GSK3α (IC50 = 66 nM); GSK3α (Kd = 4.8 μM); GSK-3β(WT) (IC50 = 515 nM)
GSK3α (IC50 = 66 nM; determined at Km of ATP in a mobility-shift microfluidic assay); GSK3β (IC50 = 515 nM; same assay). [1]
CDK family: CDK2 (IC50 = 6.87 μM), CDK3 (IC50 = 9.74 μM), CDK5 (IC50 = 9.20 μM) (87-, 123-, and 116-fold selective relative to GSK3α). [1]
NanoBRET target engagement in live 293 cells: Kd for GSK3α = 4.8 μM; Kd for GSK3β not reported for BRD0705 (BRD3731 gave Kd = 3.3 μM for GSK3β). [1] |
Glycogen synthase kinase 3α (GSK3α) - paralog-selective, orally active inhibitor (IC50 = 66 nM, Kd = 4.8 μM).

BRD0705抑制激酶功能，且不稳定β-catenin，从而减轻了潜在的肿瘤风险。BRD0705对健康造血细胞无影响，但可诱导髓系分化并抑制AML细胞的集落形成。[1]

---

BRD0705以时间和浓度依赖的方式抑制U937细胞中GSK3α Tyr279的自身磷酸化，但不影响GSK3β Tyr216的磷酸化（Western blot）。它降低了糖原合成酶（GYS，GSK3的直接底物）的磷酸化水平。其非活性对映体BRD5648未显示任何作用。[1]
在来自5例患者的原代AML原始细胞中，BRD0705选择性抑制GSK3α活性位点（p-GSK3α Y279），且不稳定β-catenin。 [1]在六种急性髓系白血病（AML）细胞系（HL-60、NB-4、U937、TF-1、MOLM13 和 MV4-11）中，BRD0705 诱导了细胞形态改变（May-Grunwald Giemsa 染色），并增加了细胞表面分化标志物 CD11b、CD11c 和 CD14 的表达（FACS 分析）。在五例原发性 AML 患者样本中，BRD0705 呈剂量依赖性地增加了 CD14 的表达，并降低了 CD117 的表达。[1]在甲基纤维素集落形成实验中，BRD0705 抑制了所有六种 AML 细胞系的集落形成（浓度依赖性）。它还降低了五例原发性 AML 患者样本的集落形成，但对正常人 CD34+ 细胞的集落形成没有影响。 [1] 在 GSK3α CRISPR/Cas9 敲除的 U937 克隆中，BRD0705 并未进一步增加 CD11b 的表达（与 DMSO 相比），证实了其靶向选择性。[1] 对用 BRD0705 (10 μM, 24 h) 处理的 U937 细胞进行 RNA-seq 分析显示，有 55 个基因上调，193 个基因下调。基因集富集分析 (GSEA) 显示分化转录程序被诱导，干性特征被下调，线粒体代谢程序被上调，但未观察到 β-catenin 通路基因的富集。[1] 在 HL-60、TF-1、MV4-11 或 MLL-AF9 小鼠白血病细胞中，BRD0705 并未增加总 β-catenin 蛋白水平或核转位（Western blot 和免疫荧光）。在HEK293T或TF-1细胞中，BRD0705并未激活TCF/LEF β-catenin报告基因。[1]
在AML细胞系（例如HL-60）中，BRD0705处理后观察到糖原积累（PAS染色和定量测定），这是一种靶向效应。[1] |
体外研究表明，BRD0705是一种强效且具有旁系同源选择性的GSK3α抑制剂，其IC50为66 nM，Kd为4.8 μM，对GSK3β（IC50 = 515 nM）的选择性约为8倍。该化合物可诱导AML细胞系和原代患者样本分化，降低与干性相关的转录程序，并抑制集落形成，而不影响正常造血细胞的生长。 BRD0705 对 GSK3α 相对于 GSK3β 的选择性对于理解这两种亚型在细胞功能和疾病中的不同作用至关重要。

