Benzbromarone   中文名称: 苯溴马隆

URAT1 (urate transporter 1); non-competitive inhibitor of XO/xanthine oxidase; GLUT9; CYP2C9
The primary therapeutic target of Benzbromarone is Human Uric Acid Transporter 1 (hURAT1, SLC22A12). By non-competitively inhibiting URAT1 on the apical membrane of renal proximal tubular cells, it blocks the reabsorption of uric acid, thereby promoting its excretion. Additionally, Benzbromarone is a potent inhibitor of Cytochrome P450 2C9 (CYP2C9) and also inhibits CYP2C19 and AKR1C family members. It also shows activating/agonistic effects on Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARα and PPARγ).
Benzbromarone targets CYP2C9 (Ki = 19.3 ± 7.5 nM, competitive inhibition) [1]
Benzbromarone affects mitochondrial targets: inhibits electron transport chain complexes, uncouples oxidative phosphorylation, and inhibits mitochondrial β-oxidation (IC50 for β-oxidation inhibition ~2 μmol/L) [2]

体外活性：苯溴马隆（20 μM）可使分离的大鼠肝细胞线粒体膜电位降低 81%。苯溴马隆可降低分离的大鼠肝线粒体中 L-谷氨酸的状态 3 氧化和呼吸控制比率，IC50 < 1 μM。苯溴马隆（50 μM）可解偶联氧化磷酸化，并增加分离的大鼠肝细胞的耗氧量，其作用起始浓度为 10 μM。苯溴马隆还以剂量依赖的方式抑制酸溶性 β-氧化产物的生成，IC50 为 2 μM。苯溴马隆（100 μM）可抑制电子传递链，并解偶联分离的大鼠肝线粒体中的氧化磷酸化。苯溴马隆（1 μM）可导致 HepG2 细胞中活性氧（ROS）生成呈浓度依赖性增加。苯溴马隆（100 μM）可显著增大分离的大鼠肝线粒体体积。苯溴马隆与HepG2细胞中细胞色素c泄漏至胞质有关。苯溴马隆（100 μM）可使大鼠肝细胞凋亡率达到11%。苯溴马隆在浓度低至10 nM时即可显著降低氧嘌呤醇的摄取，并在1 μM时完全阻断其摄取。在表达人OCTN1的HEK293细胞中，苯溴马隆（1 μM）对OCTN1的典型底物（四乙基铵）和OCTN2的典型底物（肉碱）的摄取量分别达到对照组的96.7%和111%。在表达 URAT1 的卵母细胞中，苯溴马隆在 50 μM 浓度下可完全抑制尿酸的摄取，IC50 值小于 0.1 μM。苯溴马隆通过苯并呋喃环的连续羟基化生成儿茶酚而被激活，儿茶酚随后可进一步氧化为能够与蛋白质加合的活性醌中间体。[1,2]体外研究表明，苯溴马隆是 hURAT1 的高效抑制剂，IC₅₀ 值为 26 nM。其主要 I 期代谢产物 6-羟基苯溴马隆保留了抑制活性，IC₅₀ 值为 189 nM。在代谢酶方面，苯溴马隆对CYP2C9和CYP2C19均具有强效抑制作用，IC₅₀分别为0.016 μM和18.2 μM。此外，它还具有直接清除超氧自由基的活性，且该活性与其降低尿酸的作用无关。体外实验表明，苯溴马隆是一种强效的CYP2C9抑制剂，其Ki值为19.3 ± 7.5 nM，该值是通过以(S)-华法林为底物，并在重组酶系统中测定7-OH-华法林的生成量而确定的。苯溴马隆的pKa值为4.5 ± 0.6，log P值为6.6 ± 0.9，log D7.0值为4.4。非卤代类似物具有更高的pKa值和更低的亲和力，这支持了阴离子基团在结合中的作用。 [1]在分离的大鼠肝细胞中，苯溴马隆（20 μmol/L）使线粒体膜电位较对照组降低了81%。在分离的大鼠肝线粒体中，苯溴马隆以浓度依赖的方式降低了L-谷氨酸和琥珀酸的3期氧化和呼吸控制率（RCR）。两种底物RCR降低50%的浓度均低于1 μmol/L。在0.1 μmol/L时，L-谷氨酸的RCR为6.3 ± 1.9，对照组为6.5 ± 1.0；在1 μmol/L时，RCR为2.0 ± 0.3；在10 μmol/L时，RCR为1.0 ± 0.0。苯溴马隆还能解偶联分离的肝细胞中的氧化磷酸化，在寡霉素存在的情况下，浓度从 10 μmol/L 起即可增加耗氧量。苯溴马隆抑制线粒体棕榈酸的 β-氧化，IC50 值约为 2 μmol/L；在 50 μmol/L 浓度下，活性为 0.26 ± 0.06 nmol/min/mg，而对照组为 0.61 ± 0.08。酮体生成不受影响。苯溴马隆在 0.1 μmol/L 浓度下即可增加 HepG2 细胞中活性氧 (ROS) 的产生。在 100 μmol/L 浓度下，它可诱导线粒体肿胀（通透性转换），这可通过流式细胞术的前向散射进行测量。免疫细胞化学结果显示，浓度为 100 μmol/L 的苯溴马隆可导致 HepG2 细胞线粒体释放细胞色素 c 至细胞质。在分离的大鼠肝细胞中，100 μmol/L 的苯溴马隆可诱导细胞凋亡（Hoechst 33342 染色显示 11% 的细胞核为凋亡细胞）和坏死（Annexin V/PI 染色显示仅 11% 的细胞为活细胞）。100 μmol/L 苯溴马隆处理后，细胞 ATP 含量降至对照组的 18 ± 5%。抗氧化剂抗坏血酸（250 μmol/L）可减轻但不能完全阻止苯溴马隆诱导的细胞凋亡。[2]

