Belnacasan (VX765)

Caspase-4 (Kd < 0.6 nM); Caspase-1 (Ki = 0.8 nM)

VRT-043198 是 VX-765 的口服吸收前药，对 ICE/caspase-1 和 caspase-4 具有有效抑制作用，Ki 分别为 0.8 nM 和小于 0.6 nM。此外，VRT-043198 还可阻断 PBMC 和全血中 IL-1β 的释放，IC50 值分别为 0.67 μM 和 1.9 μM。 [1]

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VRT-43198对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和其他蛋白酶的选择性。我们在体外评估了VRT-043198对ICE/胱天蛋白酶-1和胱天蛋白酶-4的效力及其对胱天蛋白酶三个亚家族代表和其他蛋白酶的选择性，包括颗粒酶B和胰蛋白酶（丝氨酸蛋白酶）以及组织蛋白酶B（半胱氨酸蛋白酶）。如表1所示，VRT-043198对ICE/胱天蛋白酶-1（Ki=0.8nM）和胱天蛋白酶-4（Ki<0.6nM）表现出强烈的抑制作用，效力至少低100倍。

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细胞因子释放[5]
由于有证据表明低温比林参与了IL-1β的产生，我们测量了FCAS患者和对照组PBMC的IL-1β分泌。FCAS患者的PBMC在暴露于LPS 4小时或24小时后分泌的IL-1β水平明显高于未受影响的供体（图1）。在没有LPS处理的情况下释放的IL-1β低于患者和对照组PBMC中的检测水平。暴露于低至0.01 ng/ml的LPS 4小时，对照细胞分泌的IL-1β可以忽略不计，这刺激了FCAS患者PBMC的强劲分泌。在最高浓度LPS（10ng/ml）下释放的IL-1β在FCAS患者的PBMC中高2.1至2.7倍。与ICE/胱天蛋白酶-1参与前IL-1β的加工一致，胱天蛋白酶1抑制剂Belnacasan (VX765)（10μM）显著（>80%）抑制了FCAS和对照细胞释放IL-1β（图1）。
在从单核细胞释放之前，IL-18与IL-1β一样，通过ICE/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1进行蛋白水解成熟，因此还测量了细胞培养基中这种细胞因子的水平。IL-18的释放水平比IL-1β低约100倍。与IL-1β一样，FCAS患者的PBMCs中LPS刺激的IL-18释放明显高于对照组，并且在10μM时受到Belnacasan (VX765)的显著抑制（图2）。同样与IL-1β一样，在没有LPS暴露的情况下，没有可检测到IL-18的组成型释放，而在低LPS浓度下，FCAS细胞有显著的IL-18释放，在正常细胞中不产生IL-18释放。
为了确定FCAS PBMCs的异常是单纯的恶性炎症状态还是胱天蛋白酶-1调节的特定缺陷，我们还测量了暴露于LPS 24小时后细胞培养基中的IL-6和IL-1α（图3）。与IL-1β和IL-18形成鲜明对比的是，与对照组相比，FCAS的PBMCs中IL-6的分泌没有增加。尽管只有两名对照组受试者的结果可用，但FCAS中IL-1α的分泌似乎低于对照组（图3）。在最高浓度的LPS（10ng/ml）下，在存在Belnacasan（VX765）（10μM）的情况下，IL-1α的分泌减少了约50%。有趣的是，ICE/胱天蛋白酶-1敲除小鼠的巨噬细胞中IL-1α的分泌减少（18），表明IL-1α分泌部分依赖于ICE/胱天蛋白酶-1或IL-1β水平。

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Belnacasan (VX765)的抑制效力[5]
由于FCAS中的突变似乎会影响ICE/胱天蛋白酶-1的活性状态，我们测试了Belnacasan（VX765）抑制ICE/胱天蛋白酶-1介导的IL-1β产生的效力是否会因突变而改变。使用来自三名FCAS和三名对照受试者的PBMCs，在暴露于10ng/ml LPS 24小时后测量，确定了Belnacasan（VX765）抑制IL-1β释放的能力Belnacasan（VX765）抑制FCAS（IC50=0.99±0.29μM）和对照（IC50=1.10±0.61μM）受试者外周血单个核细胞中IL-1β的释放，其效力相似（图5）。

