BML-210 (CAY10433)

HDAC4; HDAC4-VP16-driven reporter
Myocyte Enhancer Factor-2 (MEF2) transcription factor (specifically binds to the hydrophobic pocket on the MADS-box/MEF2 domain, blocking its interaction with class IIa histone deacetylases (HDACs) such as HDAC4). The estimated Kd for the fluorinated analog NKL54 binding to the MEF2A (1-95) fragment is ~0.5 µM. The apparent IC50 of BML-210 for inhibiting HDAC4:MEF2 interaction in a mammalian two-hybrid assay is ~5 µM. [1]

BML-210（10、20 μM；24、48 小时）可抑制 NB4 细胞的生长和增殖[2]。 BML-210（10、20μM；24、48小时）使S期NB4细胞数量减少，20μM时，G0 BML-210（10、20μM；24、48小时）对细胞有细胞毒作用。 NB4细胞。 10 μM 的剂量足以使 BML-210 引起细胞死亡 [2]。在 NBT4 细胞中，BML-210（10、20 μM；24、48 小时）抑制 HDAC 表达和活性 [2]。 BML-210[1] 细胞系不会下调 HDAC4-VP16 表达。 NB4 细胞 浓度：10、20 μM 潜伏期：24、48 小时 结果：以时间和剂量依赖性方式减少 NB4 细胞生长和增殖。

---

在HeLa细胞的哺乳动物双杂交实验中，BML-210 剂量依赖性地抑制了由GAL4 DNA结合域与MEF2D融合蛋白（GAL4-MEF2D）和VP16激活域与HDAC4的MEF2结合基序融合蛋白（HDAC4-VP16）之间相互作用驱动的荧光素酶报告信号，表观IC50约为5 µM。[1]
BML-210 及其类似物（如NKL54, NKL30, NKL11）在转染的猴肾细胞（COS-7）和小鼠胚胎成纤维细胞（NIH 3T3）中同样抑制了HDAC4:MEF2驱动的报告信号。[1]
相反，泛HDAC抑制剂曲古抑菌素A (TSA)在其IC50浓度（100 nM）下，未显示对HDAC4:MEF2驱动报告信号的显著剂量依赖性抑制，这表明 BML-210 的作用机制不同于催化性HDAC抑制。[1]
在双杂交实验中，BML-210 并未显著降低HDAC4-VP16融合蛋白的表达水平。[1]
表面等离子共振（SPR）分析表明，将纯化的MEF2A (1-95)与递增浓度的 BML-210 预孵育，会降低其与固定的HDAC4 (AA 155-220)的结合信号。[1]
使用荧光素标记的HDAC4片段（AA 155-218）进行的荧光各向异性实验显示，逐步加入 BML-210 会导致各向异性逐渐衰减，表明HDAC4从MEF2上被置换下来。[1]
在共转染了FLAG标记的MEF2C和HDAC4的HeLa细胞中进行的染色质免疫沉淀（ChIP）实验表明，用10 µM BML-210 处理6小时，能显著降低HDAC4在内源性frataxin (FXN)启动子上的、由MEF2C介导的富集，而MEF2C本身的占据不受显著影响。[1]
在COS-7细胞中进行的免疫细胞化学显示，用类似物 NKL30 (10 µM) 处理过夜，诱导了HDAC4更弥散的细胞质定位，与载体处理的细胞相比，核内HDAC4强度降低了21%，而MEF2的核定位未发生显著改变。[1]
用类似物 NKL54 处理弗里德赖希共济失调症（FRDA）淋巴样细胞（GM15850）也减少了MEF2和HDAC4的共定位。[1]
BML-210 及其类似物属于庚二酰苯胺邻氨基苯胺（PAOA）类化合物。[1]

BML-210（20 mg/kg；腹腔注射；每周3次，持续两周）显着降低体重和肿瘤生长。在免疫缺陷裸鼠中，BML-210 对肿瘤生长或体重没有影响 (Nu/J)。

---

在这项研究中，研究人员表明，筛选出的表观遗传抑制剂GSK-LSD1、CUDC-101和BML-210在小鼠原位乳腺肿瘤中显示出抗肿瘤活性，它们上调了乳腺肿瘤细胞上主要组织相容性复合物I类介导的抗原提呈，并且用BML-210治疗使乳腺肿瘤对检查点程序性死亡抑制剂-1基本敏感。肿瘤有机T细胞筛查促进的肿瘤细胞杀伤活性的标准化测量可能有助于识别一系列癌症的候选免疫疗法[3]。

