31.5 °C

0.0±1.8 mmHg at 25°C

1.602

3.46

95

3

6

8

34

622

2

O=C(C1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1[H])N1C([H])([H])[C@]([H])(C([H])([H])[H])N([H])[C@]([H])(C([H])([H])[H])C1([H])[H])N([H])C1C([H])=C(C([H])([H])C([H])([H])C2C([H])=C(C([H])=C(C=2[H])OC([H])([H])[H])OC([H])([H])[H])N([H])N=1

VRQMAABPASPXMW-HDICACEKSA-N

InChI=1S/C26H33N5O3/c1-17-15-31(16-18(2)27-17)22-9-6-20(7-10-22)26(32)28-25-13-21(29-30-25)8-5-19-11-23(33-3)14-24(12-19)34-4/h6-7,9-14,17-18,27H,5,8,15-16H2,1-4H3,(H2,28,29,30,32)/t17-,18+

N-[5-[2-(3,5-dimethoxyphenyl)ethyl]-1H-pyrazol-3-yl]-4-[(3S,5R)-3,5-dimethylpiperazin-1-yl]benzamide

fexagratinib; AZD-4547; AZD 4547; fexagratinib; N-(5-(3,5-dimethoxyphenethyl)-1H-pyrazol-3-yl)-4-((3S,5R)-3,5-dimethylpiperazin-1-yl)benzamide; AZD 4547; 2167OG1EKJ; N-[5-[2-(3,5-dimethoxyphenyl)ethyl]-1H-pyrazol-3-yl]-4-[(3R,5S)-3,5-dimethylpiperazin-1-yl]benzamide; AZD4547

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.39 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.49 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.49 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 4% DMSO+30% PEG 300+5% Tween 80+ddH2O: 5mg/mL

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配方 5 中的溶解度: 3.33 mg/mL (7.18 mM) in 1% CMC-Na/saline water (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液； 超声助溶 (<60°C).
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。