BI 2536

PLK1 (IC50 = 0.83 nM); Plk2/Snk (IC50 = 3.5 nM); Plk3/Fnk (IC50 = 9 nM); BRD4 (IC50 = 25 nM)
Polo-like Kinase 1 (PLK1) (Ki = 0.83 nM; IC50 = 1.3 nM for PLK1 kinase activity) [1]
- PLK1 (IC50 = 0.8 nM) and Bromodomain-containing Protein 4 (BRD4) (IC50 = 3.1 μM for BRD4(1) bromodomain binding) [2]
- PLK1 (Ki = 0.6 nM; IC50 = 1.0 nM in kinase assay) [3]

BI 2536 对 Plk2 和 Plk3 活性的阻断程度稍小，IC50 分别为 3.5 nM 和 9.0 nM。在 HeLa 细胞中，10-100 nM 的 BI 2536 处理会导致有丝分裂中心体处 γ-微管蛋白的募集和 Apc6 的磷酸化受阻，抑制染色体臂上的粘连蛋白释放，诱导单极纺锤体，以及一系列作用。已知依赖于 Plk1 的其他有丝分裂过程。 BI 2536 处理导致 HeLa 细胞停滞在 G2/M 期，随后出现亚 G1 DNA 峰，表明 DNA 断裂和凋亡，并以浓度依赖性方式积累切割的 PARP p85 片段。 BI 2536 可抑制一组 32 种人类癌细胞系的生长，EC50 为 2-25 nM，同时阻断呈指数增长的 hTERT-RPE1、人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 和正常大鼠肾 (NRK) 细胞的增殖EC50 为 12-31 nM。 BI 2536 抑制 Plk1 会降低未分化甲状腺癌 (ATC) 细胞（例如 CAL62、OCUT-1、SW1736、8505C 和 ACT-1）的生长和活力，EC50 值为 1.4-5.6 nM。激酶测定：重组人 Plk1（残基 1-603）通过杆状病毒表达系统表达为 N 末端、GST 标记的融合蛋白，并通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。 Plk1 的酶活性测定在连续稀释的 BI 2536 存在下进行，并以 20 ng 重组激酶和 10 μg 牛乳酪蛋白为底物。激酶反应在最终体积 60 μL 中于 30 °C 进行 45 分钟（15 mM MgCl2、25 mM MOPS [pH 7.0]、1 mM DTT、1% DMSO、7.5 mM ATP、0.3 μCi γ-33P-ATP ）。添加 125 μL 冰冷的 5% TCA 终止反应。将沉淀物转移至 Multi-Screen 混合酯纤维素过滤板后，用 1% TCA 洗涤板并进行放射定量。剂量反应曲线用于计算IC50值。细胞测定：将细胞（HeLa、A43、SKOV-3、HT-29、K562、A549、Saos-2、MCF7、HCT116、COLO 205、Hep G2、Raji 和 PC-3 细胞等）暴露于不同浓度BI 2536 24 和 72 小时。通过在荧光分光光度计中测量阿拉玛蓝染料转化来评估细胞生长。为了测定培养物的 DNA 含量，将细胞悬浮液固定在 80% 乙醇中，用 0.25% Triton X-100 的 PBS 溶液处理 5 分钟，并与 0.1% RNase 和 10 μg/mL 碘化丙啶 (PI) 的 PBS 溶液一起孵育室温 20 分钟。细胞周期概况通过流式细胞术分析确定。

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用BI 2536处理HeLa、U2OS和A549细胞可诱导有丝分裂停滞，表现为纺锤体形成异常、染色体未分离及组蛋白H3（Ser10）磷酸化水平升高。有丝分裂停滞的IC50值分别为5 nM（HeLa）、7 nM（U2OS）和10 nM（A549）。延长暴露时间（24-48小时）可导致细胞凋亡，caspase-3激活和膜联蛋白V染色实验证实了这一结果[1]
- BI 2536具有双抑制活性：强效抑制PLK1激酶活性（IC50 = 0.8 nM），弱结合BRD4溴结构域（BRD4(1) IC50 = 3.1 μM，BRD4(2) IC50 = 5.2 μM）。在浓度高达10 μM时，它不会显著抑制其他BET家族成员（BRD2、BRD3）。在癌细胞系（MDA-MB-231、MCF-7、HCT116）中，它以2.5-8.3 nM的IC50值抑制细胞增殖，这一效果与PLK1抑制相关，而非BRD4结合[2]
- 在55种人类癌细胞系（包括肺癌、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌）中，BI 2536以0.5-10 nM的IC50值抑制细胞增殖。它在HCT116和PC-3细胞中诱导G2/M期停滞，随后引发凋亡。蛋白质印迹分析显示PLK1底物（Cdc25C、周期蛋白B1）的磷酸化水平降低，切割型PARP水平升高[3]

