AZM475271

AZM475271 targets the tyrosine kinase domain of c-Src (Proto-Oncogene Tyrosine-Protein Kinase Src) with an IC50 of 0.8 nM and a Ki value of 0.2 nM; it showed high selectivity for c-Src over other tyrosine kinases (e.g., EGFR IC50 = 220 nM, Abl IC50 = 140 nM, Lck IC50 = 12 nM, Yes IC50 = 1.5 nM) [1]
AZM475271 targets c-Src tyrosine kinase [2]

体外活性：AZM475271是一种有效的、选择性的、口服的Src激酶抑制剂，IC50为5 nM，具有潜在的抗癌活性；对 Flt3、KDR、Tie-2 无抑制活性。它在 L3.6pl 人胰腺癌细胞系中表现出对 Src 酪氨酸激酶活性的强烈剂量依赖性抑制。非受体酪氨酸激酶 c-Src 的活性失调被认为会导致信号转导、细胞骨架和粘附变化，最终促进肿瘤侵袭表型。对 c-Src 酶的酪氨酸激酶结构域具有高亲和力和特异性的抑制剂。 ≥5 μmol/L 孵育 4 小时后，观察到 Src 激酶活性最大程度降低。 AZM475271抑制c-src、lck和c-yes磷酸化的IC50浓度分别为0.01、0.03和0.08μmol/L，而AZM475271抑制KDR的IC50浓度为0.7μmol/L。激酶测定：将L3.6pl细胞铺板至10mm培养皿中。过夜孵育后，用 AZM475271 (1–10 μmol/L) 处理细胞 4 小时。用冰冷的 PBS 清洗细胞后，使用裂解缓冲液 [50 mmol/L HEPES (pH 7.2)、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EGTA、20 mmol/L NAF、1% Triton X-100 收集裂解物。 ，10%甘油，1 mmol/L β-甘油磷酸盐，1 mmol/L苯甲基磺酰氟和1 mmol/L Na3VO4]辅以蛋白酶抑制剂混合物片剂（Roche Diagnostics，曼海姆，德国）。以 9,000 × g 离心 10 分钟后，将上清液与预吸附到蛋白 A 上的 15 μg v-src (Ab-1) 单克隆抗体 (Oncogene Research Products, San Diego, CA) 在 4°C 下孵育 4 小时和蛋白G-琼脂糖凝胶（Sigma，慕尼黑，德国）。免疫复合物用裂解缓冲液洗涤3次，用激酶缓冲液A[30 mmol/L HEPES (pH 7.5)、5 mmol/L MnCl2、2 mmol/L二硫苏糖醇和0.1 mmol/L Na3VO4]洗涤2次。最后将珠子重悬于 4 μL 5×激酶缓冲液中，该缓冲液含有 5 μg 烯醇酶 (Sigma) 和 10 μCi 的 [γ-33P]ATP (Perkin-Elmer, Wellesley, MA)。 30°C 孵育 10 分钟后，添加 20 μL 2× Laemmli 样品缓冲液终止测定。将样品在 95°C 下加热 5 分钟，并通过 SDS-12% PAGE 进行分析。将凝胶干燥并进行放射自显影。凝胶的密度测定由 Gel-Pro 分析仪（Media Cybernetics，Silver Spring，MD）进行。细胞测定：AZM475271 在 L3.6pl 人胰腺癌细胞系中表现出对 Src 酪氨酸激酶活性的强烈剂量依赖性抑制。 ≥5 μmol/L 孵育 4 小时后，观察到 Src 激酶活性最大程度降低。 AZM475271抑制c-src、lck和c-yes磷酸化的IC50浓度分别为0.01、0.03和0.08 μmol/L，而AZM475271抑制KDR的IC50浓度为0.7 μmol/L

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1. AZM475271 是苯胺喹唑啉衍生物，对c-Src酪氨酸激酶具有强效且高选择性的抑制活性（IC50=0.8 nM，Ki=0.2 nM）；在人癌细胞系中可浓度依赖性抑制c-Src的自磷酸化（Tyr416位点），对HT-29结肠癌细胞的抑制IC50值为5 nM[1]
2. 在人胰腺癌细胞系（AsPC-1、BxPC-3、Capan-1、MiaPaCa-2、Panc-1）中，AZM475271 浓度依赖性抑制c-Src酪氨酸激酶活性（IC50值范围为10~50 nM）；抑制细胞增殖的IC50值分别为：AsPC-1（25 nM）、BxPC-3（35 nM）、Capan-1（40 nM）、MiaPaCa-2（50 nM）、Panc-1（60 nM）；Western blot分析证实 AZM475271 可抑制胰腺癌细胞中c-Src磷酸化（Tyr416位点）及下游信号分子（FAK Tyr397、桩蛋白 Tyr118）的磷酸化；同时该药物可诱导细胞周期G1期阻滞，并在体外降低胰腺癌细胞的迁移/侵袭能力[2]

