Bay 65-1942 HCl

别名: BAY 65-1942 HCl; BAY-65-1942 hydrochloride; BAY65-1942; BAY 651942; BAY-651942; BAY651942 7-[2-(环丙基甲氧基)-6-羟基苯基]-1,4-二氢-5-[(3S)-3-哌啶基]-2H-吡啶并[2,3-d][1,3]恶嗪盐酸盐; 7-[2-(环丙基甲氧基)-6-羟基苯基]-1,4-二氢-5-[(3s)-3-哌啶基]-2H-吡啶并[2,3-d][1,3]噁嗪-2-酮盐酸盐

目录号: V4192 纯度: ≥98%

COA 产品数据产品说明书 SDS

Bay 65-1942 HCl 是 BAY65-1942 的盐酸盐，BAY65-1942 是一种新型、有效、选择性 ATP 竞争性 IKKβ 抑制剂。

Bay 65-1942 HCl CAS号: 600734-06-3
产品类别: NF-κB

产品仅用于科学研究，不针对患者销售

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Nature 2025, 643(8070):192-200.

Nature 2024 Dec 18.

Nature 2021, 597(7874):119-125.

Cell 2020,183:1202-1218.e25.

Science Adv 2022: 8, eabm9427.

Nat Neurosci 2024, 27:1468-1474.

Science Adv 2025, 11(33):eadr5199.

Nat Metab 2024, 6: 1108-1127.

Cell Stem Cell 2024, 31:106-126.e13.

Nature 597, 119–125 (2021)

Cell Stem Cell 2020,26(6):845-861.e12.

Science Trans Med 2023,15(701):eadd7872.

STTT 2023,8(1):91.

Cell Reports 2023,42(4):112313

Science Trans Med 2023, 15: eadd7872.

Cancer Cell 2021,39(4):529-547.e7.

Cancer Discov 2022,12(4):1106-1127.

Immunity 2023,56(3):620-634.e11.

Immunity 2024,57:2651-2668.e12.

J Am Chem Soc 2022,144:21831-21836.

Cell 2020,183:1202-1218.e25.

Science Adv 2022:8,eabm9427.

Nature 2021,597(7874):119-125.

Cell 2020,183:1202-1218.e25.

PNAS Nexus 2022,1(3):pgac063.

ACS Nano 2023,17(10):9110-9125.

Biomaterial 2023 Sep16:302:122333.

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Bay 65-1942 HCl 是 BAY65-1942 的盐酸盐，是一种新型、有效、选择性 ATP 竞争性 IKKβ 抑制剂。它选择性地针对 IKKbeta 激酶活性。 IKKbeta 抑制可减轻急性缺血再灌注损伤后的心肌损伤和功能障碍。与 IR 前未处理的动物相比，用 Bay 65-1942 预处理的动物 (n=3) 的 CK-MB 水平显着降低（14,170 ±3,219 单位，与媒介物相比，P<0.05）

