BSJ-03-123   中文名称: BSJ-03-123 | PROTAC

Cereblon; CDK

BSJ-03-123 (BSJ) 可诱导 G1 细胞周期停滞，但不会明显促进细胞凋亡，因此在 CDK6 依赖性 AML 细胞系中发挥强大的抗增殖作用 [1]。

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BSJ-03–123通过形成差异三元络合物触发同源物选择性降解[1]
接下来，我们试图了解CDK6选择性的机制。体外激酶测定证实了与这两种激酶具有相当的亲和力（图S1A，表S1）。CDK4/6的类似细胞热稳定性进一步表明，选择性不是由细胞靶点的不同参与产生的（图2A）。因此，我们假设选择性可能源于三元络合物的差异形成。为了在完整细胞中实时监测三方组装，我们设计了一种基于NanoBiT®技术的萤光素酶互补测定法（图2B）。我们在293TCRBN−/−细胞中表达了C端CDK4/6 LgBit融合物和N端SmBit CRBN融合物。BSJ诱导CDK6和CRBN快速、剂量依赖性地形成三元复合物，但与CDK4和CRBN没有（图2C）。BSJ通气治疗未能诱导CDK6:CRBN相互作用（图2C）。通过用帕博或来那度胺预处理阻断CDK6或CRBN上的结合位点，可以防止三元复合物的形成（图2D）。因此，我们得出结论，BSJ利用CDK4和CDK6之间的结构差异，通过形成不同的三元络合物来实现CDK6的同源选择性降解。 BSJ-03–123可以利用CDK6的同源选择性依赖性[1]
为了鉴定一种与CDK4不成比例地依赖CDK6的细胞系统，我们在342个癌症细胞系中进行了基因组级CRISPR/Cas9筛选（Meyers et al.，2017）。我们发现，在CDK6成瘾程度最高的模型中，急性髓系白血病（AML）细胞系明显富集（图3A）。这些细胞系均未显示出对CDK4的可比依赖性（图S2A）。与基因表达数据的交叉没有揭示必要性和mRNA转录水平之间的相关性（图3A，S2A）（Klijn等人，2015）。不出所料，CRISPR/Cas9介导的AML细胞系MV4-11中CDK4的遗传耗竭揭示了基本上保留的生长动力学和细胞周期分布，支持CDK4在AML细胞系增殖中的不可替代的作用（图S2B-D）。

体外CRBN结合试验[1]
使用D300e数字分配器（HP）将Atto565来那度胺置换试验中的化合物分配到384孔微孔板中，并将其归一化为1%DMSO，加入10 nM Atto565去那度胺、100 nM DDB1∆B-CRBN、50 mM Tris pH 7.5、200 mM NaCl、0.1%Pluronic F-68溶液中。使用PHERAstar FS微孔板读数器监测荧光偏振的变化，每个周期为187秒。绘制三次独立测量（n=3）的数据，并使用GraphPad Prism 7中的可变斜率方程估算IC50值。

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细胞热位移测定[1]
用20µM palbociclib、BSJ-03–123或载体处理4×106 MV4-11 CRBN−/-细胞3小时。将1×106个细胞以500×g的速度离心5分钟，去除上清液。将颗粒在46、49、52或55°C下培养3分钟，然后在室温下培养3 min。加入30µl裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，120 mM NaCl，0.5%NP-40，蛋白酶抑制剂），通过三轮快速冷冻和解冻裂解细胞。在4°C下以14.000 x g的速度离心20分钟，去除变性蛋白质，并通过蛋白质印迹分析上清液。

增殖试验[1]
对于悬浮细胞系的随时间生长实验，将每孔300000个细胞接种在24孔板上，一式三份。计数细胞，每2天更新一次治疗。对于贴壁细胞系的随时间生长实验，将每孔100000个细胞接种在12孔板上，一式三份。细胞被胰蛋白酶消化并计数，每3天更新一次处理。对于集落形成试验，将每孔1000个细胞接种在6孔板中，一式两份。每2天更换一次培养基并更新处理。12天后，在室温下将细胞固定在1%PFA的PBS中15分钟，用PBS洗涤3次，并在室温下在结晶紫溶液（0.1%的10%乙醇溶液）中染色15分钟。再次用PBS洗涤细胞3次，并放置干燥过夜。