HDAC活性分析[2]
根据制造商的说明，使用ProteoJET™哺乳动物细胞裂解试剂（Fermentas，维尔纽斯，立陶宛）分离蛋白质。
根据制造商的说明，使用EpiQuik™HDAC活性/抑制测定试剂盒测定HDAC活性分析。使用帝肯Control Infinite 200酶标仪在450nm下测量吸光度。使用公式计算活性（ng/h/mL）。[2]

---

药物治疗和萤光素酶测定[1]
对于双杂交试验，除非另有说明，否则细胞用10µM药物处理过夜。DMSO的量保持在0.2%V/V以下。根据制造商的方案进行萤光素酶测定。荧光素酶反应相对于作为内部对照的Renilla荧光素酶进行了标准化。数据以归一化HDAC4:MEF2萤光素酶反应的平均值±标准差（n=2）表示，与每种情况下GAL4-VP16的归一化反应值相比，以校正萤光素酶信号的非特异性抑制。

---

对于 ¹⁹F NMR结合实验，将 BML-210 的氟化类似物NKL54（浓度范围0.5至5 µM）与MEF2A (1-95)蛋白片段（0.5至10 µM）在水性缓冲液（10 mM HEPES, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.66）中孵育30分钟。在25°C下采集¹⁹F NMR谱。监测CF₃共振峰的化学位移，其从-62.86 ppm（游离化合物）移至-63.23 ppm（与MEF2结合的化合物），从而估算结合常数（K_d ~0.5 µM）。[1]
对于 表面等离子共振（SPR）实验，将HDAC4的一个片段（氨基酸155-220）固定在CM5传感芯片上。使用纯化的MEF2A (1-95)蛋白作为分析物，以不同浓度流过芯片，生成结合传感图。为了测试抑制效果，在注射前将MEF2A与递增浓度的 BML-210 预孵育，并监测结合信号的降低。[1]
对于 荧光各向异性实验，通过半胱氨酸残基将HDAC4片段（AA 155-218）进行位点特异性标记（使用5-碘乙酰胺基荧光素，5-IAF）。通过测量荧光各向异性来监测递增浓度的MEF2A (1-95)与标记HDAC4的结合。为了测试抑制效果，将 BML-210 滴定到预先形成的MEF2-HDAC4复合物中，测量各向异性的降低（表明复合物解离）。[1]

细胞增殖测定[2]
细胞类型： NB4 细胞
测试浓度： 10, 20 μM
孵育时间： 24、48小时
实验结果：抑制细胞增殖，并以剂量和时间依赖性方式抑制NB4细胞的生长。

---

细胞周期分析 [2]
细胞类型： NB4 细胞
测试浓度： 10, 20 μM
孵育时间：24、48小时
实验结果：NB4细胞S期比例减少，G0/G1期比例增加。 10 μM 使 G0/G1 期在 24 小时和 48 小时时增加高达 70%。

---

细胞毒性测定 [2]
细胞类型： NB4 细胞
测试浓度： 10, 20 μM
孵育持续时间：24、48小时
实验结果：对NB4细胞的细胞毒性作用呈剂量和时间依赖性。

---

细胞凋亡分析 [2]
细胞类型： NB4 细胞
测试浓度： 10, 20 μM
孵育持续时间：24、48小时
实验结果：10 μM剂量诱导细胞凋亡。

---

蛋白质印迹分析[2]
细胞类型： NB4 细胞
测试浓度： 10、20 μM
孵育持续时间：24、48小时
实验结果：用10μM剂量处理48小时后，HDAC1基因表达量被高达 36% Aft 抑制

---

对于 哺乳动物双杂交实验，将HeLa、COS-7或NIH 3T3细胞共转染三种质粒：含有GAL4响应元件荧光素酶基因的报告质粒、表达GAL4 DNA结合域与MEF2D融合蛋白（GAL4-MEF2D）的质粒，以及表达VP16反式激活域与HDAC4的MEF2结合基序融合蛋白（HDAC4-VP16）的质粒。转染后，用化合物（例如 BML-210、其类似物或DMSO载体）处理细胞（通常为10 µM，过夜）。测量荧光素酶活性并归一化至内参对照（如海肾荧光素酶）。数据通常以DMSO处理对照细胞信号的百分比表示。[1]
对于 染色质免疫沉淀（ChIP），用表达FLAG标记的MEF2C和/或FLAG标记的HDAC4的质粒转染HeLa细胞。用 BML-210 (10 µM, 6小时) 或DMSO处理后，用甲醛固定细胞以使蛋白质与DNA交联。通过超声处理将染色质剪切，并使用抗FLAG抗体或对照IgG进行免疫沉淀。纯化沉淀的DNA，并使用针对frataxin (FXN)启动子区域的特异性引物进行定量实时PCR分析，以测量富集程度。[1]
对于 免疫细胞化学和细胞定位分析，用化合物（例如10 µM NKL30 或 NKL54）或DMSO处理COS-7细胞或FRDA淋巴样细胞（GM15850）过夜。固定、透化细胞，用针对MEF2和HDAC4的一抗染色，再用相应的荧光标记二抗染色。通常用染料复染细胞核。通过共聚焦显微镜采集图像。对于COS-7细胞的定量分析，测量细胞核内（由MEF2染色界定）HDAC4的平均荧光强度，并归一化至核内MEF2的强度。[1]