在胶原诱导的关节炎小鼠模型中，VX-765 (200 mg/kg) 可抑制 LPS 诱导的 IL-1β 产生约 60%，导致炎症评分呈剂量依赖性且具有统计学显着性降低，并提供有效的关节保护。 [1]在不显着影响后放电长度的情况下，VX-765 通过阻止前脑星形胶质细胞中 IL-1β 的生长来阻断大鼠体内点燃癫痫发生。 [2]在急性癫痫发作的小鼠模型中，VX-765（50 mg/kg-200 mg/kg）通过延迟首次癫痫发作的时间并平均减少癫痫发作次数及其总持续时间来产生抗惊厥作用分别为 50% 和 64%。[3]第三次注射后，VX-765 通过特异性阻断 IL-1 生物合成，显着降低遗传性失神性癫痫 (GAERS) 成年大鼠的棘波放电 (SWD) 累积持续时间和数量，从而导致平均 55%。[4]

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Belnacasan（VX765）在小鼠口服给药时可有效转化为VRT-043198，并抑制脂多糖诱导的细胞因子分泌。此外，VX-765降低了类风湿性关节炎和皮肤炎症模型中的疾病严重程度和炎症介质的表达。这些数据表明，VX-765是一种新型的细胞因子抑制剂，可用于治疗炎症性疾病。[1]

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胶质细胞中IL-1β的增加是实验模型和人类药物难治性癫痫中致痫组织的典型特征。我们在这里表明，白细胞介素转换酶（ICE）的选择性抑制可以通过阻止前脑星形胶质细胞中IL-1β的增加来阻断大鼠的点燃发展，而不会干扰胶质细胞的激活。Belnacasan (VX765)对平均后放电持续时间没有显著影响。在点燃完成和药物洗脱后24小时内，治疗组大鼠无法诱发点燃性癫痫发作。Belnacasan (VX765)对完全点燃的大鼠的癫痫发作或放电后持续时间没有影响。这些数据表明，ICE抑制介导了抗癫痫作用，并表明可以设想特定的抗IL-1β药理学策略来干扰癫痫发生机制。[2]

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在这项研究中，在一种慢性癫痫小鼠模型中检测了Belnacasan (VX765)（一种选择性ICE/caspase-1抑制剂）的抗惊厥活性，该模型具有对一些常见抗惊厥药物无效的自发复发性癫痫活动。此外，在一种小鼠急性癫痫发作模型中研究了这种药物的作用，该模型先前已被证明涉及ICE/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的激活。对暴露于急性癫痫发作或癫痫持续状态后出现慢性癫痫活动的小鼠进行脑电图活动的定量分析，以评估全身给药Belnacasan (VX765)的抗惊厥作用。在癫痫小鼠药理学实验结束时，对脑组织进行组织学和免疫组织化学分析，以评估神经病理学、胶质细胞活化和IL-1β表达以及治疗效果。重复全身给药VX-765以剂量依赖的方式显著降低了小鼠的慢性癫痫活动（12.5-200mg/kg）。在剂量≥50mg/kg时观察到这种作用，并且停药后可以逆转。最大药物效应与抑制活化星形胶质细胞中IL-1β的合成有关。VX-765的相同剂量方案也减少了小鼠的急性癫痫发作，并延迟了发作时间。这些结果支持了一种新的抗惊厥药物干预靶系统，以控制对一些常见抗惊厥药物没有反应的癫痫活动[3]。

监测用对硝基苯胺或氨甲基香豆素 (AMC) 标记的合适底物的水解速率以确定酶是否被抑制：粒酶 B、Ac-IEPD-AMC； caspase-3、-7、-8 和 -9； caspase-4，Ac-WEHD-AMC； caspase-6，Ac-VEID-AMC；和 ICE/caspase-1，suc-YVAD-p-硝基苯胺。反应缓冲液含有 10 mM Tris、pH 7.5、0.1% (w/v) CHAPS、1 mM 二硫苏糖醇和 5% (v/v) 二甲亚砜，与酶和底物在 37 ° 下孵育 10 分钟C。为了提高 caspase-3、-6 和 -9 以及颗粒酶 B 的稳定性，将甘油以 8% (v/v) 的浓度添加到缓冲液中。使用荧光计测量底物水解速率。

