p110α (IC50 = 52 nM); p110β (IC50 = 166 nM); p110δ (IC50 = 116 nM); p110γ (IC50 = 262 nM); Vps34 (IC50 = 2.4 μM); p110α-H1047R (IC50 = 58 nM); p110α-E545K (IC50 = 99 nM); mTOR (IC50 = 4.6 μM)

Buparlisib (BKM120) 对 I 类 PI3K（包括最常见的 p110α 突变体）表现出 50-300 nM 的活性。此外，NVP-BKM120 对 III 类和 IV 类 PI3K 的效力较低； VPS34、mTOR、DNAPK 和 PI4K 的抑制分别被 2、5、>5 和 >25 μM 生化活性所抑制[1]。 buparlisib (BKM120) 如何引起多发性骨髓瘤 (MM) 细胞凋亡，存在剂量和时间依赖性。 Buparlisib (BKM120) 在 10 μM 浓度下 24 小时后显着诱导所有测试的 MM 细胞系凋亡（与对照相比，P<0.05）。如果没有另外说明，以下实验将使用 10 μM buparlisib (BKM120) 和 24 小时处理。所有测试的 MM 细胞系均表现出对 buparlisib (BKM120) 治疗的剂量依赖性生长抑制。每个测试的 MM 细胞都有不同的 buparlisib (BKM120) IC50 值。处理 24 小时时，ARP-1、ARK 和 MM.1R 的 IC50 为 1 至 10 μM，而 MM.1S 的 IC50 小于 <1 μM，U266 的 IC50 为 10 至 100 M。总之，buparlisib (BKM120) 治疗会导致 MM 细胞生长抑制和凋亡，其方式取决于剂量和时间[2]。

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在I类PI3K、相关脂质激酶和200多种蛋白激酶中评估了Buparlisib/15的生化活性。部分数据如表3所示。化合物15对I类PI3K表现出50-300nM的活性，包括最常见的p110α突变体。此外，15个对III类和IV类PI3K的效力较低，其中分别观察到2、5、>5和>25μM的生化活性抑制VPS34、mTOR、DNAPK和PI4K。对所测试的蛋白激酶没有观察到明显的活性。[1]

对来自各种肿瘤类型（包括卵巢、胶质母细胞瘤、乳腺和前列腺）的一系列PI3K失调细胞系进行了Buparlisib/15的体外评估（表4）。在所有细胞系中，通路调节和抗增殖活性与细胞PI3K抑制一致[1]。

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BKM120/Buparlisib抑制MM细胞系的生长并诱导细胞凋亡[2]
为了评估BKM120对骨髓瘤细胞的影响，我们用不同剂量的BKM120处理MM细胞系24或72小时。通过膜联蛋白V结合试验测量BKM120诱导的MM细胞凋亡。如图1a所示，BKM120以剂量和时间依赖的方式诱导MM细胞凋亡。浓度≥10μM的BKM120在24小时内诱导所有受试MM细胞系发生显著凋亡（与对照组相比，P<0.05）。因此，如果没有另行说明，我们在以下实验中选择了10μM BKM120和24小时处理。

采用MTS法检测BKM120/Buparlisib对MM细胞生长的影响。如图1b所示，BKM120处理导致所有测试的MM细胞系出现剂量依赖性生长抑制。BKM120 IC50（50%抑制时的浓度）在所测试的MM细胞中有所不同。治疗24小时后，ARP-1、ARK和MM.1R的IC50在1至10μM之间，而MM.1S的IC50<1μM，U266的IC50在10至100μM之间。总之，我们的研究结果表明，BKM120治疗以剂量和时间依赖的方式导致MM细胞生长抑制和凋亡。

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BKM120/Buparlisib体外诱导原发性MM细胞凋亡[2]
为了评估BKM120在原代MM细胞中的活性，我们将我们的研究扩展到从骨髓瘤患者中新鲜分离的CD138+原发MM细胞。根据我们之前的发现，原代MM细胞在体外会发生凋亡，除非这些细胞与BMSCs共培养。因此，CD138+原代MM细胞与MM骨髓吸出物产生的CD138-BSCs以1:1的比例共培养。用0至1 mM的不同剂量的BKM120处理细胞24小时。通过APC-CD138染色鉴定原代mM细胞和BMSCs。如从三分之一受检患者的骨髓瘤细胞和BMSCs中获得的代表性数据所示（图1c），BKM120以剂量依赖的方式诱导CD138+原代MM细胞凋亡。即使在我们的对照组中，原发性MM凋亡率也略有升高。这可能是因为原代MM细胞在从促进肿瘤的骨髓微环境中分离出来后，会在体外自发凋亡。值得注意的是，BKM120对CD138-基质细胞的细胞毒性显著降低。图1d显示了BKM120诱导三种不同MM患者的原代MM细胞凋亡。综上所述，这些数据表明BKM120诱导原代MM细胞凋亡，对非肿瘤BMSCs具有低毒性。

