BAY-826

Tie2 (Kd = 1.6 nM)
BAY-826 is a selective and potent inhibitor of TIE-2 (dissociation constant = 1.6 nM). It binds similarly highly to only 4 out of 456 tested kinases (dissociation constant = 0.9, 0.4, 1.3, and 5.9 nM), which are TIE-1, DDR1, DDR2, and Serine/threonine-protein kinase 10 (LOK).With an EC50 of roughly 1.3 nM for the inhibition of TIE-2 autophosphorylation in human umbilical vein endothelial cells, the high biochemical affinity for TIE-2 translates into very strong cellular mechanistic activity. Using all four mouse glioma cell lines, the acute growth inhibitory and anti-clonogenic effects of the TIE-2 inhibitor BAY-826 are evaluated. The effects of BAY-826 on VEGF-stimulated proliferation of HUVEC are limited to μM concentrations, and it exhibits high selectivity against other angiogenic kinases such as VEGFR, fibroblast growth factor receptor (FGFR), or platelet-derived growth factor receptor (PDGFR).

BAY-826 是一种选择性且有效的 TIE-2 抑制剂（解离常数 = 1.6 nM）。同样，它仅与 456 种测试激酶中的 4 种高度结合（解离常数 = 0.9、0.4、1.3 和 5.9 nM），即 TIE-1、DDR1、DDR2 和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 10 (LOK)。抑制人脐静脉内皮细胞中 TIE-2 自磷酸化的 EC50 约为 1.3 nM，TIE-2 的高生化亲和力转化为非常强的细胞机制活性。使用所有四种小鼠神经胶质瘤细胞系，评估了 TIE-2 抑制剂 BAY-826 的急性生长抑制和抗克隆形成作用。 BAY-826 对 VEGF 刺激的 HUVEC 增殖的影响仅限于 μM 浓度，并且对其他血管生成激酶（如 VEGFR、成纤维细胞生长因子受体 (FGFR) 或血小板源性生长因子受体 (PDGFR)）表现出高选择性。

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BAY-826 在人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 中有效抑制 TIE-2 自磷酸化，细胞机制 EC50 约为 1.3 nM。 [1]
在四种小鼠胶质瘤细胞系 (SMA-497, SMA-540, SMA-560, GL-261) 中，急性暴露于高达 100 µM 的 BAY-826 72 小时，不影响细胞代谢活性 (MTT 法)。同样，在已知能特异性抑制细胞 TIE-2 (1 nM) 及更高浓度的克隆形成存活实验中暴露超过 10 天，也不影响任何胶质瘤细胞系的存活。 [1]
流式细胞术分析（膜联蛋白 V/PI 染色）显示，暴露于 BAY-826 72 小时，未诱导小鼠胶质瘤细胞凋亡或坏死性细胞死亡，也未引起细胞周期进程的变化。 [1]
在 SMA-497 细胞中，通过免疫沉淀和免疫印迹评估，BAY-826 (1 µM) 抑制了 Na3VO4 和 COMP-ANG-1 诱导的 TIE-2 自磷酸化。 [1]
克隆形成实验中的联合研究表明，在 SMA-497 和 SMA-560 细胞中，BAY-826 既未拮抗也未与替莫唑胺 (1-1000 µM) 或放疗 (1, 3, 9 Gy) 产生协同作用。 [1]

BAY-826（口服灌胃；25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/k）可有效抑制雌性 CB17/scid 小鼠肺中 ANG-1 诱导的 TIE-2 自磷酸化[1]。在同基因神经胶质瘤的小鼠模型中，BAY-826 增强了肿瘤控制。在一种模型（SMA-497）中，与 BAY-826 和放射线联合治疗无效；然而，在另一种模型（SMA-560）中，它具有延长细胞存活的协同作用。在胶质母细胞瘤等高度血管化的肿瘤中，TIE-2 抑制可能会增强肿瘤对治疗的反应[1]。

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在同系小鼠胶质瘤模型 (SMA-497, SMA-540, SMA-560, GL-261) 中，从植入后第 7 天开始每日口服给予 BAY-826 (100 mg/kg)，在 SMA-497 和 SMA-540 模型中显示出延长生存期的趋势，并在 SMA-560 模型中产生显著（尽管较小）的生存获益。在 GL-261 模型中未观察到生存获益。 [1]
BAY-826 治疗降低了四个模型中的三个 (SMA-497, SMA-560, GL-261) 肿瘤内血管 TIE-2 蛋白水平（通过免疫荧光强度评估）。 [1]
BAY-826 治疗显著降低了具有最高基线血管密度的 SMA-560 和 GL-261 肿瘤中的 CD31+ 微血管密度。 [1]
BAY-826 治疗显著增加了 SMA-497 和 SMA-540 肿瘤中浸润的 CD11b+ 单核细胞/巨噬细胞数量。 [1]
BAY-826 治疗在所有四个单药治疗模型中均未影响肿瘤细胞增殖率 (Ki-67 标记) 或最终肿瘤体积。 [1]
与单次全脑照射 (12 Gy) 联合，在 SMA-497 模型中，BAY-826 联合治疗并未比单一治疗带来统计学上显著的生存获益。在 SMA-560 模型中，联合治疗优于溶剂对照组，并且与任一单一治疗相比显示出趋势。 [1]
在 SMA-560 联合模型中，BAY-826 与放疗联用显著减少了肿瘤体积，而单一治疗则没有。 [1]
单次口服剂量 (25, 50, 或 100 mg/kg) 的 BAY-826 有效抑制了 CB17/scid 小鼠肺中由重组人 ANG-1 刺激的 TIE-2 自磷酸化。 [1]