以苯溴马隆（BM）为阳性对照，评价了JNS4在体内的降尿酸作用。采用氧酸钾和次黄嘌呤诱导KM小鼠高尿酸血症，雷西纳德作为另一种阳性对照药物。如图7所示，模型组血清尿酸水平（950.4 μM）显著升高（P < hr>）。体内实验表明，苯溴马隆能有效降低动物模型的血清尿酸水平。在血管紧张素II诱导的高血压大鼠模型中，口服苯溴马隆可显著降低肾脏中的氧化应激标志物（如高级氧化蛋白产物），表明其具有直接的抗氧化作用。在肺动脉高压大鼠模型中，长期使用苯溴马隆（靶向TMEM16A）可逆转血管重塑。在鹌鹑中，口服苯溴马隆的Cmax为44.01 μg/mL，AUC为220.94 h·μg/mL。

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CYP抑制方法（微粒体测定）：本研究采用人肝微粒体研究苯溴马隆的代谢活化。为鉴定负责其生物活化的酶，使用特异性化学抑制剂（例如，CYP3A4抑制剂为酮康唑）。孵育在37℃下进行，并加入NADPH生成系统。然后通过HPLC-MS/MS分析样品，以检测活性代谢物，例如环氧化物衍生的N-乙酰半胱氨酸（NAC）结合物。