生物活性&实验参考方法

靶点	IKKβ Compared to animals receiving a vehicle, the size of the left ventricular infarct is significantly reduced when Bay 65-1942 is administered before ischemia. Animals receiving vehicles have a significantly higher infarct-to-area at risk (AAR) ratio than sham animals (70.7±3.4 vs. 5.8±3.4%, P<0.05). Treatment with Bay 65-1942 at each time point significantly lowers this ratio (prior to ischemia 42.7±4.1%, at reperfusion 42.7±7.5%, 2 hours after reperfusion 29.4±5.2%; each group P<0.05 vs. vehicle). The CK-MB levels in the animals pretreated with Bay 65-1942 (n=3) were significantly lower than those in the control group before IR (14,170 ±3,219 units, P<0.05 vs. vehicle)[1].
体外研究 (In Vitro)	与接受赋形剂的动物相比，在缺血前施用Bay 65-1942时，左心室梗塞的面积显着减小。接受载体的动物比假手术动物具有显着更高的梗塞风险区域（AAR）比率（70.7±3.4 vs. 5.8±3.4%，P<0.05）。在每个时间点用Bay 65-1942治疗显着降低了该比率（缺血前42.7±4.1%，再灌注时42.7±7.5%，再灌注后2小时29.4±5.2%；每组与载体相比P<0.05）。用 Bay 65-1942 预处理的动物 (n=3) 的 CK-MB 水平显着低于 IR 前对照组的水平 (14,170 ±3,219 单位，与媒介物相比 P<0.05)[1]。在伊马替尼耐药、Lyn依赖的慢性髓系白血病细胞（MYL-R）中，用 Bay 65-1942 (10 µM) 处理2小时可有效阻断NF-κB p65亚基在Ser536位点的磷酸化，这是NF-κB活性的一个标志。[2] 用 Bay 65-1942 (10 µM) 处理MYL-R细胞12小时，导致IκBα mRNA表达量降低约2倍，但使IL-6 mRNA表达量相较于溶剂对照组增加4.4倍。[2] 用 Bay 65-1942 (10 µM) 处理MYL-R细胞24小时，增加了MEK/ERK通路活性，表现为ERK磷酸化水平显著升高。这种激活可被MEK抑制剂AZD6244 (5 µM) 联合处理所阻止。[2] 用 Bay 65-1942 (10 µM) 和AZD6244 (5 µM) 共同处理MYL-R细胞12小时，阻止了 Bay 65-1942 单独使用引起的IL-6 mRNA表达增加。[2] 在细胞活力实验（MTS法）中，用 Bay 65-1942 (10 µM) 处理MYL-R细胞48小时，与DMSO对照组相比，细胞活力降低约37%。Bay 65-1942 (10 µM) 与AZD6244 (5 µM) 联合处理显示出协同效应，使细胞活力降低约84%。在此剂量下的组合指数（CI）为0.48，表明具有协同作用。[2] 在细胞凋亡实验中，用 Bay 65-1942 (10 µM) 处理MYL-R细胞24小时，诱导caspase 3/7活性增加1.3倍。Bay 65-1942 与AZD6244联合处理诱导caspase 3/7活性增加3.2倍，并增强了聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的切割。[2] 对用 Bay 65-1942 (10 µM) 处理24小时的MYL-R细胞进行多重激酶抑制剂磁珠/质谱（MIB/MS）分析，结果显示MEK/ERK通路中的激酶（B-Raf, ERK, RSK1）被磁珠捕获的量增加，表明该通路活性上调。[2]