BAY-826 对各种激酶的生化亲和力通过 KINOMEscan™ 筛选平台测定，该平台测量解离常数 (Kd)。 [1]
使用 SMA-497 胶质瘤细胞进行了基于细胞的 TIE-2 自磷酸化实验。细胞与 BAY-826 或载体预孵育，然后用 Na3VO4 或 COMP-ANG-1 刺激以诱导磷酸化。裂解细胞后，从裂解物中免疫沉淀 TIE-2，然后通过免疫印迹分析磷酸化 TIE-2 (pTIE-2) 和总 TIE-2 水平以评估抑制效果。 [1]

在同基因神经胶质瘤的小鼠模型中，BAY-826 增强了肿瘤控制。在一种模型（SMA-497）中，与 BAY-826 和放射线联合治疗无效；然而，在另一种模型（SMA-560）中，它具有延长细胞存活的协同作用。在胶质母细胞瘤等高度血管化的肿瘤中，TIE-2 抑制可能会增强肿瘤对治疗的反应[1]。使用来自小鼠 SMA-497、SMA-540、SMA-560 和 GL-261 的胶质瘤细胞。通常，这些细胞在 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基中以贴壁单层生长，该培养基用 2 mM 谷氨酰胺和 10% 热灭活胎牛血清增强。在共辐射源中，细胞接收 1、3 和 9 Gy 的辐射。将细胞在 37°C 下预孵育 10 分钟，并使用 1μM BAY-826 或 0.1% DMSO 作为对照。在 0.1% DMSO 或 1 μM BAY-826 存在的情况下，使用 400 ng/mL COMP-ANG-1 或 4 mM Na3VO4 诱导 TIE-2 自磷酸化 20 分钟[1]。

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对于急性活力测定，将小鼠胶质瘤细胞接种在 96 孔板中并使其贴壁。然后在无血清培养基中将细胞暴露于 BAY-826 (1-100 µM) 72 小时。使用 MTT 法评估细胞代谢活性。 [1]
对于克隆形成存活实验，在 96 孔板中每孔接种 100-200 个细胞。贴壁后，在无血清培养基中将细胞暴露于浓度递增的 BAY-826。24 小时后添加胎牛血清，观察细胞至少 10 天。通过 MTT 法评估代谢活性。对于联合研究，细胞暴露于 BAY-826 6 小时后，再加入替莫唑胺或进行照射。 [1]
通过流式细胞术评估细胞凋亡和坏死。在无血清培养基中用 BAY-826 处理的细胞经洗涤后重悬于缓冲液中，并用 FITC 标记的膜联蛋白 V 和碘化丙啶 (PI) 染色。记录荧光以量化 AnxV+/PI-（早期凋亡）、AnxV+/PI+（晚期凋亡/坏死）和 AnxV-/PI+（坏死）群体。 [1]
对于细胞周期分析，用 BAY-826 处理的细胞被收集、固定、在乙醇中透化、用 RNase A 处理并用 PI 染色。通过流式细胞术分析 DNA 含量。 [1]
通过实时荧光定量 PCR (RT-PCR) 分析小鼠胶质瘤细胞系中血管生成素配体 (Ang1, Ang2, Ang3) 和受体 (Tie1, Tie2) 的基因表达。从在无血清培养基中孵育的细胞中提取总 mRNA。使用 SYBR Green Master Mix 和特异性引物。使用 ΔCt 法进行相对定量，以内参基因 Hprt1 进行标准化。 [1]
通过免疫沉淀总细胞裂解物，然后使用抗 TIE-2 抗体进行免疫印迹，评估胶质瘤细胞中的 TIE-2 蛋白表达。 [1]

A burr hole is drilled into the skull 2 mm lateral to the bregma after anesthesia. A Hamilton syringe's needle is inserted three millimeters below the surface. A single cell suspension in PBS, containing 2 μL, is gradually injected into the right striatum. 5×10 ³ SMA glioma cells are implanted in female and male VM/Dk mice (house husbandry), while 2×10⁴ GL-261 cells are implanted in female C57Bl/6 mice (Charles River) (n = 10 per group). The mice used are heavier than twenty grams. Systemic treatment with BAY-826 is administered orally at a dose of 100 mg/kg body weight per day, orally with a solvent mixture of 10% ethanol, 40% sorbitol, and 50% water, respectively[1].

