BI 2536

PLK1 (IC50 = 0.83 nM); Plk2/Snk (IC50 = 3.5 nM); Plk3/Fnk (IC50 = 9 nM); BRD4 (IC50 = 25 nM)
Polo-like Kinase 1 (PLK1) (Ki = 0.83 nM; IC50 = 1.3 nM for PLK1 kinase activity) [1]
- PLK1 (IC50 = 0.8 nM) and Bromodomain-containing Protein 4 (BRD4) (IC50 = 3.1 μM for BRD4(1) bromodomain binding) [2]
- PLK1 (Ki = 0.6 nM; IC50 = 1.0 nM in kinase assay) [3]

BI 2536 对 Plk2 和 Plk3 活性的阻断程度稍小，IC50 分别为 3.5 nM 和 9.0 nM。在 HeLa 细胞中，10-100 nM 的 BI 2536 处理会导致有丝分裂中心体处 γ-微管蛋白的募集和 Apc6 的磷酸化受阻，抑制染色体臂上的粘连蛋白释放，诱导单极纺锤体，以及一系列作用。已知依赖于 Plk1 的其他有丝分裂过程。 BI 2536 处理导致 HeLa 细胞停滞在 G2/M 期，随后出现亚 G1 DNA 峰，表明 DNA 断裂和凋亡，并以浓度依赖性方式积累切割的 PARP p85 片段。 BI 2536 可抑制一组 32 种人类癌细胞系的生长，EC50 为 2-25 nM，同时阻断呈指数增长的 hTERT-RPE1、人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 和正常大鼠肾 (NRK) 细胞的增殖EC50 为 12-31 nM。 BI 2536 抑制 Plk1 会降低未分化甲状腺癌 (ATC) 细胞（例如 CAL62、OCUT-1、SW1736、8505C 和 ACT-1）的生长和活力，EC50 值为 1.4-5.6 nM。激酶测定：重组人 Plk1（残基 1-603）通过杆状病毒表达系统表达为 N 末端、GST 标记的融合蛋白，并通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。 Plk1 的酶活性测定在连续稀释的 BI 2536 存在下进行，并以 20 ng 重组激酶和 10 μg 牛乳酪蛋白为底物。激酶反应在最终体积 60 μL 中于 30 °C 进行 45 分钟（15 mM MgCl2、25 mM MOPS [pH 7.0]、1 mM DTT、1% DMSO、7.5 mM ATP、0.3 μCi γ-33P-ATP ）。添加 125 μL 冰冷的 5% TCA 终止反应。将沉淀物转移至 Multi-Screen 混合酯纤维素过滤板后，用 1% TCA 洗涤板并进行放射定量。剂量反应曲线用于计算IC50值。细胞测定：将细胞（HeLa、A43、SKOV-3、HT-29、K562、A549、Saos-2、MCF7、HCT116、COLO 205、Hep G2、Raji 和 PC-3 细胞等）暴露于不同浓度BI 2536 24 和 72 小时。通过在荧光分光光度计中测量阿拉玛蓝染料转化来评估细胞生长。为了测定培养物的 DNA 含量，将细胞悬浮液固定在 80% 乙醇中，用 0.25% Triton X-100 的 PBS 溶液处理 5 分钟，并与 0.1% RNase 和 10 μg/mL 碘化丙啶 (PI) 的 PBS 溶液一起孵育室温 20 分钟。细胞周期概况通过流式细胞术分析确定。

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用BI 2536处理HeLa、U2OS和A549细胞可诱导有丝分裂停滞，表现为纺锤体形成异常、染色体未分离及组蛋白H3（Ser10）磷酸化水平升高。有丝分裂停滞的IC50值分别为5 nM（HeLa）、7 nM（U2OS）和10 nM（A549）。延长暴露时间（24-48小时）可导致细胞凋亡，caspase-3激活和膜联蛋白V染色实验证实了这一结果[1]
- BI 2536具有双抑制活性：强效抑制PLK1激酶活性（IC50 = 0.8 nM），弱结合BRD4溴结构域（BRD4(1) IC50 = 3.1 μM，BRD4(2) IC50 = 5.2 μM）。在浓度高达10 μM时，它不会显著抑制其他BET家族成员（BRD2、BRD3）。在癌细胞系（MDA-MB-231、MCF-7、HCT116）中，它以2.5-8.3 nM的IC50值抑制细胞增殖，这一效果与PLK1抑制相关，而非BRD4结合[2]
- 在55种人类癌细胞系（包括肺癌、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌）中，BI 2536以0.5-10 nM的IC50值抑制细胞增殖。它在HCT116和PC-3细胞中诱导G2/M期停滞，随后引发凋亡。蛋白质印迹分析显示PLK1底物（Cdc25C、周期蛋白B1）的磷酸化水平降低，切割型PARP水平升高[3]