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BKM120/Buparlisib对健康志愿者的正常血细胞具有低毒性[2]
为了进一步检查Buparlisib/BKM120是否诱导正常细胞凋亡，将来自不同健康志愿者的PBMC与0-1mM BKM120一起孵育24小时。如上所述测量细胞凋亡率。如图2a所示，BKM120对正常PBMCs的毒性与BMSCs相当低。10或100μM的BKM120对MM细胞具有高度凋亡性，仅导致<40%的PBMC凋亡。因此，我们的研究结果表明，BKM120对正常PBMC的细胞毒性较低。

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IL-6、IGF或BMSCs不能保护MM细胞免受Buparlisib诱导的凋亡[2] IL-6是MM的重要生存细胞因子。先前的研究表明，IL-6在化疗药物地塞米松治疗下促进MM细胞存活。因此，我们研究了IL-6是否可以减轻Buparlisib/BKM120诱导的MM细胞凋亡。为此，在10μM BKM120存在或不存在的情况下，将不同的MM细胞系与或不与终浓度为5 ng/ml的重组人IL-6一起培养24小时。作为阳性对照，MM.1S细胞用40μg/ml的地塞米松（含或不含IL-6）处理相同的时间。如图2b所示，IL-6不影响BKM120诱导的MM细胞凋亡，但在地塞米松治疗下促进了MM.1S细胞的存活。

先前的研究也表明，IGF是另一种激活PI3K-Akt通路的MM生存细胞因子。因此，我们还测试了IGF的存在是否影响Buparlisib诱导的MM细胞凋亡。在终浓度为10ng/ml的条件下，将不同的MM细胞系与重组人IGF一起或一起培养。如图2c所示，IGF对BKM120诱导的ARP-1或U266细胞凋亡没有保护作用。越来越多的证据表明，骨髓瘤肿瘤床中的BMSCs提供了一个促进肿瘤的微环境，并保护MM细胞免受化疗药物诱导的凋亡。因此，我们还测试了来自MM患者骨髓的BMSCs是否能够保护MM细胞免受BKM120诱导的凋亡。为此，将MM患者产生的BMSCs与MM细胞系共培养。用或不用10μM BKM120处理细胞24小时。作为阳性对照，MM.1S细胞与或不与BMSCs共培养，用或不使用40μg/ml地塞米松处理24小时。处理后，通过APC-CD138染色将MM细胞鉴定为CD138+细胞。如图2d所示，BMSCs不能保护MM细胞免受BKM120诱导的凋亡，但可以保护MM.1S细胞免受地塞米松诱导的凋亡。

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BKM120/Buparlisib导致细胞周期阻滞在G1期[2]
为了研究BKM120诱导MM细胞生长抑制和凋亡的机制，我们研究了BKM120治疗是否影响MM细胞周期。如图3a所示，ARP-1细胞在有或没有1μM BKM120的情况下培养24小时。BKM120处理导致G1期细胞增加，S期细胞减少。在其他MM细胞系MM.1S和MM.1R中也观察到了类似的发现（图3b）。

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BKM120/Buparlisib通过激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶触发MM细胞凋亡[2]
为了阐明BKM120诱导的MM细胞凋亡，通过蛋白质印迹分析评估用或不用BKM120处理24小时的MM细胞系的胱天蛋白酶激活情况。结果显示胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶7和胱天蛋白酶9被切割（图4a）。在所有测试的细胞系中，BKM120处理后也检测到PARP切割，表明胱天蛋白酶级联激活。为了检查BKM120触发的细胞死亡是否取决于胱天蛋白酶的激活，ARP-1细胞用BKM120和胱天蛋白酶-3抑制剂处理（图4b）。我们的结果表明，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3抑制剂抑制了BKM120诱导的细胞凋亡。总体而言，这些发现表明BKM120治疗通过胱天蛋白酶激活诱导MM细胞凋亡。

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BKM120/Buparlisib暴露导致BimS上调和XIAP下调[2]
为了分析MM细胞中受Buparlisib/BKM120暴露调节的信号通路，我们将免疫印迹分析扩展到细胞信号分子。首先，我们研究了BKM120对MM细胞中PI3KAkt-mTOR通路的抑制作用。如图4c和d所示，BKM120治疗后，Thr473磷酸化的Akt和Ser308磷酸化的阿克特均下调。在ARP-1和MM.1R细胞中观察到总Akt的下调，但在MM.1S细胞中没有观察到（图4d）。这可能是由BKM120治疗后凋亡骨髓瘤细胞的增加和/或治疗后Akt表达/降解的某些细胞类型特异性调节引起的。BKM120处理后，受试MM细胞中的pP70S6K水平也降低，而P70S6K的总表达保持不变。这些发现表明，BKM120抑制MM细胞中的PI3K-Akt-mTOR通路。