BRD0705 可延缓 AML 小鼠模型中白血病的发生并延长其生存期。[1] 在同源 MLL-AF9 AML 小鼠模型中，BRD0705 预处理（10 μM，24 小时）显著抑制了继发受体小鼠（注射 25 万个细胞，每组 n=5，p<0.05）的白血病发展。极限稀释分析显示，BRD0705 预处理后，白血病起始细胞 (LIC) 的频率降低了 3.79 倍。[1] 在 MLL-AF9 模型中，每日两次 (BID) 口服 30 mg/kg 的 BRD0705 可显著提高小鼠的生存率，与载体组相比（每组 n=5，p<0.05，log-rank 检验）。 [1] 在原位HL-60异种移植模型（通过尾静脉注射荧光素标记的细胞至NSG小鼠体内）中，每日一次（QD）灌胃给予15或30 mg/kg的BRD0705可剂量依赖性地降低白血病进展（生物发光测量，15 mg/kg组p<0.05，30 mg/kg组p<0.01），并延长总生存期（每组n=5）。此外，它还能减少循环中的人CD45+ AML细胞。[1] 在原位MV4-11异种移植模型（经照射的NSG小鼠）中，每日一次（QD）给予30 mg/kg的BRD0705可显著降低疾病负荷（生物发光），并延长生存期，与载体组相比（每组n=10，p<0.05）。 [1] 在这些剂量和给药方案下，使用BRD0705未观察到明显的体重减轻和显著的血液毒性。外周血单核细胞中糖原的积累被证实是靶向活性的潜在生物标志物。[1] |
体内研究表明，BRD0705具有口服活性，支持其在急性髓系白血病动物模型中的应用。该化合物能够诱导AML细胞分化并抑制其集落形成，提示其在AML治疗中具有潜在的应用价值，因为GSK3α抑制剂可能促进白血病原始细胞的分化。该化合物对GSK3α的选择性高于GSK3β，这可能降低泛GSK3抑制相关的脱靶效应风险。需要进一步的研究来全面表征该化合物在AML和其他疾病动物模型中的药代动力学特性和疗效。

采用迁移率微流控分析法（Caliper）测定激酶抑制率。将纯化的 GSK3β 或 GSK3α 与测试化合物在 4.3 μM ATP（浓度接近或略低于 Km 值）和 1.5 μM 肽底物（肽 15）存在下，于 384 孔板中室温孵育 60 分钟。反应缓冲液包含 100 mM HEPES（pH 7.5）、10 mM MgCl₂、2.5 mM DTT、0.004% Tween-20 和 0.003% Brij-35。反应通过加入 10 mM EDTA 终止。底物和产物经电泳分离，并测定荧光强度。激酶活性以转化率表示。以化合物浓度为横坐标，抑制率作图，并通过逻辑剂量反应曲线拟合确定 IC₅₀ 值。化合物在12点剂量曲线中进行重复测试，起始浓度为33.3 μM，采用3倍系列稀释。数值为至少三次实验的平均值。[1]
为了评估活细胞中的功能选择性，我们使用了NanoBRET靶标结合分析。将表达GSK3α或GSK3β N端NanoLuc融合构建体的HEK293细胞用NanoBRET激酶示踪剂-06 (100 nM)和系列稀释的测试化合物处理2小时。加入NanoBRET NanoGlo底物和细胞外NanoLuc抑制剂，并测量过滤后的发光强度（供体波长450 nm，受体波长600 nm）。使用三参数曲线拟合绘制竞争性置换数据图，以计算Kd值。[1]
GSK3α激酶活性测定使用纯化的重组GSK3α酶、合适的肽底物以及ATP进行。将酶与底物和不同浓度的BRD0705一起孵育，并使用放射性ATP掺入法或荧光检测法测定激酶活性。IC50值由剂量反应曲线计算得出。使用纯化的GSK3α蛋白，通过表面等离子共振(SPR)或等温滴定量热法(ITC)测定结合亲和力(Kd)。使用类似的生化分析方法评估其对GSK3β和其他激酶的选择性。

用 20 μM 的 DMSO 或 BRD0705 处理 24 小时后，将 30,000 至 50,000 个细胞用 PBS/2%FBS 洗涤，然后离心涂片至聚赖氨酸包被的载玻片（EMS）。之后，将细胞在室温下用 1% BSA/0.05% Triton X-100 封闭 1 小时，用 4% 多聚甲醛（EMS）固定 20 分钟，用 0.2% Triton X-100（RPI）在 4°C 下透化 30 分钟，然后在室温下与一抗（抗 β-catenin，1/500）和二抗孵育 1 小时。每次抗体孵育后，用 PBS/2%FBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。最后，用含 DAPI 的 Prolong® Gold 抗淬灭剂封片，并使用 Yokogawa 旋转盘共聚焦/TIRF 系统进行成像。使用 Image-J 软件分析来自三个独立实验的代表性图像。