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CYP2C9抑制试验（Ki测定）：将重组人CYP2C9（20 pmol）与浓度为2.0至40 μM的(S)-华法林、三种浓度的抑制剂（低于、等于或高于Ki）、1000 U过氧化氢酶在1 mL 50 mM KPi缓冲液（pH 7.4）中于37°C孵育。加入1 μmol NADPH启动反应，30-40分钟后用0.6 mL丙酮终止反应。加入d5-7-OH-华法林（0.1 nmol）作为内标。提取代谢物并进行衍生化，然后通过GC/MS进行分析。使用非线性回归将数据拟合到竞争性抑制模型。(S)-华法林的Km值为4.2 ± 2.6 μM，Vmax值为22.6 ± 0.9 pmol/min/pmol CYP2C9。[1] pKa测定：将10或100 nmol的苯溴马隆加入到1 mL pH值介于2.0和12.0之间的0.1 M KPi缓冲液中。在355-360 nm波长范围内（酚盐形式）测量紫外-可见吸收值。使用GraphPad Prism软件绘制吸光度与pH值的关系图，并用S型函数进行拟合。 [1]
分离肝细胞线粒体膜电位测定： 将新鲜分离的大鼠肝细胞用 40 nM [3H]-四苯基溴化膦标记，然后接种于 96 孔板中，并在 37°C 下与测试化合物孵育 1 小时。用 Unifier GF/B 收集细胞，与闪烁液混合，并计数 3H 放射性。结果以对照组（1% DMSO）的百分比表示。[2]
线粒体耗氧量测定： 使用带有 Clark 型氧电极的 1 mL 反应室，在 30°C 下通过极谱法监测耗氧量。使用的底物为 20 mmol/L L-谷氨酸或琥珀酸。将测试化合物溶解于 DMSO 中，并按指定浓度添加。测定了状态 3、状态 4 和呼吸控制率 (RCR)。对于解偶联试验，将分离的大鼠肝细胞 (1×10^6 个细胞) 用寡霉素 (5 μg/mL) 处理以抑制 ATPase，然后加入测试化合物，并测量耗氧量。[2]
线粒体 β-氧化试验： 在测试化合物存在下，测定分离的大鼠肝线粒体由 [1-14C]棕榈酸生成 14C 酸溶性 β-氧化产物的量。孵育按所述方法进行，并分析上清液的放射性。[2]
酮体生成试验： 使用冻融线粒体和乙酰辅酶 A 生成系统测定酮体的生成。通过酶催化反应测定 NADH 的变化来确定上清液中的乙酰乙酸。 [2]
酰基辅酶A脱氢酶和β-酮硫解酶活性测定： 将冻融后的线粒体用5%胆酸处理以破坏其膜结构，然后稀释100倍。采用分光光度法测定酰基辅酶A脱氢酶活性；β-酮硫解酶活性也采用类似方法测定。[2]
活性氧（ROS）测定： 将汇合的HepG2细胞接种于96孔板中，并在不含血清的DMEM培养基中加入5 mmol/L 2,7-二氯荧光素二乙酸酯进行孵育。孵育后，用PBS缓冲液替换培养基，并在室温下使用酶标仪测量细胞荧光强度（激发波长λex=485 nm，发射波长λem=520 nm）。 [2]
线粒体肿胀测定： 将大鼠肝线粒体（1 mg 蛋白）与 200 μL MSM 缓冲液混合，并加入待测化合物。采用流式细胞仪 (FACScalibur) 测量肿胀程度，以平均前向散射光强度表示。以 CaCl2 (1 mmol/L) 作为阳性对照，环孢素 A (2 μmol/L) 作为抑制剂。[2]
细胞色素 c 释放免疫细胞化学： 将生长在聚赖氨酸包被的腔室载玻片上的 HepG2 细胞用待测化合物处理 8 小时。使用抗细胞色素 c 抗体和 Cy3 标记的抗绵羊 IgG 抗体对细胞色素 c 进行显色。[2]

方法（PPAR 转录激活分析）：将 NIH/3T3 细胞接种于 24 孔板中。20 小时后，将编码 PPAR（α 或 γ）配体结合域与 GAL4 DNA 结合域融合的质粒以及荧光素酶报告基因转染至细胞中。转染后，用苯溴马隆（0.001–100 μM）或对照溶剂（0.1% DMSO）处理细胞 48 小时。然后裂解细胞，并使用发光仪测量荧光素酶活性以量化 PPAR 激活。