其次，由于BKM120治疗导致细胞周期阻滞在G1期，我们检测了细胞周期调节因子的表达。如图4d所示，BKM120处理后，细胞周期抑制因子p27（Kip1）蛋白表达上调，而细胞周期蛋白D1表达下调。

接下来，我们检测了凋亡调节因子的表达。我们的数据显示，在Buparlisib/BKM120治疗后，Bim的细胞毒性小亚型BimS的表达上调。Bim是一种属于Bcl-2家族的促凋亡因子。Bim有三种主要的异构体，BimEL、BimL和BimS，由选择性剪接产生。最短形式的BimS是细胞毒性最强的亚型。先前的研究表明，Bim的转录受叉头转录因子FKHR-L1的调节，FKHR-L是PI3K的下游效应器。除Bim外，BKM120处理后抗凋亡XIAP和Bcl-XL的表达下调（图4d）。因此，BKM120诱导的MM细胞凋亡可能是由细胞毒性BimS的上调和抗凋亡XIAP和Bcl-XL的下调引起的。

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Buparlisib/BKM120和地塞米松对MM细胞的协同细胞毒性[2]
为了测试BKM120是否与其他抗MM化疗药物具有协同或成瘾作用，ARP-1细胞用Buparlisib/BKM120（1μM）联合低剂量美法仑、地塞米松、来那度胺或硼替佐米治疗。如图5a所示，BKM120与地塞米松或硼替佐米联合治疗，但不与其他药物联合治疗，对ARP-1细胞具有协同或成瘾性细胞毒性。特别是，BKM120和地塞米松显示出协同抗ARP-1活性。接下来，我们将实验扩展到其他MM细胞系。如图5b所示，尽管低剂量的BKM120或地塞米松单独具有有限的细胞毒性，但两者的组合在地塞米松敏感细胞系ARP-1和MM.1S中诱导了显著的细胞凋亡，但在地塞米松耐药细胞MM.1R中没有。细胞生长试验还表明，BKM120和地塞米松协同抑制MM.1S细胞生长（图5c）。此外，相同的药物组合对PBMC的细胞毒性有限（补充图1）。[2]
为了检查每种药物的最小剂量是否具有协同作用，我们用不同剂量的Buparlisib/BKM120和地塞米松处理MM.1S细胞24小时。药物协同作用通过Isobologram分析得到证实（表1和补充图2）。这些结果表明，由于相互作用指数较低，当BKM120的剂量为0.5和1μM时，BKM120和地塞米松具有协同作用。

为了阐明BKM120/Buparlisib和地塞米松在骨髓瘤细胞协同作用中的作用，我们按顺序用药物治疗MM.1S细胞。MM.1S细胞在第一天用地塞米松处理，洗涤，第二天改用BKM120，反之亦然。依次用培养基或单一药物治疗作为对照。如图5e所示，首先用地塞米松治疗，然后用BKM120治疗，其凋亡率高于BKM120随后用地塞米松或单独使用单一药物的治疗。

最后，使用免疫印迹分析胱天蛋白酶依赖性凋亡，以阐明这两种药物协同作用的分子机制。如图5f所示，Buparlisib/BKM120和地塞米松联合治疗导致PARP和Bcl-2切割以及caspase-3激活增加。Bcl-2总水平保持不变。这可能是因为切割的Bcl-2只是Bcl-2总量的一小部分。这些发现表明，双重药物治疗后胱天蛋白酶依赖性细胞凋亡增强。BimS表达在联合治疗中进一步上调，这可能是协同作用的原因。总之，我们的研究结果表明，BKM120和地塞米松在地塞米松敏感的MM细胞中具有协同细胞毒性。

在 A2780 异种移植肿瘤中，口服 3、10、30、60 和 100 mg/kg 剂量的 Buparlisib (BKM120) 会导致 pAKTSer473 的剂量依赖性调节。在 3 和 10 mg/kg 的剂量下，pAKTSer473 被部分抑制，在 30、60 或 100 mg/kg 的剂量下，它几乎被完全抑制。血浆和肿瘤药物暴露均与 pAKT 抑制（标准化为总 AKT）密切相关[1]。根据肿瘤体积 (P<0.05) 和循环人 kappa 链水平 (P<0.05) 确定，Buparlisib (BKM120)（每天每公斤 5 μM，持续 15 天）治疗的小鼠的肿瘤负荷显着低于对照小鼠。此外，buparlisib (BKM120) 治疗可显着提高荷瘤小鼠的存活率 (P<0.05)[2]。

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在PI3K-AKT通路驱动的两种癌症模型中，与选择性体外抑制I类PI3K一致的行为转化为体内环境：A2780卵巢癌和携带PTEN缺失的U87MG胶质瘤模型。在A2780异种移植物肿瘤中（图4），口服3、10、30、60和100 mg/kg的Buparlisib/15会导致pAKTSer473的剂量依赖性调节。在3和10mg/kg剂量下观察到pAKTser473的部分抑制，在30、60或100mg/kg剂量下分别观察到近乎完全的抑制。pAKT的抑制（标准化为总AKT）与血浆和肿瘤药物暴露情况良好。pAKT调节也具有时间依赖性，在血浆和肿瘤暴露量约为2μM的10小时时间点，60和100mg/kg剂量达到>90%的靶向调节[1]。

