HSV-1; GSK-3α (IC50 = 10 nM); GSK-3β (IC50 = 10 nM); CDK5/p35 (IC50 = 2.4 μM); CDK2/cyclin A (IC50 = 4.3 μM); CDK1/cyclin B (IC50 = 63 μM)

BIO-acetoxime (BIA；Compound 13) 是一种有效的选择性 GSK-3α/β 抑制剂，IC50 均为 10 nM。 BIO-乙酰肟 (BIA) 对 CDK5/p35 (IC50, 2.4 M)、CDK2/cyclin A (IC50, 4.3 μM) 和 CDK1/cyclin B (IC50, 63 μM) 的影响可以忽略不计[1]。然而，它对mockin感染的细胞的形态和活力影响不大。 BIO-乙酰肟 (BIA)（5 μM 和 10 μM）可增加 HSV-1 感染细胞的活力。 BIO-乙酰肟 (BIA)（0.625、1.25、2.5、5 和 10 μM）的 EC50 为 0.68 ± 0.28 μM，还可显着降低 OC3 细胞中 HSV-1 颗粒的释放。虽然 BIO-乙酰肟 (BIA) 可能不会影响 HSV-1 衣壳的核靶向，但它确实会抑制 HSV-1 基因的表达。延迟添加 BIO-乙酰肟 (BIA) 也可以预防 HSV-1 感染[2]。

BIO-乙酰肟 (BIA) 在局灶性毛果芸香碱大鼠模型中以 0.5 mg/kg 剂量显示出抗惊厥作用，在 6 Hz 完全点燃的 FVB/N 小鼠中以 0.5、2.5 和 5 mg/kg 剂量静脉注射时显示出抗惊厥作用[3] 。

激酶活性在缓冲液 A 或 C 中于 30 °C、最终 ATP 浓度为 15 μM 下进行测定。减去空白值，并将活性计算为孵育 10 分钟的磷酸盐的皮摩尔数。活性以最大活性的％表示，即在不存在抑制剂的情况下。使用适当稀释的 DMSO 进行对照。 GSK-3α/β 通过固定轴蛋白亲和层析从猪脑中纯化。在 1 mg BSA/mL 10 mM DTT 中进行 1/100 稀释后，以 5 μL 40 μM GS-1 肽作为底物，在缓冲液 A 中，在 15 μM [γ-33P] ATP 存在下进行测定（ 3000 Ci/mmol；1 mCi/mL），最终体积为 30 μL。 30°C 孵育 30 分钟后，将 25 μL 等份上清液点样到 2.5 × 3 cm 的 Whatman P81 磷酸纤维素纸上，20 秒后，将滤膜洗涤 5 次（每次至少 5 分钟）。 10 mL 磷酸/升水的溶液。在 1 mL ACS 闪烁液存在下对湿过滤器进行计数。 CDK1/细胞周期蛋白 B 在均质缓冲液中从 M 期海星 (Marthasterias glacialis) 卵母细胞中提取，并通过 p9CKShs1-琼脂糖珠上的亲和层析进行纯化，并用游离的 p9CKShs1 洗脱。在终体积为 30 μL 的每毫升缓冲液 C 中加入 1 mg 组蛋白 H1 和 15 μM [γ-32P] ATP (3000 Ci/mmol；1 mCi/mL)，测量激酶活性。将 25 μL 等份上清液点样到 P81 磷酸纤维素纸上，并在 30 °C 孵育 10 分钟后进行相同的处理。重组哺乳动物 CDK5 和 p25 使用谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析纯化，均为 35 kDa CDK5 激活蛋白的截短版本，等量组合以产生 CDK5/p25。 GST（谷胱甘肽-S-转移酶）融合蛋白在大肠杆菌中表达。以与 CDK1/细胞周期蛋白 B 相同的方式，在缓冲液 C 中测量其活性。