每周一次或两次静脉注射 BI 2536 在多种异种移植模型中非常有效，通过有丝分裂停滞抑制细胞增殖，并随后诱导肿瘤细胞死亡，具有可接受的耐受性。每周一次或两次 50 mg/kg 的 BI 2536 显着抑制 HCT 116 异种移植物的生长，T/C 分别为 15% 和 0.3%。每周两次的 BI 2536 治疗也能在 BxPC-3 和 A549 模型中实现良好的肿瘤生长，T/C 分别为 5% 和 14%。

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在携带HCT116结肠癌异种移植物的裸鼠中，BI 2536以20 mg/kg的剂量每周静脉注射一次，连续3周，可显著抑制肿瘤生长（肿瘤生长抑制率=78%；与溶媒组相比p < 0.01）。治疗组小鼠的肿瘤样本显示有丝分裂象增加（停滞在中期），Ki-67染色（增殖标志物）减少[3]
- 在U2OS骨肉瘤异种移植物模型中，BI 2536以15 mg/kg的剂量每周静脉注射两次，连续4周，实现了65%的肿瘤生长抑制。治疗期间未观察到显著的体重减轻或器官毒性[3]

使用杆状病毒表达系统将重组人 Plk1（残基 1-603）表达为 N 末端、GST 标记的融合蛋白后，使用谷胱甘肽-琼脂糖通过亲和层析进行纯化。在进行 Plk1 酶活性测定时，会使用系列稀释的 BI 2536 以及 20 ng 重组激酶和 10 μg 来自牛奶的酪蛋白作为底物。最终体积为 60 μL 用于激酶反应，在 30 °C 下进行 45 分钟（15 mM MgCl2、25 mM MOPS [pH 7.0]、1 mM DTT、1% DMSO、7.5 mM ATP、0.3 μCi γ-33P-ATP）。最后添加 125 μL 冰冷的 5% TCA 以终止反应。将沉淀物转移至 Multi-Screen 混合酯纤维素过滤板后，对板进行 1% TCA 洗涤和辐射定量。 IC50 值是使用剂量反应曲线计算的。

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PLK1激酶实验：重组PLK1催化结构域与肽底物（KKT(p)LRR）和ATP共同孵育。将BI 2536以系列浓度（0.1 nM至1 μM）加入，通过闪烁邻近分析法检测磷酸化底物，以测定激酶活性。反应在30°C下进行60分钟，从剂量-反应曲线计算IC50值[1]
- PLK1和BRD4双靶点实验：PLK1激酶活性检测中，重组PLK1与ATP和荧光肽底物混合，25°C孵育45分钟后，通过荧光共振能量转移（FRET）定量活性。BRD4溴结构域结合实验中，BI 2536与重组BRD4(1)或BRD4(2)结构域及荧光标记的乙酰化组蛋白肽共同孵育，通过荧光偏振法检测肽结合竞争情况，确定结合亲和力（IC50）[2]
- PLK1 Ki值测定：在不同ATP浓度（0.5-10 μM）和固定BI 2536浓度下进行激酶反应。基于ATP结合的竞争性抑制，使用双倒数作图法和非线性回归分析计算Ki值[3]

在细胞增殖测定中，添加不同浓度的 BI 2536 (10 nM-1 μM) 并孵育 72 小时。通过在荧光分光光度计中测量阿拉玛蓝染料转化来测量细胞的生长。根据剂量反应曲线拟合，可以推断出细胞生长受到 50% 抑制的有效浓度 (EC50)[3]。

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有丝分裂停滞实验：HeLa、U2OS和A549细胞接种到96孔板（5×103个细胞/孔），过夜孵育。加入BI 2536（浓度0.1-100 nM），细胞培养16小时。用甲醛固定细胞，透化处理后，用抗磷酸化组蛋白H3（Ser10）抗体和DAPI染色。通过免疫荧光显微镜计数有丝分裂细胞（磷酸化H3阳性）[1]
- 细胞增殖实验：癌细胞系接种到384孔板（2×103个细胞/孔），用BI 2536（0.01-100 nM）处理72小时。基于线粒体脱氢酶活性的比色法评估细胞活力，使用四参数逻辑回归从剂量-反应曲线推导IC50值[2]
- 凋亡和细胞周期实验：HCT116细胞用BI 2536（5 nM）处理24-48小时。细胞周期分析中，收集细胞、固定、碘化丙啶染色，通过流式细胞术分析。凋亡检测中，用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶染色细胞，随后进行流式细胞术分析。通过蛋白质印迹检测切割型PARP、caspase-3和PLK1底物蛋白[3]