与体外情况一样，15/Buparlisib在一系列PI3K通路失调的肿瘤异种移植物模型中显示出体内活性。在已建立的U87MG胶质瘤模型中，15以30和60mg/kg的日口服剂量获得了显著的单药活性（图6），且耐受性良好。U87MG模型中的这一活性，再加上15表现出的高渗透性和缺乏外排，表明15可能在PI3K驱动的胶质瘤中具有实用性[1]。

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Buparlisib/BKM120对已建立的多发性骨髓瘤的体内影响[2]
为了检测BKM120的体内抗骨髓瘤作用，如前所述建立了使用细胞系ARP-1的人MM-SCID小鼠模型。当出现可触及的肿瘤（直径≥5mm）时，小鼠（每组10只）每天接受Buparlisib/BKM120（5μM kg-1天-1）或载体对照（DMSO/PBS）的腹腔注射。如图6a和b所示，与对照组小鼠相比，接受BKM120治疗的小鼠的肿瘤负荷明显较小，这可以通过肿瘤体积（图6a，P<0.05）和循环人κ链水平（图6b，P<0.05）来衡量。此外，BKM120治疗显著延长了荷瘤小鼠的存活时间（图6c，P<0.05）。[2]
接下来，我们研究了Buparlisib/BKM120和地塞米松是否在体内显示出协同抗骨髓瘤作用。特别是，我们想知道这两种药物在低剂量下是否能在体内显示出有效的抗骨髓瘤作用。形成带有MM.1S肿瘤的SCID小鼠，在可触及的肿瘤形成后（肿瘤直径≥5mm），每组5只小鼠接受DMSO/PBS、BKM120（1μM kg−1）、地塞米松（50μg kg−l）或BKM120和地塞米松的组合的腹腔注射，每两天一次，共7次，持续15天。尽管单独使用低剂量的BKM120或地塞米松对已建立的骨髓瘤没有治疗作用，但与对照组小鼠或单独使用BKM120和地塞米松治疗的小鼠相比，使用这两种低剂量药物的联合治疗显著延缓了治疗小鼠的骨髓瘤生长，以肿瘤体积（图6d，P<0.05）和循环人λ链水平（图6e，P<0.05）衡量。此外，联合治疗显著延长了荷瘤小鼠的存活时间（图6f，P<0.05）。

将 BKM120 溶解在 DMSO 中，然后立即以每孔 1.25 µL 的速率分配到黑色 384 孔板中，用于 PI3K 生化测定（ATP 消耗测定）。将检测缓冲液中的 25 µL 10 nM PI3 激酶、5 µg/mL 1-磷脂酰肌醇 (PI) 和 25 µL 2 µM ATP 添加到每个孔中以启动反应。测定缓冲液由 10 mM Tris pH 7.5、5 mM MgCl2、20 mM NaCl、1 mM DTT 和 0.05% CHAPS 组成。在反应运行大约 50% 的 ATP 后，添加 25 µL KinaseGlo 溶液会停止反应。让停止的反应继续五分钟，然后通过发光发现剩余的 ATP。 [1]

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PI3K生化分析（滤膜结合分析）[1]
将50µl/孔的100µg/ml l-α-磷脂酰肌醇和l-α-卵磷脂的1:1混合物溶解在氯仿：乙醇（2.2:7.8）中，移入96孔MaxiSorp™板中。在室温下蒸发溶剂，用Tris缓冲盐水（TBS，pH7.4）洗涤板。在含有[γ33P]-ATP（~6 kBq/孔）、0.5µM ATP（或更高，如图1-2所示）、5 mM MgCl2、150 mM NaCl、25 mM Tris-HCl pH7.4和1%DMSO的50µl培养基中，将PI3Kα在涂层板中室温孵育60分钟。通过加入PI3Kα（0.4µg/ml，<2 nM）开始反应，并通过加入50µl 50 mM EDTA停止反应。用TBS洗涤板两次并干燥；加入100µl/孔MicroScint™PS，并使用TopCount™计数器测定结合放射性。

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mTOR TR-FRET测定：[1]
将50nL化合物稀释液分配到黑色384孔低体积非结合聚苯乙烯板上。然后加入5µL ATP和GFP4EBP1以及5µL mTOR蛋白（最终测定体积10µL），在室温下在50 mM HEPES pH 7.5、10 mM MnCl2、50 mM NaCl、1 mM EGTA、1 mM DTT中孵育反应。用10µL专有混合物（IVG）停止反应，该混合物在TR-FRET稀释缓冲液中含有Tb3+-α-p4EBP1-[pT46]检测抗体EDTA。15分钟后，在Synergy2阅读器中使用0.2秒的积分时间和0.1秒的延迟读取板。通过用等体积的反应缓冲液替换mTOR激酶，实现了对激酶反应100%抑制的控制。通过在不添加测试化合物的情况下替换溶剂载体（90%DMSO的H2O溶液）来创建0%抑制的对照。