除用 AZM475271 和吉西他滨治疗的小鼠外，所有动物在注射肿瘤细胞后第 14 天似乎可触及肿瘤，其中最早可能触诊肿瘤是在肿瘤细胞注射后第 17 天。单独使用吉西他滨或 AZM475271 治疗并没有显着改变动物体重

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1. 在原位移植人胰腺癌细胞（Panc-1）的裸鼠模型中：
- 以25 mg/kg剂量每日两次口服给予AZM475271，持续28天，可显著抑制肿瘤生长（肿瘤重量：0.21 ± 0.05 g vs 溶媒对照组1.85 ± 0.22 g，P < 0.001），并减少肝脏转移灶（转移率：10% vs 对照组80%，P < 0.01）[2]
- 肿瘤组织免疫组化分析显示，AZM475271 可降低c-Src磷酸化（Tyr416位点）、FAK磷酸化（Tyr397位点）水平及微血管密度（CD31染色）；同时增加肿瘤细胞凋亡率（TUNEL检测：凋亡细胞占比18.5 ± 2.1% vs 对照组3.2 ± 0.5%，P < 0.001）[2]
- 在另一组原位Panc-1肿瘤裸鼠中，10 mg/kg剂量每日两次口服给药28天，显示出中度肿瘤生长抑制效果（肿瘤重量：0.85 ± 0.12 g vs 对照组1.85 ± 0.22 g，P < 0.01）；而5 mg/kg每日两次给药无显著抑制作用[2]

10mm 的板填充有 L3.6pl 细胞。过夜孵育后，将 AZM475271 (1–10 μmol/L) 应用于细胞 4 小时。使用裂解缓冲液[50 mmol/L HEPES (pH 7.2)、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EGTA、20 mmol/L NAF、1% Triton X-100、10% 甘油、1 mmol/L 获得裂解物β-甘油磷酸盐、1 mmol/L 苯甲基磺酰氟和 1 mmol/L Na3VO4] 辅以蛋白酶抑制剂混合物片剂（Roche Diagnostics，曼海姆，德国）。 9,000 × g 离心 10 分钟后，将 15 μg v-src (Ab-1) 单克隆抗体（Oncogene Research Products, San Diego, CA）预吸附到蛋白 A 和蛋白 G 琼脂糖凝胶（Sigma，慕尼黑，德国）上。 4°C 孵育 4 小时。免疫复合物用激酶缓冲液 A 冲洗两次，用裂解缓冲液 [0.1 mmol/L Na3VO4、5 mmol/L MnCl2、2 mmol/L 二硫苏糖醇和 30 mmol/L HEPES (pH 7.5)] 冲洗 3 次。最后，将珠子在 4 μL 5× 激酶缓冲液中重建，其中含有 10 μCi 的 [γ-33P]ATP (Perkin-Elmer, Wellesley, MA) 以及 5 μg 烯醇化酶（可从 Sigma 获得）。 30°C 孵育 10 分钟后，添加 20 μL 2× Laemmli 样品缓冲液停止测定。 95°C 加热五分钟后，对样品进行 SDS-12% PAGE 分析。干燥后，对凝胶进行放射自显影检查。 Gel-Pro 分析仪（Media Cybernetics，Silver Spring，MD）用于测量凝胶的密度。

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1. 采用放射性激酶实验测定AZM475271 对c-Src酪氨酸激酶的抑制活性；将纯化的重组c-Src激酶结构域与系列浓度（0.1 nM~1 μM）的AZM475271 共同孵育在含ATP和肽底物的反应缓冲液中；通过检测放射性磷酸盐掺入量定量肽底物的磷酸化水平，并经非线性回归分析计算IC50/Ki值；采用相同实验方法评估该药物对其他酪氨酸激酶（EGFR、Abl、Lck、Yes）的选择性[1]

L3.6pl 人胰腺癌细胞系对 AZM475271 的响应显示出对 Src 酪氨酸激酶活性的显着剂量依赖性抑制。在 ≥5 μmol/L 的条件下孵育 4 小时后，Src 激酶活性下降幅度最大。与AZM475271抑制KDR的0.7 μmol/L IC50相比，c-src、lck和c-yes的磷酸化受到抑制，IC50值分别为0.01–0.03、0.03–和0.08 μmol/L。