通过测定VRT-043198对体外单核细胞释放细胞因子的影响，以及在几种动物模型中口服VX-765对体内细胞因子释放的影响，评估VX-765的治疗潜力。在受细菌产物刺激的健康人外周血单个核细胞和全血培养中，VRT-043198抑制白细胞介素(IL)-1 β和IL-18的释放，但对其他几种细胞因子的释放影响不大，包括IL-1 α、肿瘤坏死因子α、IL-6和IL-8。相比之下，VRT-043198在细胞凋亡模型中几乎没有或没有明显的活性，并且不影响活化的原代T细胞或T细胞系的增殖。小鼠口服VX-765可有效转化为VRT-043198，抑制脂多糖诱导的细胞因子分泌。此外，VX-765降低了类风湿性关节炎和皮肤炎症模型的疾病严重程度和炎症介质的表达。这些数据表明，VX-765是一种新的细胞因子抑制剂，可用于治疗炎症性疾病。[1]
在接触 LPS 之前，用 VX-765 将 PBMC 预处理 30 分钟。

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分泌细胞因子测定[5]
共2×105个细胞/孔（100μl细胞悬浮液）在平底96孔板上分布三份。将50μl的Belnacasan（VX765）（在含有0.2%DMSO的RPMI 1640完全培养基中为40μM）或载体对照加入适当的孔中。在37°C下孵育30分钟后，加入50μl在RPMI 1640完全培养基中稀释的LPS，终浓度为0.001至10ng/ml。将细胞放回37°C的培养箱中。在添加LPS后4小时，从孔中取出75μl上清液，以1500 rpm离心5分钟进行清除，并在4°C下储存，直至进行检测。将细胞放回37°C的培养箱中，直到添加LPS后24小时，此时去除100μl上清液，离心清除，并储存在4°C下。根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒检测上清液中的IL-1β、IL-6、IL-18和IL-1α。

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免疫印迹[5]
共有106个细胞/孔（500μl细胞悬浮液）分布在24孔板中。如上所述，用Belnacasan（VX765）和LPS处理细胞，调节终体积为1ml。加入LPS 4小时后，将所有培养基转移到1.5ml试管中，在4°C下以1000×g离心5分钟，使悬浮细胞沉淀，并去除上清液。为了裂解附着的细胞，向每个孔中加入100μl 1×NuPage样品缓冲液和2-ME，并将平板放置在轨道振荡器上。将孔中的100μl样品缓冲液转移到相应的颗粒中，煮沸15分钟，然后在-20°C下冷冻。在装载到4-12%的Bis-Tris NuPage凝胶上之前，再次煮沸样品，并用NuPage MES运行缓冲液运行。凝胶被转移到硝化纤维过滤器中。过滤器用TBST（0.05%吐温20）+5%干乳吸干。对于IL-1β免疫印迹，印迹在4°C下与1:2000小鼠抗IL-1β初级抗体孵育过夜，然后与1:10000 HRP山羊抗小鼠次级抗体孵育1小时，并用ECL显影。

小鼠：将Belnacasan以单剂量（10、21、43和84 mg/kg）静脉注射到小鼠体内，溶剂为25% Cremophor EL水溶液。在给药前以及给药后0.167、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6和8小时，通过眶后静脉丛采集血样（约0.25-0.3 mL）。采集血样并进行血浆分析。采用高效液相色谱/质谱联用技术测定血浆中Belnacasan和VRT-043198的浓度。使用WinNonlin Pro 4.0.1版软件进行非房室模型分析。

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大鼠：采用体重250-280 g的雄性Sprague-Dawley大鼠。将Belnacasan（25、50或200 mg/kg）溶于20% Cremophor中，连续三天每天一次腹腔注射(ip)给大鼠。第四天，在海马内注射红藻氨酸前45分钟和10分钟分别给大鼠注射Belnacasan。在注射红藻氨酸之前，相应的对照组大鼠注射等量的溶剂。