每周一次或两次静脉注射 BI 2536 在多种异种移植模型中非常有效，通过有丝分裂停滞抑制细胞增殖，并随后诱导肿瘤细胞死亡，具有可接受的耐受性。每周一次或两次 50 mg/kg 的 BI 2536 显着抑制 HCT 116 异种移植物的生长，T/C 分别为 15% 和 0.3%。每周两次的 BI 2536 治疗也能在 BxPC-3 和 A549 模型中实现良好的肿瘤生长，T/C 分别为 5% 和 14%。

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在携带HCT116结肠癌异种移植物的裸鼠中，BI 2536以20 mg/kg的剂量每周静脉注射一次，连续3周，可显著抑制肿瘤生长（肿瘤生长抑制率=78%；与溶媒组相比p < 0.01）。治疗组小鼠的肿瘤样本显示有丝分裂象增加（停滞在中期），Ki-67染色（增殖标志物）减少[3]
- 在U2OS骨肉瘤异种移植物模型中，BI 2536以15 mg/kg的剂量每周静脉注射两次，连续4周，实现了65%的肿瘤生长抑制。治疗期间未观察到显著的体重减轻或器官毒性[3]

使用杆状病毒表达系统将重组人 Plk1（残基 1-603）表达为 N 末端、GST 标记的融合蛋白后，使用谷胱甘肽-琼脂糖通过亲和层析进行纯化。在进行 Plk1 酶活性测定时，会使用系列稀释的 BI 2536 以及 20 ng 重组激酶和 10 μg 来自牛奶的酪蛋白作为底物。最终体积为 60 μL 用于激酶反应，在 30 °C 下进行 45 分钟（15 mM MgCl2、25 mM MOPS [pH 7.0]、1 mM DTT、1% DMSO、7.5 mM ATP、0.3 μCi γ-33P-ATP）。最后添加 125 μL 冰冷的 5% TCA 以终止反应。将沉淀物转移至 Multi-Screen 混合酯纤维素过滤板后，对板进行 1% TCA 洗涤和辐射定量。 IC50 值是使用剂量反应曲线计算的。

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PLK1激酶实验：重组PLK1催化结构域与肽底物（KKT(p)LRR）和ATP共同孵育。将BI 2536以系列浓度（0.1 nM至1 μM）加入，通过闪烁邻近分析法检测磷酸化底物，以测定激酶活性。反应在30°C下进行60分钟，从剂量-反应曲线计算IC50值[1]
- PLK1和BRD4双靶点实验：PLK1激酶活性检测中，重组PLK1与ATP和荧光肽底物混合，25°C孵育45分钟后，通过荧光共振能量转移（FRET）定量活性。BRD4溴结构域结合实验中，BI 2536与重组BRD4(1)或BRD4(2)结构域及荧光标记的乙酰化组蛋白肽共同孵育，通过荧光偏振法检测肽结合竞争情况，确定结合亲和力（IC50）[2]
- PLK1 Ki值测定：在不同ATP浓度（0.5-10 μM）和固定BI 2536浓度下进行激酶反应。基于ATP结合的竞争性抑制，使用双倒数作图法和非线性回归分析计算Ki值[3]

在细胞增殖测定中，添加不同浓度的 BI 2536 (10 nM-1 μM) 并孵育 72 小时。通过在荧光分光光度计中测量阿拉玛蓝染料转化来测量细胞的生长。根据剂量反应曲线拟合，可以推断出细胞生长受到 50% 抑制的有效浓度 (EC50)[3]。

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有丝分裂停滞实验：HeLa、U2OS和A549细胞接种到96孔板（5×103个细胞/孔），过夜孵育。加入BI 2536（浓度0.1-100 nM），细胞培养16小时。用甲醛固定细胞，透化处理后，用抗磷酸化组蛋白H3（Ser10）抗体和DAPI染色。通过免疫荧光显微镜计数有丝分裂细胞（磷酸化H3阳性）[1]
- 细胞增殖实验：癌细胞系接种到384孔板（2×103个细胞/孔），用BI 2536（0.01-100 nM）处理72小时。基于线粒体脱氢酶活性的比色法评估细胞活力，使用四参数逻辑回归从剂量-反应曲线推导IC50值[2]
- 凋亡和细胞周期实验：HCT116细胞用BI 2536（5 nM）处理24-48小时。细胞周期分析中，收集细胞、固定、碘化丙啶染色，通过流式细胞术分析。凋亡检测中，用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶染色细胞，随后进行流式细胞术分析。通过蛋白质印迹检测切割型PARP、caspase-3和PLK1底物蛋白[3]