---

细胞培养：HL-60、U937、TF-1、NB-4、MV4-11、MOLM13 和 293T 细胞培养于含 10-20% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 RPMI 1640 或 DMEM 培养基中。原代 AML 单核细胞使用 Ficoll-Paque 从骨髓穿刺液中分离，并在含细胞因子（IL-3、IL-6、GM-CSF、FLT3-L、SCF）的 StemSpan SFEM 培养基中培养。[1]
Western 印迹：细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 Cell Signaling 裂解缓冲液中裂解。裂解液经 4-12% Bis-Tris 凝胶电泳分离后，转移至硝酸纤维素膜，用 5% BSA 封闭，然后与针对 p-GSK-3α/β (Y279/216)、总 GSK-3α/β、β-catenin、p-β-catenin (S675, S33/37/T41)、GYS、p-GYS (S641)、肌动蛋白或 vinculin 的一抗孵育，随后与 HRP 标记的二抗孵育。采用化学发光法进行检测。[1]
流式细胞术：处理 6 天后，细胞用抗人 CD11b (PE-Cy7)、CD11c (APC)、CD14 (APC) 或 CD117 (PE-Cy7) 抗体染色 35 分钟，洗涤后，在 BD FACSCanto II HTS 流式细胞仪上进行分析（每组 10,000 个细胞）。 [1]
甲基纤维素克隆形成：将250-500个细胞（细胞系）或2000-20000个细胞（原代AML细胞或正常CD34+细胞）接种于含DMSO或待测化合物的甲基纤维素培养基（ClonaCell-TCS或MethoCult H4236）中。7-10天后，MTT染色后计数克隆。[1]
CRISPR/Cas9基因敲除：用靶向GSK3α的lentiCRISPR v2载体（sgRNA序列已提供）转导U937细胞，生成同源基因敲除克隆。通过Western blot验证基因敲除。化合物处理后，通过FACS检测分化标志物CD11b。 [1]
TCF/LEF β-catenin 报告基因检测：将 HEK293T 细胞瞬时转染 7xTCF-luc-mCherry 报告基因，并用化合物处理 48 小时，然后裂解细胞并检测荧光素酶活性。将稳定感染 GFP β-catenin 报告基因的 TF-1 细胞处理 24 小时，并通过流式细胞术检测 GFP 表达。[1]
免疫荧光：将细胞涂片于聚赖氨酸载玻片上，用 4% 多聚甲醛固定，用 0.2% Triton X-100 透化，用 1% BSA 封闭，用抗 β-catenin 一抗染色，再用 Alexa Fluor 568 二抗染色，最后用 DAPI 封片。使用共聚焦显微镜采集图像。 [1]
糖原定量测定：处理3天后收集200万个细胞，用去离子水裂解，并使用比色/荧光试剂盒定量糖原。糖原含量以总蛋白含量（Bradford法）进行标准化。[1] |
BRD0705的细胞检测通常包括培养AML细胞系或原代患者样本，并用不同浓度的化合物处理。使用MTT或CellTiter-Glo法评估细胞活力。通过流式细胞术或形态学检查测量细胞表面标志物（例如CD11b、CD14）来评估分化。使用软琼脂或甲基纤维素集落形成试验评估集落形成。通过qRT-PCR检测MYC、NANOG和OCT4等基因来评估干性相关转录程序。同时评估该化合物对正常造血细胞生长的影响，以评价其选择性。

8周龄雄性NSG小鼠注射MLL-AF9 AML细胞
30 mg/kg
灌胃；每日两次

---

所有动物实验均经Dana-Farber癌症研究所动物护理委员会批准。使用NSG小鼠（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl/SzJ）或C57BL/6小鼠。[1]
对于HL-60原位异种移植模型：将2×10^6个荧光素标记的HL-60细胞经尾静脉注射到8周龄雄性NSG小鼠体内。注射后三天，将小鼠随机分组，每日一次（QD）通过灌胃给予赋形剂（7.5% NMP、10% Kolliphor HS15、30% PEG 400、52.5% 生理盐水；5 μL/g）或 BRD0705（15 或 30 mg/kg）。所有小鼠每日均接受 5% 葡萄糖皮下补液。使用 IVIS Spectrum 检测生物发光。采集全血进行流式细胞术分析。 [1]
对于 MV4-11 原位模型：将 2×10^6 个荧光素化的 MV4-11 细胞注射到受照射的 NSG 小鼠体内，注射后 4 天开始用载体、BRD0705（30 mg/kg QD）、BRD3731（30 mg/kg QD）或 BRD0320（30 mg/kg QD）进行治疗。 [1]
对于 MLL-AF9 同源模型：将 MLL-AF9-DsRed L-GMP 细胞用 DMSO 或 10 μM BRD0705（或其他化合物）处理 24 小时，然后将系列稀释的细胞（500,000；250,000；100,000；50,000）经尾静脉注射到亚致死剂量照射的 6 周龄雄性 C57BL/6 小鼠体内。监测小鼠存活率。[1]
对于 MLL-AF9 模型中的疗效研究：小鼠每日两次（BID）灌胃给予载体或 30 mg/kg 的 BRD0705。[1]
对于药代动力学研究：小鼠单次口服 BRD0705，可定量检测长达 24 小时的血浆药物浓度。 [1] |
在急性髓系白血病小鼠模型中评估了BRD0705的体内疗效。将AML细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，然后通过口服给药的方式用BRD0705治疗荷瘤小鼠。通过流式细胞术检测血液、骨髓和脾脏中的人CD45+细胞来评估白血病负荷。通过检测细胞表面标志物来评估白血病原始细胞的分化情况。监测小鼠的生存情况。评估该化合物降低白血病负荷和提高生存率的能力。进行药代动力学研究以确定该化合物的生物利用度和组织分布。