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肝细胞活力和凋亡/坏死分析： 将新鲜分离的大鼠肝细胞培养于聚赖氨酸包被的载玻片上，并用测试化合物处理 8 小时。对于 Hoechst 33342 核染色，将细胞在室温下用 50 μmol/L Hoechst 33342 孵育 30 分钟，并通过荧光显微镜观察。凋亡细胞通过染色质浓缩和/或断裂进行鉴定。对于 Annexin V/PI 染色，将细胞在室温下用 Annexin V-Alexa Fluor 488 和碘化丙啶（终浓度 1.5 μg/L）染色 15 分钟，然后通过流式细胞术进行分析。对活细胞（未染色）、早期凋亡细胞（仅 Annexin V 染色）和晚期凋亡/坏死细胞（双重染色）进行定量。[2]
细胞 ATP 含量测定： 将新鲜分离的大鼠肝细胞（200,000 个细胞/孔）接种于 12 孔板中，并用测试化合物处理 8 小时。用 PBS 洗涤细胞，悬浮于 1 mL 水中，速冻，并储存于 -80°C。用沸水提取 ATP，并使用荧光素-荧光素酶试剂盒，通过与 ATP 标准曲线比较来测定其浓度。[2]

mg/kg BM；口服
KM 小鼠高尿酸血症模型

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方法（大鼠药代动力学）：通常使用雄性 Sprague-Dawley 大鼠。为确定绝对生物利用度，将动物分为两组：静脉注射 (IV) 组和口服 (PO) 组。对于 PO 组，通过灌胃给予苯溴马隆混悬液。在不同时间点（例如，给药后 0、0.5、1、2、4、6、8 和 24 小时）采集血样。采用 LC-MS/MS 法测定血浆浓度，并使用非房室模型分析计算 Tmax、Cmax 和 AUC 等参数。

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在动物模型中，苯溴马隆被迅速吸收，鹌鹑口服达峰时间（Tmax）约为1.56小时。其口服生物利用度中等至良好（大鼠F~0.58）。消除半衰期（T1/2）相对较短；在鹌鹑中，消除半衰期（K10_HL）约为2.06小时。苯溴马隆在肝脏中广泛代谢，主要通过羟基化（CYP2C9）生成6-羟基苯溴马隆，并进一步生物活化生成活性环氧化物中间体。

肝毒性
据报道，苯溴马隆治疗期间发生肝功能障碍的概率极低，临床试验中仅有0.1%的患者出现异常。此外，苯溴马隆曾广泛使用多年，直到20世纪80年代末才出现肝毒性报道。此后，有报道称苯溴马隆治疗期间出现急性肝损伤和急性肝衰竭。肝损伤通常在治疗后1至6个月出现，表现为黄疸和乏力，通常伴有肝细胞酶升高。免疫过敏症状（皮疹、发热）不常见。一些病例报告显示自身抗体水平较低，肝脏组织学检查显示慢性活动性肝炎，尤其是在未及时停用苯溴马隆的情况下。症状通常在停药后1至3个月内消退。苯溴马隆引起的肝损伤与苯扎氯铵（一种结构相关的药物，曾用于治疗外周血管疾病，但因肝毒性问题而撤市）引起的肝损伤相似。概率评分：B（极有可能，但罕见，导致具有临床意义的肝损伤）。苯溴马隆的主要毒性问题是肝毒性（肝损伤）。由于有报道称其会导致严重的肝损伤，包括死亡病例，该药于2003年从欧洲市场撤市。其机制与CYP3A4和CYP2C9代谢产生的活性代谢物（环氧化物和醌类中间体）有关，这些代谢物可以与蛋白质共价结合。动物研究表明，苯溴马隆可诱导肝肥大和过氧化物酶体增殖（通过激活PPARα）。意外摄入会导致中毒。 GHS 分类表明急性毒性类别为 3 类（H301：吞咽有毒）。