体内研究 (In Vivo)	为了充分抑制激酶活性，使用 MEK (AZD6244) 和 IKK (BAY 65-1942) 抑制剂的 IC50 浓度（通过 48 小时 MTS 测定确定）。将相同浓度的 AZD6244 (5 µM)、BAY 65-1942 (10 µM) 或这些抑制剂的组合应用于 MYL-R 细胞 24 小时。在与 IC75 (CI = 0.48±0.01) 相关的 (5 µM AZD6244+10 µM BAY 65-1942) 剂量组合下，AZD6244 和 BAY 65-1942 显示出对细胞活力的协同抑制作用。此外，软件报告显示 IC50 (CI = 0.56±0.09) 和 IC90 (CI = 0.460.02) 剂量组合存在协同作用（CI 值是三个独立实验的平均值，±标准差）。与 DMSO 处理的细胞相比，AZD6244 和 BAY 65-1942 对 caspase 3/7 激活的影响分别是 1.3 和 2 倍。使用 AZD6244 和 BAY 65-1942 治疗后，Caspase 3/7 活性提高了 3.2 倍[2]。
细胞实验	将 MYL-R 细胞以 4×104 个细胞/孔的密度接种在 96 孔板上，并置于含有激酶抑制剂的 100 µL RPMI 生长培养基中，以测试细胞的活力。在第一个 24 小时和第二个 48 小时内，补充生长培养基和激酶抑制剂。每个孔装有 20 L 的 MTS 测定试剂。板在培养箱中放置大约一小时后，测量 490 nm 处的吸光度。培养细胞并进行组合指数 (CI) 实验测试。分别用 AZD6244 单独或与 BAY 65-1942 (10 µM) 组合的一系列三倍稀释液处理细胞，同时保持 1:2 的恒定比例，以确定每种药物的剂量效应。为了计算 CI 值，需要分析细胞活力测试结果。三个独立实验的 CI 值取平均值[2]。用于激酶磷酸化的Western blot分析：用 Bay 65-1942 (10 µM) 处理MYL-R细胞特定时间（如2或24小时）。裂解细胞，蛋白质经SDS-PAGE分离，转印至PVDF膜，并用特异性一抗和二抗孵育。使用增强化学发光试剂检测信号。[2] 用于基因表达的qRT-PCR分析：用 Bay 65-1942 (10 µM) 处理MYL-R细胞12或24小时。提取总RNA，逆转录为cDNA，并使用特异性TaqMan检测法通过实时PCR进行分析。[2] 用于细胞活力评估（MTS法）：将MYL-R细胞接种于96孔板，用 Bay 65-1942 (10 µM) 单独或与AZD6244联合处理。24小时后更换培养基和药物，48小时后加入MTS试剂并测量490 nm处的吸光度以评估细胞活力。[2] 用于caspase 3/7活性检测：用 Bay 65-1942 (10 µM) 处理MYL-R细胞24小时，裂解细胞，上清液与caspase 3/7底物（Ac-DEVD-AMC）孵育。通过测量释放的AMC的荧光强度来确定caspase活性。[2] 用于MIB/MS激酶组分析：用 Bay 65-1942 (10 µM) 处理MYL-R细胞24小时。裂解细胞，使用多重激酶抑制剂偶联磁珠（MIBs）富集激酶。洗脱捕获的蛋白质，用胰蛋白酶消化，并通过液相色谱与MALDI-TOF/TOF质谱联用进行鉴定和相对定量。[2]
动物实验	小鼠：本研究使用8-10周龄雄性C57BL/6小鼠。小鼠接受30分钟的心肌缺血，随后进行不同程度的再灌注，以研究IKK抑制剂对心肌缺血再灌注损伤的影响。在适当的给药时间点，腹腔注射Bay 65-1942（5 mg/kg）。对照组给予10% Cremaphor水溶液作为溶剂。治疗组分别在缺血前、再灌注期间或再灌注损伤后2小时给予Bay 65-1942。在溶剂组、假手术组和治疗组中，于再灌注损伤后24小时测定梗死面积。在接受Bay 65-1942治疗的小鼠中，于再灌注后1小时检测血清肌酸激酶-MB同工酶（CK-MB）水平，以确认心肌损伤。
参考文献	[1]. Inhibition of IκB kinase-β protects dopamine neurons against lipopolysaccharide-induced neurotoxicity By Zhang, Feng; Qian, Li; Flood, Patrick M.; Shi, Jing-Shan; Hong, Jau-Shyong; Gao, Hui-Ming J Pharmacol Exp Ther. 2010 June; 333(3): 822-833. [2]. Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia. PLoS One. 2013 Jun 24;8(6):e66755.
其他信息	Bay 65-1942 盐酸盐是一种 ATP 竞争性选择性 IKKb 抑制剂。 Bay 65-1942 在本研究中被用作药理学工具，以研究 IKK/NF-κB 通路在伊马替尼耐药白血病中的作用。[2] 研究发现，使用 Bay 65-1942 抑制 IKK 会导致耐药细胞中 MEK/ERK 通路的代偿性激活。这一发现为 Bay 65-1942 与 MEK 抑制剂联合使用时观察到的协同抗白血病效应提供了理论依据。[2] 该研究表明，使用 MIB/MS 进行激酶组分析可以识别适应性信号反应（例如 IKK 抑制后 MEK/ERK 的上调），并指导有效的联合治疗策略。[2]