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DNAPK测定[1]
体外检测试剂盒与纯化的DNA-PK酶结合使用。体外激酶测定反应按照制造商的方案进行，但修改如下：27 U纯化DNA-PK蛋白/反应、1µM ATP/反应、1%DMSO或指定化合物/反应在37°C下持续30分钟。

A2780 细胞在补充有 10% FBS 的 DMEM 中培养。 L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和抗生素。在黑壁透明底板中，将 1000 个细胞以每孔 100 uL 的密度接种在相同的培养基中，然后将细胞孵育 3 至 5 小时。 Buparlisib (BKM120) 以 20 mM 溶液形式提供（7.5 uL 20 mM NVP-BKM120 在 22.5 uL DMSO 中），然后进一步稀释到 DMSO 中。要制备九种浓度，请重复该过程（充分混合，将 10 uL 转移至 20 uL DMSO 等）。然后，添加细胞培养基(500 uL)，随后添加稀释的Buparlisib (BKM120)溶液(2 uL)。将等体积的该溶液 (100 uL) 倒在 96 孔板中的细胞顶部，然后在 37°C 下孵育三天，然后使用 Cell Titer Glo 进行显色。 Trilux 的发光读数用于确定细胞增殖是否受到抑制[1]。

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pSer473-Akt检测[1]
将细胞以每孔15000个细胞的密度铺在相同的培养基中，放入96孔组织培养板中，外孔空置，并允许其粘附过夜。将DMSO中提供的测试化合物以所需终浓度的500倍进一步稀释到DMSO中，然后稀释到培养基中至终浓度的2倍。将等体积的2x化合物加入96孔板中的细胞中，并在37℃下孵育一小时。然后移除培养基和化合物，冷却平板，在补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（150 mM NaCl，20 mM Tris pH 7.5，1 mM EDTA，1 mM EGTA，1%Triton X-100）中裂解细胞。充分混合后，将裂解物转移到pSer473Akt和总Akt测定板上，在4℃下振荡培养过夜。用1 x MSD洗涤缓冲液洗涤平板，用二抗检测捕获的分析物。在室温下与第二抗体孵育1-2小时后，再次洗涤平板，并向孔中加入1.5倍浓度的Read Buffer T（MSD）。在SECTOR Imager 6000仪器 上读取测定结果。使用pSer473Akt和总Akt测定的信号比率来校正任何变异性，计算pSer473A-kt对用化合物处理的细胞与单独DMSO处理的细胞中总信号的抑制百分比，并用于确定每种化合物的EC50值。

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A2780细胞增殖试验[1]
A2780细胞在添加了10%FBS的DMEM中培养。L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和抗生素。将细胞以每孔1000个细胞、每孔100ul的密度铺在相同的培养基中，放入黑壁透明底板中，孵育3-5小时。将DMSO（20 mM）中提供的测试化合物进一步稀释成DMSO（22.5 ul DMSO中7.5 ul 20 mM测试化合物。混合均匀，转移10 ul至20 ul DMSO，重复直至达到9个浓度）。然后将稀释的试验化合物溶液（2uL）加入细胞培养基（500ul）细胞培养基中。将等体积的该溶液（100 uL）加入96孔板中的细胞中，在37℃下孵育3天，并使用Cell Titer Glo进行显影。使用Trilux通过发光读数测定细胞增殖的抑制作用。对于其他细胞系，先前描述了所有的方法和试剂（Maira，M.等人，癌症研究（2008），68（19），8022-80302008）。

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细胞生长试验[2]
按照制造商的方案，通过MTS测定评估Buparlisib/BKM120对MM细胞或正常PBMC的生长抑制作用。

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细胞凋亡检测[2]
如前所述，通过膜联蛋白V结合试验检测BKM120/Buparlisib诱导的细胞凋亡。

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细胞周期分析[2]
MM细胞系ARP-1、MM.1S和MM.1R与或不与1μMBuparlisib/BKM120一起培养24小时。收获细胞，在4°C下在70%乙醇中透化过夜，然后与50μg/ml PI和20μg/ml RNase-A一起孵育15分钟。通过流式细胞术和FlowJo软件分析DNA含量。

小鼠：本研究使用6至8周龄的雌性重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠。将100万个ARP-1或MM.1S细胞悬浮于50 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，皮下注射至SCID小鼠右侧腹部。待出现可触及的肿瘤（肿瘤直径5 mm）后，腹腔注射DMSO/PBS或布帕利西布（BKM120）（5 μL/kg/天），持续15天。定期采集血样，并每5天测量一次肿瘤大小。肿瘤大小以及循环中人κ链或λ链的存在情况用于评估肿瘤负荷。