Mice: Subcutaneous injection of 2×10 6 , 1×10 6 , or 1×10 7 cells into each mouse's flank results in the grafting of HCT 116 colon-carcinoma, NCI-H460, or A549 lung-carcinoma cells into female BomTac:NMRI-Foxn1nu mice. Animals are paired into groups of ten mice each for treatment and control once tumors have grown to a volume of about 50 mm 3 . Treatment is not started in regression experiments until the mean tumor volume reaches 500 mm 3 . The recommended dosage and schedule for intravenous injection of BI 2536 are administered into the tail vein. Ten milliliters for every kilogram of body weight is the dosage. Three times a week, calipers are used to determine tumor volumes. The following formula is used to convert the results to tumor volume (mm 3 ): length×width 2 ×π/6. On the same days, the mice's weight is ascertained as a measure of tolerability. In a one-sided (decreasing) exact Wilcoxon test, the treatment group and the vehicle control group are compared for statistical analysis.

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Xenograft tumor model: Female nude mice (6-8 weeks old) were subcutaneously injected with HCT116 (5×106 cells) or U2OS (1×107 cells) cells into the right flank. When tumors reached 100-150 mm3, mice were randomized into treatment (n=8) and vehicle control (n=8) groups. BI 2536 was dissolved in a mixture of PEG400 and saline (1:1 v/v) and administered intravenously via tail vein. Dosing regimens included 20 mg/kg once weekly for 3 weeks (HCT116) and 15 mg/kg twice weekly for 4 weeks (U2OS). Tumor volume was measured twice weekly using calipers, and body weight was monitored throughout the study [3]

[1]. The Small-Molecule Inhibitor BI 2536 Reveals Novel Insights into Mitotic Roles of Polo-like Kinase 1. Curr Biol. 2007 Feb 20;17(4):304-15.

[2]. BRD4 Structure-Activity Relationships of Dual PLK1 Kinase/BRD4 Bromodomain Inhibitor BI-2536. ACS Med Chem Lett. 2015 May 18;6(7):764-9.

[3]. BI 2536, a Potent and Selective Inhibitor of Polo-like Kinase 1, Inhibits Tumor Growth In Vivo. Current Biology (2007), 17(4), 316-322.

[4]. Suppression of IFN β gene transcription by inhibitors of bromodomain and extra-terminal (BET) family members. Biochem J. 2015 Jun 15;468(3):363-72.

BI 2536 is under investigation in clinical trial NCT00376623 (Efficacy and Safety of BI 2536 in Advanced or Metastatic Non Small Cell Lung Cancer).
Plk1 Inhibitor BI 2536 is a small molecule compound with potential antineoplastic activities. BI 2536 binds to and inhibits Polo-like kinase 1 (Plk1), resulting in mitotic arrest, disruption of cytokinesis, and apoptosis in susceptible tumor cell populations. Plk1, a serine/threonine-protein kinase, is a key regulator of multiple processes fundamental to mitosis and cell division.

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BI 2536 acts as a selective PLK1 inhibitor by binding to the ATP-binding pocket of PLK1, blocking its kinase activity and disrupting mitotic progression. It inhibits key PLK1-mediated events, including centrosome maturation, spindle assembly, and cytokinesis [1]
- As a dual inhibitor, BI 2536 binds to BRD4 bromodomains but with lower affinity compared to PLK1. The PLK1 inhibitory activity is the primary driver of its antiproliferative and antitumor effects, while BRD4 binding may contribute minimally to its biological activity [2]
- BI 2536 represents a tool compound for studying PLK1 function in mitosis and has potential as an anticancer agent due to its potent in vitro and in vivo antitumor activity [3]

C28H39N7O3

521.66

521.311

C, 64.47; H, 7.54; N, 18.80; O, 9.20

755038-02-9

11364421

Off-white to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

1.634

1.81

102.93

2

8

7

38

816

1

O=C1[C@@]([H])(C([H])([H])C([H])([H])[H])N(C2C(=C([H])N=C(N([H])C3C([H])=C([H])C(=C([H])C=3OC([H])([H])[H])C(N([H])C3([H])C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])[H])C([H])([H])C3([H])[H])=O)N=2)N1C([H])([H])[H])C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H]

XQVVPGYIWAGRNI-JOCHJYFZSA-N

InChI=1S/C28H39N7O3/c1-5-22-27(37)34(3)23-17-29-28(32-25(23)35(22)20-8-6-7-9-20)31-21-11-10-18(16-24(21)38-4)26(36)30-19-12-14-33(2)15-13-19/h10-11,16-17,19-20,22H,5-9,12-15H2,1-4H3,(H,30,36)(H,29,31,32)/t22-/m1/s1

4-[[(7R)-8-cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-7H-pteridin-2-yl]amino]-3-methoxy-N-(1-methylpiperidin-4-yl)benzamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 3.25 mg/mL (6.23 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 32.5 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 3.25 mg/mL (6.23 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 32.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入 900 μL 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 30%PEG 400 +0.5% Tween 80 +5% Propylene glycol : 15mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。