*注: 文献方法仅供参考, InvivoChem并未独立验证这些方法的准确性

化学信息 & 存储运输条件

分子式	C22H25N3O4.HCL
分子量	431.91254
精确质量	431.161
元素分析	C, 61.18; H, 6.07; Cl, 8.21; N, 9.73; O, 14.82
CAS号	600734-06-3
相关CAS号	758683-21-5 (BAY65-1942 R-isomer); 600734-02-9
PubChem CID	135454903
外观&性状	White to off-white solid powder
LogP	5.04
tPSA	92.71
氢键供体(HBD)数目	4
氢键受体(HBA)数目	6
可旋转键数目(RBC)	5
重原子数目	30
分子复杂度/Complexity	586
定义原子立体中心数目	1
SMILES	O=C1OCC2=C([C@H]3CNCCC3)C=C(C4=C(O)C=CC=C4OCC5CC5)N=C2N1.[H]Cl
InChi Key	XZTOAEZYOFWVHB-PFEQFJNWSA-N
InChi Code	InChI=1S/C22H25N3O4.ClH/c26-18-4-1-5-19(28-11-13-6-7-13)20(18)17-9-15(14-3-2-8-23-10-14)16-12-29-22(27)25-21(16)24-17;/h1,4-5,9,13-14,23,26H,2-3,6-8,10-12H2,(H,24,25,27);1H/t14-;/m1./s1
化学名	7-[2-(cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl]-5-[(3S)-piperidin-3-yl]-1,4-dihydropyrido[2,3-d][1,3]oxazin-2-one;hydrochloride
别名	BAY 65-1942 HCl; BAY-65-1942 hydrochloride; BAY65-1942; BAY 651942; BAY-651942; BAY651942
HS Tariff Code	2934.99.03.00
存储方式	Powder -20°C 3 years 4°C 2 years In solvent -80°C 6 months -20°C 1 month 注意：请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。
运输条件	Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

溶解度数据

溶解度 (体外实验)	DMSO: ~50 mg/mL (~115.8 mM) H2O: ~2.2 mg/mL (~5.0 mM)
溶解度 (体内实验)	配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.79 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。配方 2 中的溶解度:* ≥ 2.5 mg/mL (5.79 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。 View More* 配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.79 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案： 1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液)); 2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品的实际溶解配方): 10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline); 假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL； 3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例; 4、如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶; 5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！ 6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们; 7、以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。

溶解度 (体外实验)

DMSO: ~50 mg/mL (~115.8 mM)
H2O: ~2.2 mg/mL (~5.0 mM)

溶解度 (体内实验)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.79 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.79 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.79 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。

制备储备液		1 mg	5 mg	10 mg
	1 mM	2.3153 mL	11.5765 mL	23.1530 mL
	5 mM	0.4631 mL	2.3153 mL	4.6306 mL
	10 mM	0.2315 mL	1.1576 mL	2.3153 mL

1、根据实验需要选择合适的溶剂配制储备液 (母液)：对于大多数产品，InvivoChem推荐用DMSO配置母液 (比如：5、10、20mM或者10、20、50 mg/mL浓度），个别水溶性高的产品可直接溶于水。产品在DMSO 、水或其他溶剂中的具体溶解度详见上”溶解度 (体外)”部分;

2、如果您找不到您想要的溶解度信息，或者很难将产品溶解在溶液中，请联系我们;

3、建议使用下列计算器进行相关计算（摩尔浓度计算器、稀释计算器、分子量计算器、重组计算器等）;