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\n\nBuparlisib/BKM120 对已建立的多发性骨髓瘤 (MM) 的体内作用 [2]
\n将 100 万个 ARP-1 或 MM.1S 细胞悬浮于 50 μl 磷酸盐缓冲液 (PBS) 中，皮下接种于 6 至 8 周龄的雌性重症联合免疫缺陷 (SCID) 小鼠右侧腹部。待肿瘤可触及（肿瘤直径 ≥5 mm）后，小鼠接受腹腔注射 DMSO/PBS 或 Buparlisib/BKM120（5 μM/kg/天）治疗，持续 15 天。每 5 天测量一次肿瘤大小，并在同一时间采集血样。通过测量肿瘤大小和检测循环中的人κ链或λ链来评估肿瘤负荷。\n

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\n所有体内药理学研究均使用雌性裸鼠（nu/nu）（6-8周龄，20-25克）。小鼠饲养符合州和联邦关于人道对待和照顾实验动物的指导方针，并可自由摄取食物和水。使用胰蛋白酶-EDTA从对数生长期中期培养物中收集人卵巢癌A2780或神经胶质瘤U87MG细胞。将5×10⁶个A2780肿瘤细胞悬浮于HBSS中，总体积为100 μL，皮下注射到小鼠右侧腹部。当PK/PD研究中肿瘤体积达到200-400 mm³，疗效研究中肿瘤体积达到130-250 mm³时开始化合物治疗。所有化合物均采用口服给药。使用StudyDirector软件测定肿瘤体积。 [1]

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\n\n在PK/PD剂量依赖性研究中，荷A2780肿瘤小鼠单次口服不同浓度（3、10、30、60和100 mg/kg或溶剂对照）的化合物，并在给药10小时后切除肿瘤。使用预先用硫酸肝素预充的注射器进行心脏穿刺取血。将切除的肿瘤组织在干冰上速冻，并在液氮冷却的低温研钵中研磨成粉末，然后在含有蛋白酶抑制剂片剂（Complete；不含EDTA）的冷细胞提取缓冲液中裂解。将肿瘤裂解液在4℃下以300×g离心10分钟后取上清液，并用BCA法测定各上清液中的蛋白质浓度。将等量的肿瘤裂解液蛋白上样至10% Tris-甘氨酸凝胶，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后将蛋白从凝胶转移至PVDF膜。用识别磷酸化AktSer473或磷酸化AktThr308的抗体对膜进行探针检测，随后用HR标记的二抗（山羊抗兔IgG）进行检测。使用增强化学发光法和X光胶片显影阳性条带。采用类似方法测定相同肿瘤裂解液中的总AKT，作为每次测定中总蛋白的标准化值。扫描X光胶片上阳性条带的密度，并将每种化合物的靶点调节作用表示为每种化合物相对于载体处理的抑制百分比。[1]

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\n\n在U87MG或A2780异种移植模型中进行疗效研究时，将小鼠随机分组，平均肿瘤体积约为250mm³。动物每日口服给药（qd），剂量为30或60 mg/kg。给药体积根据体重调整，为4-8 mL/kg（0.1-0.2 mL）。每周两次测量肿瘤生长情况和动物体重，并每日进行临床观察，以监测与药物治疗相关的潜在毒性。通常，当载体对照组的肿瘤体积达到2000 mm³或观察到与化合物相关的不良临床症状时，研究终止。化合物15（Buparlisib/BKM120）在A2780和U87MG疗效研究中的体重如下。[1]

Buparlisib 尤其引人关注，因为它的溶解度最高（在晶体材料上为 170 μM），并且在基于细胞的检测中，它是最有效的双吗啉类化合物之一（50 nM 靶点调节；500 nM 细胞增殖）。[1]

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Buparlisib/15 的药代动力学性质在多种动物中进行了评估（表 5）。化合物 15 在不同动物中均表现出低至中等的清除率 (CL)，小鼠、大鼠、犬和猴的 CL 值分别为 11、3、13 和 7 mL/(min/kg)。此外，化合物 15 在不同动物中均表现出中等至高的口服生物利用度，小鼠、大鼠、犬和猴的口服生物利用度分别为 80%、50%、44% 和 100%。

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药代动力学和药效学评估[5]
总体而言，布帕利西布的药代动力学存在较大的患者间差异，但未发现布帕利西布与依维莫司之间存在药物相互作用（图3A；表3）。在基线和第1周期结束时采集的配对皮肤活检样本显示，药物与靶点结合，并伴有mTOR/PI3K信号分子生物标志物的预期调节。基线和治疗后皮肤活检样本中pS6和p4EBP1蛋白表达显著降低（图3B）。