小鼠单次口服BRD0705后，血浆浓度可在24小时内定量检测，达峰时间（Tmax）为0.25小时，曲线下面积（AUC）为67.6 μmol/L·h。BRD0705在小鼠体内具有100%的口服生物利用度。[1] |
已对BRD0705的药代动力学特性进行了表征，以支持其作为口服活性研究工具的应用。该化合物的分子量为321.42，分子式为C20H23N3O。口服给药后，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析血浆和组织样本，测定了包括半衰期、清除率、分布容积和口服生物利用度在内的关键药代动力学参数。该化合物到达骨髓（急性髓系白血病（AML）的发生部位）的能力对其在白血病模型中的疗效至关重要。该化合物应以粉末形式储存于-20°C。

在小鼠模型（HL-60、MV4-11、MLL-AF9）中，以15和30 mg/kg的剂量（每日一次或两次）体内给予BRD0705后，未观察到明显的体重减轻和显著的血液毒性。[1] |
BRD0705的毒理学评价通常与动物模型中的疗效研究同步进行。标准毒理学评估包括针对一系列正常细胞系和癌细胞系的体外细胞毒性试验，以确定化合物的选择性指数。啮齿动物体内毒性研究包括急性毒性和重复给药毒性试验、临床症状和体重变化的观察，以及包括骨髓在内的主要器官的组织病理学检查。作为一种诱导分化的GSK3α抑制剂，其对正常造血细胞发育和其他组织的潜在影响受到密切监测。

[1]. Exploiting an Asp-Glu "switch" in glycogen synthase kinase 3 to design paralog-selective inhibitors for use in acute myeloid leukemia. Sci Transl Med. 2018 Mar 7;10(431). pii: eaam8460.

BRD0705 是一种首创的 GSK3α 选择性抑制剂，专为治疗急性髓系白血病 (AML) 而开发。其设计基于 GSK3β 和 GSK3α 在 ATP 结合域中单个氨基酸的差异（Asp133→Glu196）。与双重 GSK3α/β 抑制剂不同，BRD0705 不会稳定 β-catenin 或激活 WNT 通路，从而降低了基于机制的关键安全性问题。GSK3α 的基因抑制在 AML 中模拟了 BRD0705 的作用。该化合物对正常造血干/祖细胞无影响，具有潜在的治疗窗口。外周血单核细胞中的糖原积累被认为是未来临床试验中靶向活性的潜在生物标志物。 [1] |
BRD0705 是一种研究工具化合物，也是一种潜在的治疗药物，用于研究 GSK3α 在急性髓系白血病和其他疾病中的作用。该化合物尚未获准用于临床，仅供实验室研究之用。其作用机制涉及对 GSK3α 的强效且具有旁系同源选择性的抑制，从而诱导白血病细胞分化，降低干性相关转录程序，并抑制 AML 细胞的集落形成，而不影响正常造血细胞的生长。BRD0705 是首个 GSK3α 抑制剂，对于验证 GSK3α 作为 AML 治疗靶点以及研究 GSK3α 和 GSK3β 在细胞功能和疾病中的不同作用具有重要价值。

C16H12CLNO4S

349.788782119751

321.184

C, 74.74; H, 7.21; N, 13.07; O, 4.98

2056261-41-5

BRD5648;2056261-42-6;(Rac)-BRD0705;1597440-03-3

136980453

White to light yellow solid powder

4.2

57.8

2

3

2

24

561

1

CC[C@@]1(C2=C(NC3=C1C(=O)CC(C3)(C)C)NN=C2)C4=CC=CC=C4

NCKLQXXBRWCYMA-FQEVSTJZSA-N

InChI=1S/C20H23N3O/c1-4-20(13-8-6-5-7-9-13)14-12-21-23-18(14)22-15-10-19(2,3)11-16(24)17(15)20/h5-9,12H,4,10-11H2,1-3H3,(H2,21,22,23)/t20-/m0/s1

(4S)-4-ethyl-7,7-dimethyl-4-phenyl-1,6,8,9-tetrahydropyrazolo[3,4-b]quinolin-5-one

BRD0705; BRD-0705; BRD 0705

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: 64~300 mg/mL (199.1~933.4 mM)
Ethanol: ~64 mg/mL (~199.1 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 7.5 mg/mL (23.33 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 75.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 7.5 mg/mL (23.33 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 75.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入900 μL 玉米油中，混合均匀。

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。