4、母液配好之后，将其分装到常规用量，并储存在-20°C或-80°C，尽量减少反复冻融循环。

计算器

质量

浓度

体积

分子量*

计算重置

摩尔浓度计算器可计算特定溶液所需的质量、体积/浓度，具体如下：

计算制备已知体积和浓度的溶液所需的化合物的质量
计算将已知质量的化合物溶解到所需浓度所需的溶液体积
计算特定体积中已知质量的化合物产生的溶液的浓度

参见示例

使用摩尔浓度计算器计算摩尔浓度的示例如下所示：
假如化合物的分子量为350.26 g/mol，在5mL DMSO中制备10mM储备液所需的化合物的质量是多少？

在分子量（MW）框中输入350.26
在“浓度”框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
在“体积”框中输入5，然后选择正确的单位（mL）
单击“计算”按钮
答案17.513 mg出现在“质量”框中。以类似的方式，您可以计算体积和浓度。

浓度 (起始)

体积 (起始)

浓度 (终)

体积 (终)

计算重置

稀释计算器可计算如何稀释已知浓度的储备液。例如，可以输入C1、C2和V2来计算V1，具体如下：

制备25毫升25μM溶液需要多少体积的10 mM储备溶液？
使用方程式C1V1=C2V2，其中C1=10mM，C2=25μM，V2=25 ml，V1未知：

在C1框中输入10，然后选择正确的单位（mM）
在C2框中输入25，然后选择正确的单位（μM）
在V2框中输入25，然后选择正确的单位（mL）
单击“计算”按钮
答案62.5μL（0.1 ml）出现在V1框中

分子式

分子量

g/mol

计算重置

分子量计算器可计算化合物的分子量 (摩尔质量)和元素组成，具体如下：

注：化学分子式大小写敏感：C12H18N3O4 c12h18n3o4
计算化合物摩尔质量（分子量）的说明：

要计算化合物的分子量 (摩尔质量)，请输入化学/分子式，然后单击“计算”按钮。

分子质量、分子量、摩尔质量和摩尔量的定义：

分子质量（或分子量）是一种物质的一个分子的质量，用统一的原子质量单位（u）表示。（1u等于碳-12中一个原子质量的1/12）
摩尔质量（摩尔重量）是一摩尔物质的质量，以g/mol表示。

配液体积

质量

配液浓度

计算重置

配液计算器可计算将特定质量的产品配成特定浓度所需的溶剂体积 (配液体积)

输入试剂的质量、所需的配液浓度以及正确的单位
单击“计算”按钮
答案显示在体积框中

动物体内实验配方计算器（澄清溶液）

第一步：请输入基本实验信息（考虑到实验过程中的损耗，建议多配一只动物的药量）

给药剂量 mg/kg

动物平均体重 g

每只动物给药体积 μL

动物数量

第二步：请输入动物体内配方组成（配方适用于不溶/难溶于水的化合物），不同的产品和批次配方组成不同，如对配方有疑问，可先联系我们提供正确的体内实验配方。此外，请注意这只是一个配方计算器，而不是特定产品的确切配方。

% DMSO

% Tween 80

% ddH₂O

计算重置

计算结果:

工作液浓度： mg/mL；

DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL)。如该浓度超过该批次药物DMSO溶解度，请首先与我们联系。

体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL ddH₂O，混匀澄清。

注意： (1) 请确保溶液澄清之后，再加入下一种溶剂 (助溶剂) 。可利用涡旋、超声或水浴加热等方法助溶；
(2) 一定要按顺序加入溶剂 (助溶剂) 。

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MYL-R cells were treated for 24 hours with AZD6244 (AZD, 5 µM), BAY 65-1942 (BAY, 10 µM) or AZD (5 µM) plus BAY (10 µM), and kinases were isolated and quantified by MIB/MS in two independent experiments. PLoS One . 2013 Jun 24;8(6):e66755.

MYL-R cells were treated for 48 hours with AZD6244 (AZD, 5 µM), BAY 65-1942 (BAY, 10 µM), AZD (5 µM) plus BAY (10 µM), or dasatinib (1 nM) and cell viability was assessed by MTS assay. PLoS One . 2013 Jun 24;8(6):e66755.