基于这些令人鼓舞的啮齿动物药理活性，化合物 15/Buparlisib 被进一步研究。分析表明，化合物 15 在浓度高达 50 μM 时未表现出对 CYP450（3A4、2C9、2D6）的可逆性或时间依赖性抑制作用，在浓度高达 25 μM 时也未表现出对 CYP3A4 的诱导作用，具有高渗透性且无外排倾向，未显示出心脏毒性，并且对内部安全性和外部 MDS Pharma Services 检测小组所包含的酶、受体和转运蛋白均表现出良好的敏感性（>10 μM）。化合物 15 的熔点为 153 °C，其 log D (pH 7.4) 为 2.9，pKa 为 5.1。化合物 15 的合成路线简单，仅需四步即可完成（方案 1）。 [1]

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安全性、毒性和剂量限制性毒性 (DLT) [5]
发生率超过 20% 的最常见不良事件包括血小板减少症、厌食症、黏膜炎、恶心/呕吐、疲乏、转氨酶 (ALT/AST) 升高、高血糖、低钾血症和肌肉骨骼疼痛（表 2）。未发生与治疗相关的死亡，但截至本次分析时，所有入组患者中有 35 例 (81.4%) 已死亡。在剂量递增阶段接受治疗的 28 例可评估患者中，有 7 例出现 DLT。DLT 定义毒性包括 3 级尿路感染、3 级疲乏、3 级肌酐升高、3 级高血糖和 3 级副流感呼吸道感染。DLT 的详细信息及其发生的剂量水平见补充表 S1。依维莫司10 mg+60 mg和依维莫司5 mg+80 mg联合布帕利西布的最大给药剂量均无法耐受。基于剂量限制性毒性（DLT）窗口内的耐受性和4周窗口后的长期耐受性，依维莫司（每日5 mg）联合布帕利西布（每日60 mg）的剂量组合为最高耐受剂量，并被确定为推荐II期剂量（RP2D）。

[1]. Identification of NVP-BKM120 as a Potent, Selective, Orally Bioavailable Class I PI3 Kinase Inhibitor for Treating Cancer. ACS Med Chem Lett. 2011 Aug 26;2(10):774-9.

[2]. Novel phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor NVP-BKM120 induces apoptosis in myeloma cells and shows synergistic anti-myeloma activity. J Mol Med (Berl). 2012 Jun;90(6):695-706.

[3]. Combination inhibition of PI3K and mTORC1 yields durable remissions in mice bearing orthotopic patient-derived xenografts of HER2-positive breast cancer brain metastases. Nat Med. 2016 Jul;22(7):723-6.

[4]. Identifying and Targeting Sporadic Oncogenic Genetic Aberrations in Mouse Models of Triple Negative Breast Cancer. Cancer Discov. 2018 Mar;8(3):354-369.

[5]. A Phase I Study of Safety, Pharmacokinetics, and Pharmacodynamics of Concurrent Everolimus and Buparlisib Treatment in Advanced Solid Tumors. Clin Cancer Res. 2020 Jun 1;26(11):2497-2505.

磷脂酰肌醇-3-激酶 (PI3K) 是重要的肿瘤治疗靶点，因为该信号通路在多种人类癌症中均存在失调。本文描述了一系列 2-吗啉基、4-取代、6-杂环嘧啶类化合物的结构导向优化，其中通过调节 6 位杂环的电子性质改善了其药代动力学性质，并通过修饰 4 位取代基进一步微调了其整体成药性。所得的 2,4-双吗啉基 6-杂环嘧啶类化合物是强效的 I 类 PI3K 抑制剂，在 PI3K 依赖性细胞系中显示出机制调控作用，并在 PI3K 通路失调的肿瘤异种移植模型（A2780 卵巢癌和 U87MG 胶质瘤）中显示出体内疗效。这些努力最终发现了化合物 15 (NVP-BKM120)，目前该化合物正处于治疗癌症的 II 期临床试验阶段。[1]

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NVP-BKM120 是一种新型磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K) 抑制剂，目前正在进行实体瘤的 I 期临床试验。本研究旨在评估 BKM120 在多发性骨髓瘤 (MM) 中的治疗效果。BKM120 可抑制 MM 细胞系和新鲜分离的原代 MM 细胞的生长并诱导其凋亡。然而，BKM120 对正常淋巴细胞的细胞毒性有限。MM 骨髓基质细胞、胰岛素样生长因子或白细胞介素-6 的存在并不影响 BKM120 诱导的肿瘤细胞凋亡。更重要的是，BKM120 治疗可显著抑制体内肿瘤生长并延长荷瘤小鼠的生存期。此外，BKM120 与地塞米松在对地塞米松敏感的多发性骨髓瘤 (MM) 细胞中表现出协同细胞毒性。低剂量的 BKM120 和地塞米松（二者单独使用时细胞毒性均有限）可显著诱导 MM.1S 和 ARP-1 细胞凋亡。机制研究表明，BKM120 通过上调 p27 (Kip1) 和下调细胞周期蛋白 D1 导致细胞周期阻滞，并通过下调抗凋亡蛋白 XIAP 和上调细胞毒性小亚型 Bim（BimS）的表达诱导 caspase 依赖性凋亡。总之，我们的研究结果证实了BKM120在体外和体内均具有抗多发性骨髓瘤（MM）活性，并提示BKM120单独使用或与其他MM化疗药物（尤其是地塞米松）联合使用，可能是一种有前景的MM治疗方法。[2]