对于蛋白质印迹分析和 RNA 分离，将 OC3 细胞分别铺在直径 3.5 和 6 cm 的培养皿中。除非另有说明，细胞均以感染复数 (moi) 5 进行模拟处理或暴露于 HSV-1。首先，溶解 DMSO 以制备 GSK-3 抑制剂 BIO-乙酰肟 (BIA) 的储备溶液。使用含有 DMSO 的介质作为溶剂对照。在模拟或 HSV-1 感染前 45 分钟，仅用培养基、含有 0.1% DMSO 的培养基或 BIO-乙酰肟 (BIA) 预处理细胞。生物乙酰肟 (BIA) 也存在于整个感染期间。 HSV-1 在室温下直接暴露于含有 5 M BIO-乙酰肟 (BIA) 的培养基中 1 小时，以研究对病毒的直接影响。使用倒置显微镜可以观察细胞形态[2]。

Mice: Male FVB/N mice are used to test the anticonvulsant effects of BIO-acetoxime in fully kindled mice. Mice are stimulated twice daily, excluding weekends, at a fixed subconvulsive threshold current with a minimum 4 hour interval between stimulations in order to reach the fully kindled state. To keep the mice fully kindled, stimulation is given to them only twice a day, two days a week. Nonkindled mice are kept at the original stimulation protocol for a maximum of another two to three weeks. The "epileptic" fully kindled mice are stimulated on Monday morning in order to study the anticonvulsant effect of BIO-acetoxime (BIA). Monday afternoon, 30 minutes before stimulation, the animals receive an intraperitoneal (i.p.) injection of vehicle. Mice are stimulated again on Tuesday morning. Mice are injected intraperitoneally (i.p.) with BIO-acetoxime (BIA) on Tuesday afternoon, and they are stimulated 30 minutes later. The Racine scale is used to gauge seizure severity. The pretreatment scores and the posttreatment scores—obtained following the treatment on Tuesday—are contrasted. The experiment is repeated with a one-week washout in order to confirm any effects that were noticed. To maintain the kindled state during this washout week, all mice are stimulated twice daily for 2 days. Compound testing over a longer time period has not yet been proven effective. This limits the number of doses of BIO-acetoxime that can be tested on a batch of lit mice.[3].

[1]. GSK-3-selective inhibitors derived from Tyrian purple indirubins. Chem Biol. 2003 Dec;10(12):1255-66.

[2]. Antiherpetic potential of 6-bromoindirubin-3'-acetoxime (BIO-acetoxime) in human oral epithelial cells. Arch Virol. 2013 Jun;158(6):1287-96.

[3]. Identification of GSK-3 as a Potential Therapeutic Entry Point for Epilepsy. ACS Chem Neurosci. 2018 Nov 6.

C18H12BRN3O3

398.2102

397.0062

C, 54.29; H, 3.04; Br, 20.07; N, 10.55; O, 12.05

667463-85-6

(E/Z)-BIO-acetoxime;740841-15-0

Solid powder

O=C1NC2=C(C=CC(Br)=C2)/C1=C3NC4=C(C=CC=C4)C/3=N\OC(C)=O

MENDIXKFTXYTHJ-HPBPSMLHSA-N

InChI=1S/C18H12BrN3O3/c1-9(23)25-22-16-12-4-2-3-5-13(12)20-17(16)15-11-7-6-10(19)8-14(11)21-18(15)24/h2-8,20H,1H3,(H,21,24)/b17-15-,22-16+

(2Z,3E)-3-(acetoxyimino)-6'-bromo-[2,3'-biindolinylidene]-2'-one

BIA; GSK-3 Inhibitor X; 6-Bromoindirubin-3′-acetoxime; BIO-acetoxime; (2′Z,3′E)-6-Bromoindirubin-3′-acetoxime; 6-Bromoindirubin acetoxime; 6-Bromoindirubin-3′-acetoxime

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~19 mg/mL (47.7 mM)
Water: <1 mg/mL
Ethanol: <1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.22 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.08 mg/mL (5.22 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.22 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。