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点燃发展[2]
将Belnacasan (VX765)（200 mg/kg）溶于20% Cremophor中，连续三天每天一次腹腔注射(ip)给大鼠(n = 12)；对照组大鼠(n = 12)注射等量的溶剂。第四天，在电刺激开始前45分钟，给大鼠注射Belnacasan (VX765)或溶剂。我们采用此治疗方案是因为它能显著保护大鼠免受海马内注射红藻氨酸诱发的癫痫发作（Ravizza等，2006b），并且这种保护作用与抑制前体IL-1β的加工以及随后在海马中生物活性IL-1β的产生有关（Ravizza等，2006b）。在刺激方案中，每90分钟注射VX-765或其溶剂3次，因为之前的实验表明，该药物对红藻氨酸诱发癫痫发作的保护作用可持续90分钟，之后缓慢减弱（Ravizza等，2006b）。在初步实验中，我们也曾以50 mg/kg的剂量（n = 5）给予VX-765，但该剂量并未影响点燃参数（数据未显示）。

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完全点燃的大鼠 [2]
在复测阶段（点燃完成后 24 小时），大鼠（n = 7）连续 3 天接受 Belnacasan (VX765) 治疗，如上所述；第 4 天，给予大鼠一次 Belnacasan (VX765)，45 分钟后，大鼠接受 5 次电刺激以诱发完全点燃的癫痫发作。经过 3 天的药物清除期后，这些大鼠接受与 VX-765 相同的治疗和刺激方案，并给予溶剂对照。

根据本组数据，这些化合物显然是抑制 caspase 1 的重要新工具。然而，这些化合物的组成官能团（例如乙缩醛、醛、腈和酯）在各种条件下均易发生水解。为了充分了解它们作为分子探针乃至临床药物的实用性，全面掌握其稳定性至关重要。因此，我们在中性（pH 7）、酸性（pH 2）和碱性（pH 8）条件下，对化合物 1/Belnacasan (VX765)、2b、3、4 和 16 进行了水溶液降解研究。该研究通过液相色谱-质谱联用（LCMS）分析，在 96 小时内监测各化合物在不同时间点的降解情况（图 3）。前药 1/Belnacasan (VX765) 在水中表现出中等程度的降解，48 小时后超过 50% 的化合物发生分解。这种降解在碱性和酸性条件下均会加剧。相反，活性成分 2b 在中性和酸性条件下均非常稳定，在 pH 8 时降解程度适中。强效化合物 4 在碱性条件下极其稳定，在中性和酸性条件下稳定性中等至良好（72 小时后，两种条件下的降解率均为 50%）。乙酯 3 在中性和酸性条件下异常稳定（未观察到降解），但在碱性条件下 22 小时后完全降解（推测是由于酯的皂化作用）。最后，四唑 16 在所有条件下均表现出抗降解性。有趣的是，这些数据表明，1/Belnacasan (VX765) 作为口服药物的半衰期可能较短，这是由于其在酸性条件下（例如胃部环境）不稳定（在 pH 2 时 3.5 小时后降解 40%）。相比之下，这些数据强烈表明化合物 3 和 16 将是各种检测（基于细胞和体内研究）的合适试剂，即使是活性很高的化合物 4 也能持续超过 24 小时。[https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20229566/]

[1]. J Pharmacol Exp Ther . 2007 May;321(2):509-16.

[2]. Neurobiol Dis . 2008 Sep;31(3):327-33.

[3]. Neurotherapeutics . 2011 Apr;8(2):304-15.

[4]. Neurobiol Dis . 2011 Dec;44(3):259-69.

[5]. J Immunol . 2005 Aug 15;175(4):2630-4.