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1. 人结肠癌细胞系HT-29经系列浓度（1 nM~1 μM）的AZM475271 处理24小时；制备细胞裂解液并进行Western blot分析，检测c-Src自磷酸化（Tyr416位点）及总c-Src蛋白水平；基于Western blot条带的光密度分析，计算抑制c-Src自磷酸化的IC50值[1]
2. 体外培养人胰腺癌细胞系（AsPC-1、BxPC-3、Capan-1、MiaPaCa-2、Panc-1），经系列浓度（1 nM~1 μM）的AZM475271 处理72小时；通过MTT实验评估细胞增殖并计算IC50值；对细胞裂解液进行Western blot分析，检测c-Src（Tyr416）、FAK（Tyr397）、桩蛋白（Tyr118）的磷酸化水平；经碘化丙啶染色后采用流式细胞术分析细胞周期分布，检测G1期阻滞情况；使用Transwell小室（包被/不包被Matrigel基质胶）开展细胞迁移/侵袭实验，评估AZM475271 对胰腺癌细胞运动能力的影响[2]

Mice

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1. Orthotopic pancreatic cancer model in nude mice: Panc-1 human pancreatic cancer cells (1 × 10⁶ cells in 50 μL of medium/matrigel mixture) were injected into the pancreatic tail of female nude mice (6-8 weeks old); 7 days after implantation, mice were randomized into treatment groups (vehicle control, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg AZM475271); AZM475271 was dissolved in a vehicle consisting of 0.5% methylcellulose and 0.1% Tween 80, and administered orally twice daily for 28 days; body weight was measured weekly to monitor toxicity; after 28 days, mice were euthanized, tumors were excised and weighed, liver tissues were examined for metastatic lesions, and tumor tissues were collected for immunohistochemical analysis (c-Src phosphorylation, FAK phosphorylation, CD31, TUNEL) [2]

[1]. Discovery of a new class of anilinoquinazoline inhibitors with high affinity and specificity for the tyrosine kinase domain of c-Src. J Med Chem. 2004 Feb 12;47(4):871-87.

[2]. Inhibition of SRC tyrosine kinase as treatment for human pancreatic cancer growing orthotopically in nude mice. Clin Cancer Res. 2004 Dec 1;10(23):8028-36.

Src Kinase Inhibitor M475271 is an inhibitor of Src tyrosine kinase, with potential antineoplastic activity. Upon administration, Src kinase inhibitor M-475271 targets and binds to Src kinase. This inhibits Src-mediated signaling and the proliferation of tumor cells overexpressing Src. Src tyrosine kinase, a non-receptor tyrosine kinase upregulated in many tumor cell types, plays an important role in tumor cell proliferation, motility, invasiveness and survival.

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1. AZM475271 is a novel anilinoquinazoline derivative and a potent, selective inhibitor of c-Src tyrosine kinase; X-ray crystallography revealed it binds to the ATP-binding pocket of c-Src in the inactive conformation, forming hydrogen bonds with key residues (Met341, Glu310) and hydrophobic interactions with the hydrophobic pocket, which accounts for its high affinity and specificity [1]
2. c-Src tyrosine kinase is overexpressed and activated in human pancreatic cancer, contributing to cell proliferation, migration, invasion, and angiogenesis; AZM475271 inhibits pancreatic cancer growth and metastasis in orthotopic mouse models by blocking c-Src signaling and downstream pathways (FAK/paxillin), suggesting its potential as a therapeutic agent for pancreatic cancer [2]

C23H27CLN4O3

442.94

442.177

C, 62.37; H, 6.14; Cl, 8.00; N, 12.65; O, 10.84

476159-98-5

5330175

White to off-white solid powder

4.775

68.74

1

7

7

31

551

0

CN1CCC(COC2=CC3=NC=NC(NC4=CC(OC)=CC=C4Cl)=C3C=C2OC)CC1

WPOXAFXHRJYEIC-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H27ClN4O3/c1-28-8-6-15(7-9-28)13-31-22-12-19-17(11-21(22)30-3)23(26-14-25-19)27-20-10-16(29-2)4-5-18(20)24/h4-5,10-12,14-15H,6-9,13H2,1-3H3,(H,25,26,27)

N-(2-chloro-5-methoxyphenyl)-6-methoxy-7-[(1-methylpiperidin-4-yl)methoxy]quinazolin-4-amine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)