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肝毒性： 苯溴马隆 与患者的肝损伤有关。体外实验表明，该化合物是一种线粒体毒素：它能降低线粒体膜电位（在浓度为20 μmol/L时，大鼠肝细胞线粒体膜电位降低81%），抑制线粒体呼吸（浓度低于1 μmol/L时，呼吸控制率降低50%），解偶联氧化磷酸化，抑制β-氧化（IC50约为2 μmol/L），诱导活性氧（ROS）生成（在HepG2细胞中，浓度为0.1 μmol/L时即可诱导ROS生成），触发线粒体通透性转换（浓度为100 μmol/L时出现线粒体肿胀），导致细胞色素c释放，并诱导分离的大鼠肝细胞发生凋亡和坏死（浓度为100 μmol/L时，存活细胞比例为11%）。在浓度为100 μmol/L时，细胞ATP含量降至对照组的18%。该化合物的毒性与结构相关；单独的苯并呋喃核心结构本身无毒。呋喃环上的侧链是必需的。[2]
药物相互作用：苯溴马隆与抗凝血剂(S)-华法林合用会增加出血风险，这是由于苯溴马隆对CYP2C9代谢清除华法林具有对映选择性抑制作用。[1]

[1]. Drug Metab Dispos.2003 Jul;31(7):967-71;
[2]. Hepatology.2005 Apr;41(4):925-35.

苯溴马隆是一种1-苯并呋喃类化合物，其C-2位和C-3位分别被乙基和3,5-二溴-4-羟基苯甲酰基取代。它是一种CYP2C9抑制剂，用于治疗痛风。它也是一种促尿酸排泄药物。苯溴马隆属于1-苯并呋喃类化合物，是一种芳香酮。其结构与2,6-二溴苯酚相似。苯溴马隆曾被用于基础科学研究和临床试验，用于治疗心力衰竭、高尿酸血症、慢性肾脏病、肾功能障碍、痛风和无症状性高尿酸血症。苯溴马隆是一种非嘌呤类黄嘌呤氧化酶抑制剂，用于治疗痛风，但由于有急性肝损伤和死亡的报道，它从未在美国获准使用。它是一种促尿酸排泄药物，其作用机制是通过增加尿酸清除率。它用于治疗痛风。

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背景： 苯溴马隆（CAS# 3562-84-3）是一种促尿酸排泄剂，可减少近端肾小管对尿酸的重吸收。其结构包含一个苯并呋喃环，带有一个2-乙基和一个3-(3,5-二溴-4-羟基苯甲酰基)。其结构与胺碘酮和苯扎罗酮相似。[1][2]
CYP2C9抑制机制： 苯溴马隆与CYP2C9具有高亲和力结合。所提出的结合模式包括阴离子（生理pH值下的酚盐离子）与活性位点中的阳离子位点（可能是Arg105或Arg108）的相互作用、疏水相互作用，以及苯并呋喃环在6位靠近血红素的定位，以便在其上进行代谢。[1]
代谢：苯溴马隆的主要代谢产物位于苯并呋喃杂环的6位。[1]
临床意义：已有苯溴马隆及其类似物苯扎罗酮引起肝毒性的报道，有时甚至导致死亡。这种毒性归因于线粒体功能障碍。[2]

C17H12BR2O3

424.08

421.915

C, 48.15; H, 2.85; Br, 37.68; O, 11.32

3562-84-3

Benzbromarone-d5

2333

White to off-white solid powder

1.7±0.1 g/cm3

514.1±50.0 °C at 760 mmHg

161 - 163ºC

264.7±30.1 °C

0.0±1.4 mmHg at 25°C

1.673

6.64

50.44

1

3

3

22

405

0

O=C(C1=CC(Br)=C(O)C(Br)=C1)C2=C(CC)OC3=CC=CC=C23

WHQCHUCQKNIQEC-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H12Br2O3/c1-2-13-15(10-5-3-4-6-14(10)22-13)16(20)9-7-11(18)17(21)12(19)8-9/h3-8,21H,2H2,1H3

(3,5-dibromo-4-hydroxyphenyl)(2-ethylbenzofuran-3-yl)methanone

L2214;MJ10061; L 2214; MJ-10061; L-2214; L2214-Labaz; Narcaricin; Normurat; Benzbromarone; MJ 10061

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.90 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.08 mg/mL (4.90 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.90 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。