Belnacasan 是一种二肽。
VX-765 是 ICE/caspase-1 强效选择性竞争性抑制剂 (VRT-043198) 的口服前药。VX-765 目前正处于临床开发阶段，用于治疗炎症和自身免疫性疾病，因为它能阻断对炎症刺激的过敏反应。

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药物适应症
已研究用于治疗炎症性疾病（未具体说明）以及银屑病和银屑病相关疾病。

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作用机制
VX-765 是 ICE/caspase-1 亚家族 caspase 的强效选择性抑制剂。在临床前试验中，VX-765 口服给药于小鼠后可有效转化为 VRT-043198，并抑制 LPS 诱导的细胞因子分泌。结果显示，IL-1β 和 IL-18 的分泌受到抑制，而对其他几种细胞因子（包括 IL-1α、肿瘤坏死因子-α、IL-6 和 IL-8）的释放影响不大。在细胞凋亡模型中也未观察到明显的活性，并且不影响活化的原代 T 细胞或 T 细胞系的增殖。

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药效学
VX-765 是 VRT-043198 的口服吸收前药，VRT-043198 是一种强效且选择性的 ICE/caspase-1 亚家族 caspase 抑制剂。研究表明，该化合物能够降低类风湿性关节炎和皮肤炎症模型中的疾病严重程度和炎症介质的表达，提示其可能对治疗炎症性疾病有效。(S)-1-((S)-2-{[1-(4-氨基-3-氯苯基)-甲酰基]-氨基}-3,3-二甲基-丁酰基)-吡咯烷-2-羧酸((2R,3S)-2-乙氧基-5-氧代-四氢呋喃-3-基)-酰胺 (VX-765) 是 (S)-3-({1-[(S)-1-((S)-2-{[1-(4-氨基-3-氯苯基)-甲酰基]-氨基}-3,3-二甲基-丁酰基)-吡咯烷-2-基]-甲酰基}-氨基)-4-氧代-丁酸的口服吸收前药。 VRT-043198 是一种强效且选择性的白细胞介素转化酶/caspase-1 亚家族 caspase 抑制剂。VRT-043198 对其他 caspase-3 和 -6 至 -9 的选择性高达 100 至 10,000 倍。VX-765 的治疗潜力通过测定 VRT-043198 对体外单核细胞细胞因子释放的影响以及口服 VX-765 在多种动物模型中的体内作用进行评估。在用细菌产物刺激的健康受试者外周血单核细胞和全血培养物中，VRT-043198 抑制了白细胞介素 (IL)-1β 和 IL-18 的释放，但对其他几种细胞因子（包括 IL-1α、肿瘤坏死因子-α、IL-6 和 IL-8）的释放几乎没有影响。相比之下，VRT-043198 在细胞凋亡模型中几乎没有或完全没有可观察到的活性，并且不影响活化的原代 T 细胞或 T 细胞系的增殖。VX-765 经口服给药给小鼠后可有效转化为 VRT-043198，并抑制脂多糖诱导的细胞因子分泌。此外，VX-765 可降低类风湿性关节炎和皮肤炎症模型中的疾病严重程度和炎症介质的表达。这些数据表明，VX-765 是一种新型细胞因子抑制剂，可用于治疗炎症性疾病。[1]