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For efficacy studies in syngeneic glioma models, female/male VM/Dk mice were intracranially implanted with SMA-497, SMA-540, or SMA-560 cells. Female C57BL/6 mice were implanted with GL-261 cells. Systemic treatment with BAY-826 was administered by oral gavage at a dose of 100 mg/kg body weight daily, formulated in 10% ethanol, 40% Solutol, and 50% water. Treatment typically started on day 5 or 7 post-implantation. Control animals received the solvent vehicle. [1]
For combination studies with irradiation, mice bearing SMA-497 or SMA-560 tumors received a single dose of 12 Gy whole-brain radiotherapy on day 7 post-implantation, using a customized shielding device and an X-ray unit. BAY-826 or vehicle was administered as described above. [1]
Mice were monitored daily and euthanized upon development of neurological symptoms for survival analysis. A subset of mice was pre-randomized and euthanized when the first animal in the experiment became symptomatic for early histological assessment. [1]
For the TIE-2 pharmacodynamic assay, female CB17/scid mice were treated with a single oral dose of BAY-826 (25, 50, or 100 mg/kg) or vehicle. Three hours after dosing, TIE-2 phosphorylation was induced by intravenous administration of recombinant human ANG-1. Mice were euthanized 15 minutes later, lungs were immediately dissected and snap-frozen for subsequent analysis of TIE-2 phosphorylation by immunoprecipitation and immunoblotting. [1]

The manuscript states that BAY-826 is orally available. [1]
Exposure to BAY-826 in treated mice was confirmed by LC-MS analysis of cardiac blood collected at endpoint. [1]

[1]. J Neurochem. 2017 Jan; 140(1):170-182. doi: 10.1111/jnc.13877. Epub 2016 Dec 12.Novel TIE-2 inhibitor BAY-826 displays in vivo efficacy in experimental syngeneic murine glioma models.

BAY-826 is a secondary carboxamide resulting from the formal condensation of the carboxy group of 3-cyano-5-(pentafluoro-lambda(6)-sulfanyl)benzoic acid with the amino group of 2,4-dimethyl-5-[6-(pyridin-3-yl)-1H-imidazo[1,2-b]pyrazol-1-yl]aniline. It is a potent TIE-2 inhibitor (Kd = 1.6 nM) which displays in vivo efficacy in some murine glioma models. It has a role as an EC 2.7.10.1 (receptor protein-tyrosine kinase) inhibitor and an antineoplastic agent. It is a member of pyridines, an imidazopyrazole, a member of benzamides, a secondary carboxamide, a nitrile, an organofluorine compound and an organosulfur compound.

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BAY-826 is a novel, orally available small-molecule inhibitor of the TIE-2 receptor tyrosine kinase. It was developed from a hit identified in a high-throughput screening campaign, followed by structure-based design and optimization of an imidazopyrazole chemical class. [1]
The study explores TIE-2 inhibition as a therapeutic strategy for glioblastoma, based on the rationale that the angiopoietin/TIE signaling axis may serve as an escape mechanism following anti-VEGF therapy, contributing to tumor recurrence and a more aggressive phenotype. [1]
The data suggest that TIE-2 inhibition by BAY-826 may not directly act on glioma tumor cells but rather affects the host cell compartment (e.g., reducing vessel density, modulating immune cell infiltration). The combination of TIE-2 inhibition with anti-VEGF regimens is proposed as a potentially more promising approach than combination with radiotherapy. [1]

C26H19F5N6OS

558.525680780411

558.53

C, 55.91; H, 3.43; F, 17.01; N, 15.05; O, 2.86; S, 5.74

1448316-08-2

1448316-08-2

71623052

White to yellow solid powder

6.9

89

1

9

4

39

991

0

MPASHPJAIUOWCK-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C26H19F5N6OS/c1-16-8-17(2)24(36-6-7-37-25(36)13-23(35-37)19-4-3-5-33-15-19)12-22(16)34-26(38)20-9-18(14-32)10-21(11-20)39(27,28,29,30)31/h3-13,15H,1-2H3,(H,34,38)

3-cyano-N-[2,4-dimethyl-5-(6-pyridin-3-ylimidazo[1,2-b]pyrazol-1-yl)phenyl]-5-(pentafluoro-lambda6-sulfanyl)benzamide

BAY826; BAY 826; BAY-826

2934.99.03.00

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~100 mg/mL (~179.0 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (1.79 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (1.79 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 1 mg/mL (1.79 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 10.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。