Animal/Disease Models: Female C57BL/6 mice, mouse breast cancer EO771 cells [3]
Doses: 20 mg/kg
Route of Administration: IP ;[3]. Three times a week for two weeks.
Experimental Results: Significant inhibition of tumor growth and weight.

[1]. Inhibition of the function of class IIa HDACs by blocking their interaction with MEF2. Nucleic Acids Res. 2012 Jul; 40(12): 5378–5388.

[2]. The Histone Deacetylase Inhibitor BML-210 Influences Gene and Protein Expression in Human Promyelocytic Leukemia NB4 Cells via Epigenetic Reprogramming. Int J Mol Sci. 2015 Aug; 16(8): 18252–18269.

[3]. An organoid-based screen for epigenetic inhibitors that stimulate antigen presentation and potentiate T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Biomed Eng. 2021 Nov;5(11):1320-1335.

BML-210 is a dicarboxylic acid diamide comprising suberic (octanedioic) acid coupled to aniline and 1,2-diaminobenzene. It has a role as an EC 3.5.1.98 (histone deacetylase) inhibitor and an antineoplastic agent. It is functionally related to a suberic acid.

---

BML-210 (N-(2-aminophenyl)-N'-phenyloctanediamine) is a member of the pimeloylanilide o-aminoanilide (PAOA) class of compounds. It was originally identified as an HDAC inhibitor that selectively induces histone acetylation but not tubulin acetylation. [1]
This study reveals a novel mechanism of action for BML-210 and related PAOA compounds: they directly bind to the transcription factor MEF2 at the same hydrophobic groove used by class IIa HDACs (e.g., HDAC4, HDAC9) for interaction. By blocking this protein-protein interaction, they prevent the recruitment of class IIa HDACs to MEF2-targeted gene promoters, thereby acting as indirect, subtype-selective inhibitors of class IIa HDAC function. [1]
BML-210 has been shown to enhance the expression of frataxin (FXN) in Friedreich's ataxia (FRDA) cells, a disease involving epigenetic silencing. This effect is proposed to be mediated, at least in part, by disrupting MEF2-mediated recruitment of transcriptional co-repressors like HDAC4 to the FXN promoter. [1]
Structure-guided synthesis of BML-210 analogs (e.g., varying phenyl ring substitutions and methylene linker length) yielded compounds with varying potency in inhibiting the MEF2:HDAC4 interaction, providing leads for further optimization. [1]
BML-210 has been reported in other contexts (not within the scope of this extraction from [1]) to induce growth inhibition, apoptosis, and differentiation in some leukemia cell lines. [1]

C20H25N3O2

339.4314

339.194

C, 70.77; H, 7.42; N, 12.38; O, 9.43

537034-17-6

9543540

White to off-white solid powder

1.2±0.1 g/cm3

632.5±40.0 °C at 760 mmHg

336.3±27.3 °C

0.0±1.9 mmHg at 25°C

1.633

2.58

84.22

3

3

9

25

408

0

O=C(C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])C1C([H])=C([H])C([H])=C([H])C=1[H])=O)N([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1N([H])[H]

RFLHBLWLFUFFDZ-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C20H25N3O2/c21-17-12-8-9-13-18(17)23-20(25)15-7-2-1-6-14-19(24)22-16-10-4-3-5-11-16/h3-5,8-13H,1-2,6-7,14-15,21H2,(H,22,24)(H,23,25)

N-(2-aminophenyl)-N'-phenyl-octanediamide

BML-210; CAY10433; BML 210; CAY-10433; BML210; BML-210; 537034-17-6; N1-(2-aminophenyl)-N8-phenyloctanediamide; BML-210(CAY10433); N-(2-aminophenyl)-N'-phenyl-octanediamide; CHEBI:61077; Octanediamide, N-(2-aminophenyl)-N'-phenyl-; CAY 10433.

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ≥ 30 mg/mL (~88.38 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (7.37 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。