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白细胞介素 (IL)-1β 在颞叶癫痫啮齿动物模型的边缘系统癫痫发作机制中起着至关重要的作用。我们研究了在遗传性失神癫痫 (GAERS) 大鼠出现棘慢波放电 (SWD) 的过程中，IL-1β 信号通路是否被激活。此外，我们研究了抑制GAERS中IL-1β生物合成是否会影响SWD活动。我们采用免疫细胞化学方法，检测了出生后第14天（PN14）、第20天（PN20）和第90天（PN90）GAERS以及同龄非癫痫对照Wistar大鼠前脑中IL-1β的表达和胶质细胞活化情况。在PN14的GAERS中，SWD尚未出现，IL-1β免疫染色未检测到，星形胶质细胞和小胶质细胞表现出与对照Wistar大鼠相似的静息表型。在9只PN20的GAERS中，有3只在体感皮层的活化星形胶质细胞中观察到IL-1β；该细胞因子的表达与未成熟型SWD的发生相关。在所有成年PN90 GAERS小鼠中，当成熟的SWD形成时，在体感皮层的反应性星形胶质细胞中观察到IL-1β的表达，但在邻近皮层区域或皮层外区域未观察到。GAERS小鼠体感皮层中c-fos的激活与年龄相关，在PN90小鼠中达到最高水平；在PN20和PN90 GAERS小鼠的某些丘脑核团中也观察到c-fos的诱导表达。在PN90 GAERS小鼠中，通过连续4天全身性给予特异性ICE/Caspase-1阻断剂抑制IL-1β的生物合成，可显著减少SWD的数量和持续时间。这些结果表明，在GAERS小鼠SWD发作时，体感皮层的反应性星形胶质细胞中IL-1β的表达被诱导。在该模型中，IL-1β具有促癫痫特性，因此它可能在失神发作的机制中发挥作用。[4]家族性寒冷自身炎症综合征（FCAS）及其相关的自身炎症性疾病，如Muckle-Wells综合征和新生儿起病的多系统炎症性疾病，均以CIAS1基因突变为特征。CIAS1基因编码冷蛋白（cryopyrin），一种参与IL转化酶/caspase-1激活的衔接蛋白。据推测，冷蛋白突变会导致caspase-1依赖性促炎细胞因子IL-1β和IL-18的异常分泌。本研究检测了家族性腺瘤性关节炎（FCAS）患者外周血单核细胞（PBMC）中的细胞因子分泌情况，发现IL-1β和IL-18的分泌对脂多糖（LPS）刺激均表现出显著的过度反应，但未发现这些细胞因子的基础分泌增加，也未发现基础或刺激后前体IL-1β水平的改变。口服活性IL转化酶/caspase-1抑制剂VX-765对FCAS患者和对照组LPS刺激细胞中IL-1β的分泌抑制效力相当。这些结果进一步将冷吡啉基因突变与caspase-1异常激活联系起来，并支持在自身炎症性疾病中开展caspase-1抑制剂（如VX-765）的临床试验。[5]

C24H33CLN4O6

508.99

508.208

C, 56.63; H, 6.53; Cl, 6.97; N, 11.01; O, 18.86

273404-37-8

11398092

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

779.0±60.0 °C at 760 mmHg

424.9±32.9 °C

0.0±2.7 mmHg at 25°C

1.589

0.83

147.04

3

7

8

35

818

4

ClC1=C(C([H])=C([H])C(=C1[H])C(N([H])[C@]([H])(C(N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(N([H])[C@@]1([H])C([H])([H])C(=O)O[C@@]1([H])OC([H])([H])C([H])([H])[H])=O)=O)C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=O)N([H])[H]

SJDDOCKBXFJEJB-MOKWFATOSA-N

InChI=1S/C24H33ClN4O6/c1-5-34-23-16(12-18(30)35-23)27-21(32)17-7-6-10-29(17)22(33)19(24(2,3)4)28-20(31)13-8-9-15(26)14(25)11-13/h8-9,11,16-17,19,23H,5-7,10,12,26H2,1-4H3,(H,27,32)(H,28,31)/t16-,17-,19+,23+/m0/s1

(2S)-1-[(2S)-2-[(4-amino-3-chlorobenzoyl)amino]-3,3-dimethylbutanoyl]-N-[(2R,3S)-2-ethoxy-5-oxooxolan-3-yl]pyrrolidine-2-carboxamide

Belnacasan; VX 765; VX765; Belnacasan (VX-765); Belnacasan (VX765); Belnacasan [USAN]; (S)-1-((S)-2-(4-amino-3-chlorobenzamido)-3,3-dimethylbutanoyl)-N-((2R,3S)-2-ethoxy-5-oxotetrahydrofuran-3-yl)pyrrolidine-2-carboxamide; VX-765

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~100 mg/mL (~196.5 mM)
Ethanol: ~100 mg/mL (~196.5 mM)

配方 1 中的溶解度: 3.33 mg/mL (6.54 mM) in 15% Cremophor EL + 85% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.91 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.91 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 4 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.91 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

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配方 5 中的溶解度: 2% DMSO+30% PEG 300+ddH2O: 5mg/mL

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配方 6 中的溶解度: 5 mg/mL (9.82 mM) in 50% PEG300 + 50% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液; 超声助溶.
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。