小鼠：将 2×10⁶、1×10⁶ 或 1×10⁷ 个细胞皮下注射到每只小鼠的侧腹部，即可将 HCT 116 结肠癌细胞、NCI-H460 癌细胞或 A549 肺癌细胞移植到雌性 BomTac:NMRI-Foxn1nu 小鼠体内。待肿瘤体积生长至约 50 mm³ 后，将小鼠两两分组，每组 10 只，分别进行治疗和对照。在肿瘤消退实验中，待平均肿瘤体积达到 500 mm³ 后才开始治疗。BI 2536 的推荐剂量和给药方案通过尾静脉给药。剂量为每公斤体重 10 毫升。每周三次使用游标卡尺测量肿瘤体积。以下公式用于将测量结果转换为肿瘤体积（mm³）：长×宽²×π/6。在同一天，测定小鼠体重以评估其耐受性。采用单侧（递减）精确 Wilcoxon 检验，对治疗组和载体对照组进行统计分析。

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异种移植瘤模型：将 HCT116（5×10⁶ 个细胞）或 U2OS（1×10⁷ 个细胞）皮下注射到 6-8 周龄雌性裸鼠的右侧腹部。当肿瘤体积达到 100-150 mm³ 时，将小鼠随机分为治疗组（n=8）和载体对照组（n=8）。BI 2536 溶解于 PEG400 和生理盐水（1:1 v/v）的混合溶液中，经尾静脉注射给药。给药方案包括：HCT116 组每周一次，每次 20 mg/kg，持续 3 周；U2OS 组每周两次，每次 15 mg/kg，持续 4 周。每周使用游标卡尺测量两次肿瘤体积，并在整个研究期间监测体重[3]

[1]. The Small-Molecule Inhibitor BI 2536 Reveals Novel Insights into Mitotic Roles of Polo-like Kinase 1. Curr Biol. 2007 Feb 20;17(4):304-15.

[2]. BRD4 Structure-Activity Relationships of Dual PLK1 Kinase/BRD4 Bromodomain Inhibitor BI-2536. ACS Med Chem Lett. 2015 May 18;6(7):764-9.

[3]. BI 2536, a Potent and Selective Inhibitor of Polo-like Kinase 1, Inhibits Tumor Growth In Vivo. Current Biology (2007), 17(4), 316-322.

[4]. Suppression of IFN β gene transcription by inhibitors of bromodomain and extra-terminal (BET) family members. Biochem J. 2015 Jun 15;468(3):363-72.

BI 2536 正在临床试验 NCT00376623（BI 2536 治疗晚期或转移性非小细胞肺癌的疗效和安全性）中进行研究。
Plk1 抑制剂 BI 2536 是一种具有潜在抗肿瘤活性的小分子化合物。BI 2536 与 Polo 样激酶 1 (Plk1) 结合并抑制其活性，导致易感肿瘤细胞群发生有丝分裂停滞、胞质分裂受阻和细胞凋亡。Plk1 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是多种有丝分裂和细胞分裂关键过程的调节因子。

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BI 2536 通过与 PLK1 的 ATP 结合口袋结合，阻断其激酶活性并干扰有丝分裂进程，从而发挥选择性 PLK1 抑制剂的作用。它抑制PLK1介导的关键事件，包括中心体成熟、纺锤体组装和胞质分裂[1]
- 作为一种双重抑制剂，BI 2536与BRD4溴结构域结合，但其亲和力低于PLK1。PLK1抑制活性是其抗增殖和抗肿瘤作用的主要驱动因素，而BRD4结合对其生物活性的贡献可能很小[2]
- BI 2536是一种用于研究PLK1在有丝分裂中功能的工具化合物，并且由于其强大的体外和体内抗肿瘤活性，具有作为抗癌药物的潜力[3]

C28H39N7O3

521.66

521.311

C, 64.47; H, 7.54; N, 18.80; O, 9.20

755038-02-9

11364421

Off-white to yellow solid powder

1.3±0.1 g/cm3

1.634

1.81

102.93

2

8

7

38

816

1

O=C1[C@@]([H])(C([H])([H])C([H])([H])[H])N(C2C(=C([H])N=C(N([H])C3C([H])=C([H])C(=C([H])C=3OC([H])([H])[H])C(N([H])C3([H])C([H])([H])C([H])([H])N(C([H])([H])[H])C([H])([H])C3([H])[H])=O)N=2)N1C([H])([H])[H])C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H]

XQVVPGYIWAGRNI-JOCHJYFZSA-N

InChI=1S/C28H39N7O3/c1-5-22-27(37)34(3)23-17-29-28(32-25(23)35(22)20-8-6-7-9-20)31-21-11-10-18(16-24(21)38-4)26(36)30-19-12-14-33(2)15-13-19/h10-11,16-17,19-20,22H,5-9,12-15H2,1-4H3,(H,30,36)(H,29,31,32)/t22-/m1/s1

4-[[(7R)-8-cyclopentyl-7-ethyl-5-methyl-6-oxo-7H-pteridin-2-yl]amino]-3-methoxy-N-(1-methylpiperidin-4-yl)benzamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 3.25 mg/mL (6.23 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 32.5 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 3.25 mg/mL (6.23 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 32.5 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入 900 μL 20% SBE-β-CD 生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (3.99 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 30%PEG 400 +0.5% Tween 80 +5% Propylene glycol : 15mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。