激酶测定：使用人重组酶在基于 AlphaScreen 的酶活性测定中评估 PI3Kβ、PI3Kα、PI3Kγ 和 PI3Kδ 的抑制。该测定测量 PI3K 介导的 PIP2 到 PIP3 的转化。生物素化的 PIP3、GST 标记的 pleckstrin 同源 (PH) 结构域和两个 AlphaScreen 珠形成复合物，在 680 nm 激光激发时引发信号。酶反应中形成的 PIP3 与生物素化的 PIP3 竞争与 PH 结构域的结合，从而随着酶产物的增加而减少信号。将 AZD6482 溶解在 DMSO 中并添加到 384 孔板中。将 PBKβ、PBKα、PBKγ 或 PBKδ 添加到 Tris 缓冲液（50 mM Tris pH 7.6、0.05% CHAPS、5 mM DTT 和 24 mM MgCl2）中，并在添加底物溶液之前与 AZD6482 预孵育 20 分钟含有PIP2和ATP。 20分钟后，通过添加含有EDTA和生物素-PIP3的终止溶液来终止酶反应，随后添加含有GST-grpl PH和AlphaScreen珠子的检测溶液。分析前，将板在黑暗中放置至少 5 小时。测定中 DMSO、ATP 和 PIP2 的终浓度分别为 0.8%、4 μM 和 40 μM。 IC50 值根据方程 y = {a+[(ba)/(l+(x/IC50)s)]} 计算，其中 y = % 抑制； a = 0%； b=100%； s = 浓度-反应曲线的斜率； x = AZD6482 浓度。细胞测定：将 BT20、U87MG 和 SKOV3 细胞以 3,000 个细胞/孔铺在 96 孔培养板中，并置于含有 10% FBS 的生长培养基中。细胞孵育过夜并用 DMSO（最终浓度为 0.1%）或系列稀释化合物处理 3 天。添加刃天青至 0.1 mg/mL。将板在 37°C、5% CO2 中孵育 3 小时。荧光信号读取为 530 nm 激发后 590 nm 处的发射。通过将荧光强度与药物浓度绘制成非线性曲线来计算IC50值。为了测定洗涤的血小板聚集 (WPA)，从人血液中分离血小板沉淀，并在含有 1 μM 水蛭素和 0.02 U/mL 腺苷三磷酸双磷酸酶的 Tyrodes 缓冲液 (TB) 中重悬至 2 × 1015/L。然后，将血小板悬浮液在室温下静置 30 分钟。在进行测定之前，添加 CaCl2 至终浓度为 2 mM。将溶解在 DMSO 中的 AZD6482 添加到 96 孔板中，然后添加洗涤过的血小板悬浮液。将血小板悬浮液与 AZD6482 预孵育 5 分钟。记录板摇动 5 分钟之前和之后 650 nm 处的光吸收，并称为记录 0 (R0) 和 R1。在接下来的 10 分钟板摇动和光吸收记录之前，向每个孔中添加小鼠抗人 CD9 抗体（以供体特定浓度）； R2。为了进行数据分析，在根据以下公式计算聚集百分比之前，先从所有读数中减去 TB 孔中的吸光度：[(R1-R2)/R1] × 100 = 聚集百分比。抑制剂的自发聚集或促聚集作用通过相同的公式来评估，[(R0-R1)/R0]×100=％聚集。 IC50 值根据方程 y = {a+[(ba)/(l+(x/IC50)s)]} 计算，其中 y = % 抑制； a = 0%； b=100%； s = 浓度-反应曲线的斜率； x = AZD6482 浓度。 ZD6482 还抑制 PI3Kα、γ 和 δ，IC50 为 80 nM 至 1.09 μM，显着低于其 (+)-对映体（S 型）。 AZD6482是一种抗血小板剂；在洗涤血小板聚集 (WPA) 测定中，它可阻断血小板活化粘附/聚集并促进血小板解聚，IC50 值为 6 nM。此外，通过靶向 PI3Kβ，AZD6482 特异性抑制血栓形成，而不干扰正常止血。因此，AZD6482被用作抗血栓药物，用于预防血栓性疾病。

为了确定 AZD 6482 (KIN-193) 在体内肿瘤中的药效学，大鼠成纤维细胞 (Rat1) 被设计为表达 p53DD（p53 的显性失活突变体）和组成型激活的 myr-p110β (Rat1-CA-p110β) ）使这些细胞能够在小鼠体内形成异种移植肿瘤。为了进行比较，还生成了表达 p53DD 和 myr-p110α (Rat1-CA-p110α) 的同基因 Rat1 细胞系。将 Rat1-CA-p110α 和 Rat1-CA-p110β 细胞皮下引入无胸腺小鼠的对侧侧腹，使得由激活的 p110α 或 p110β 驱动的肿瘤将暴露于相同的条件下，并且可以消除对动物间差异的担忧。当肿瘤体积达到约 500 mm3 时，荷瘤小鼠接受单次腹腔注射 AZD 6482 (10 mg/kg)。 AZD 6482 的血浆浓度在注射后 1 小时达到最高，并在 4 小时内降至不可检测的水平。 CA-p110α 和 CA-p110β 驱动的肿瘤中 AZD 6482 的浓度与血浆浓度平行。对注射 AZD 6482 后不同时间点收集的肿瘤裂解物的分析表明，在 Rat1-CA-p110β 肿瘤中注射 AZD 6482 后 1 小时，AKT 磷酸化显着降低，但在 Rat1-CAp110α 肿瘤中保持不变。

J Thromb Haemost.2012Oct;10(10):2127-36;Cancer Discov. 2012 May;2(5):425-33.

C22H24N4O4

408.45

408.179

1173900-37-2

1173900-33-8 (AZD6438);1173900-37-2 (S-isomer);

57789333

Typically exists as solid at room temperature

1.4±0.1 g/cm3

635.5±65.0 °C at 760 mmHg

338.1±34.3 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.664

4.07

94.5

2

7

5

30

838

1

CC1=CN2C(=O)C=C(N=C2C(=C1)[C@H](C)NC3=CC=CC=C3C(=O)O)N4CCOCC4

IRTDIKMSKMREGO-HNNXBMFYSA-N

InChI=1S/C22H24N4O4/c1-14-11-17(15(2)23-18-6-4-3-5-16(18)22(28)29)21-24-19(12-20(27)26(21)13-14)25-7-9-30-10-8-25/h3-6,11-13,15,23H,7-10H2,1-2H3,(H,28,29)/t15-/m0/s1

2-[[(1S)-1-(7-methyl-2-morpholin-4-yl-4-oxopyrido[1,2-a]pyrimidin-9-yl)ethyl]amino]benzoic acid

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)