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BKM120/Buparlisib是一种氨基吡啶类化合物，其结构为4-(三氟甲基)吡啶-2-胺，5位被2,6-二(吗啉-4-基)嘧啶-4-基取代。它是一种具有抗肿瘤特性的选择性PI3K抑制剂，可作为EC 2.7.1.137（磷脂酰肌醇3-激酶）抑制剂和抗肿瘤药物发挥作用。它属于吗啉类、氨基嘧啶类、氨基吡啶类和有机氟化合物。
布帕利西布已用于淋巴瘤、转移瘤、肺癌、实体瘤和乳腺癌等多种癌症的治疗和基础研究临床试验。
布帕利西布是一种口服生物利用度高的特异性I类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）脂质激酶抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。布帕利西布以ATP竞争性方式特异性抑制PI3K/AKT激酶（或蛋白激酶B）信号通路中的I类PI3K，从而抑制第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸的产生和PI3K信号通路的激活。这可能导致易感肿瘤细胞群的生长和存活受到抑制。 PI3K信号通路的激活通常与肿瘤发生相关。PI3K信号通路的失调可能导致肿瘤对多种抗肿瘤药物产生耐药性。

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总之，我们描述了一系列具有高化学发光强度和低水溶性的6-氨基杂环、4-取代、2-吗啉代嘧啶类化合物的结构导向优化，最终得到适合临床开发的化合物。通过引入调节环电子性质的小基团修饰氨基杂环，可以提高药物的活性或降低体内化学发光强度。在嘧啶环C4中心位置引入吗啉基团可以提高水溶性，同时保持足够的活性、选择性和良好的体内性质。这些修饰的结合最终发现了一系列取代的6-氨基杂环、2,4-双吗啉代嘧啶类化合物。该系列化合物中，化合物 15（Buparlisib，NVP-BKM120）已进入人体试验阶段，目前正在进行 II 期临床试验。[1]

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总之，我们的研究证明了 BKM120 在体外和体内均具有抗多发性骨髓瘤活性。 Buparlisib/BKM120 单独使用或与其他抗骨髓瘤化疗药物（特别是地塞米松）联合使用，可能是治疗多发性骨髓瘤 (MM) 的有效药物。[2]

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目的：在临床前模型中，mTOR 和 PI3K 的同步抑制可提高疗效，这为本项针对晚期实体瘤患者的依维莫司和布帕利西布 (BKM120) 的 I 期研究提供了理论依据。患者和方法：我们采用贝叶斯剂量递增过量控制设计，在符合条件的患者中测试依维莫司（5 或 10 mg）和布帕利西布（20、40、60、80 和 100 mg）的递增剂量。在第1周期第8天和第15天采集血样进行药代动力学评估。在基线和第1周期结束时采集配对皮肤活检样本，评估药物对mTOR/PI3K通路调控的药效学影响。结果：我们纳入了43例患者，中位年龄为63岁（范围39-78岁）；其中25例（58.1%）为女性，35例（81.4%）为白种人，8例（18.6%）为黑人。最常见的毒性反应为高血糖、腹泻、恶心、疲乏和天冬氨酸氨基转移酶升高。7例患者观察到剂量限制性毒性反应，包括疲乏（3例）、高血糖（2例）、黏膜炎（1例）、急性肾损伤（1例）和尿路感染（1例）。该联合用药的II期推荐剂量（RP2D）确定为依维莫司（5 mg）和布帕利西布（60 mg）。在27例可评估疗效的患者中，最佳疗效为疾病进展3例（11%），疾病稳定24例（89%）。中位无进展生存期和总生存期分别为2.7个月（1.8-4.2个月）和9个月（6.4-13.2个月）。稳态药代动力学分析显示，依维莫司和布帕利西布联合用药的剂量标准化最大浓度和AUC值与单药药代动力学相当。[5]

C₁₈H₂₂CLF₃N₆O₂

446.85

446.144

C, 48.38; H, 4.96; Cl, 7.93; F, 12.75; N, 18.81; O, 7.16

1312445-63-8

Buparlisib;944396-07-0

66577015

White to yellow solid powder

2.674

90.36

2

11

3

30

530

0

NC(N=C1)=CC(C(F)(F)F)=C1C2=NC(N3CCOCC3)=NC(N4CCOCC4)=C2.[H]Cl

DGPLYAXBXJXEID-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C18H21F3N6O2.ClH/c19-18(20,21)13-9-15(22)23-11-12(13)14-10-16(26-1-5-28-6-2-26)25-17(24-14)27-3-7-29-8-4-27;/h9-11H,1-8H2,(H2,22,23);1H

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (5.59 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 0.5% CMC Na : 6mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。