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细胞周期与凋亡[1]
对于细胞周期测量，将每孔106个细胞接种在24孔板上，一式三份。药物处理24小时后，通过500g离心5分钟收集细胞，并在1ml冷PBS中洗涤。再次旋转细胞，将其重新悬浮在200µl PBS中，加入800µl 70%乙醇固定，并在-20°C下孵育20分钟。用1ml PBS洗涤细胞，并用500µl碘化丙啶溶液（50µg/ml碘化丙啶，200µg/ml RNase A，PBS溶液）染色。使用FACSCalibur通过流式细胞术测量细胞DNA含量，并使用FlowJo v10软件进行分析。 根据制造商的说明，使用Caspase Glo 3/7对凋亡细胞进行分析。将每孔20000个细胞一式三份接种在白色96孔板上，总体积为50µl。与处理物孵育24小时后，每孔加入45µl Caspase-Glo底物。将该板在室温下在黑暗中孵育1小时，并在Victor X3微孔板读数器上测量发光。将发光信号归一化为载体处理的细胞。

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免疫印迹[1]
在RIPA缓冲液（150 nM NaCl、0.1%Triton X-100、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%SDS、50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、蛋白酶抑制剂、苯并酶）中裂解2×106个细胞。将含有40µg蛋白质的细胞裂解物装载在Bolt™4-12%Bis-Tris Plus凝胶上，进行SDS-PAGE，然后转移到0.45µM硝化纤维膜上。以下抗体用于检测：

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NanoBiT®检测[1]
NanoBiT®测定是按照制造商的说明进行的。将全长CDK4和CDK6克隆到pBit1.1-C[TK/LgBiT]载体中，将全长CRBN克隆到pBit 2.1-N[TK/SmBiT]中。将400000个CRBN缺陷的HEK293T细胞接种在6孔板中，并在第二天根据制造商的说明使用Lipofectamine用750µg CDK4/6-LgBit和CRBN SmBit转染。24小时后，分离细胞，将每孔50.000个细胞接种在96孔板上，并允许其附着过夜。在测定之前，用100µl补充有25mM HEPES的环境温度新鲜培养基交换培养基，并在室温下孵育平板10分钟以达到平衡。每孔加入25µl Nano Glo®活细胞试剂，孵育5分钟，在Victor X3上测量基线发光，积分时间为2秒。每孔加入10µl 13.5X药物储备，每2分钟通过连续测量监测发光信号的发射。将信号归一化为基线和载体处理的细胞。

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表达蛋白质组学BSJ-03–123[1]
样品制备：[1]
用100 nM BSJ-03–123处理15×106 MOLT4细胞2小时，一式三份。用PBS洗涤细胞三次，吸出上清液，将颗粒在液氮中快速冷冻。每个洗涤过的细胞沉淀分别在40µL新鲜制备的裂解缓冲液中裂解，该缓冲液含有50 mM HEPES（pH 8.0）、2%SDS、0.1 M DTT、1 mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物。样品在室温下放置20分钟，然后加热至99°C 5分钟。冷却至室温后，使用Covaris S2高性能超声波仪通过超声波处理剪切DNA。在20°C下以20.000×g离心15分钟，去除细胞碎片。将上清液转移到新鲜的eppendorf管中，并使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。使用分子量为30kDa的截留过滤器进行FASP。在过滤器单元中，将50微升每种清除的蛋白质提取物与200µL新鲜制备的8 M尿素在100 mM Tris-HCl（pH 8.5）（UA溶液）中混合，并在20°C下以14.000×g的速度离心15分钟，以去除SDS。用200µL UA进行第二次洗涤，洗掉任何残留的SDS。在室温下，用100µL 50 mM碘乙酰胺在黑暗中烷基化蛋白质30分钟。然后，用100μL UA溶液进行三次洗涤，然后用100µL 50 mM TEAB缓冲液进行三次洗涤。在37°C下用胰蛋白酶消化蛋白质过夜。使用40µL 50 mM TEAB缓冲液和50µL 0.5 M NaCl回收肽。使用C18固相萃取旋转柱对肽进行脱盐。脱盐后，根据制造商的说法，肽用TMT 10plex™试剂标记。在标记反应淬灭后，合并标记的肽，在45°C的真空浓缩器中去除有机溶剂，并在含有20mM甲酸铵缓冲液的5%乙腈中复溶，pH 10，用于使用高pH反相液相色谱（2D-RP/RP-HPLC）进行离线分级。

[1]. Homolog-Selective Degradation as a Strategy to Probe the Function of CDK6 in AML. Cell Chem Biol. 2019 Feb 21;26(2):300-306.e9.

鉴于底物或辅因子结合位点的结构相似性，开发高选择性小分子一直是配体发现领域的一项长期挑战。对于ATP竞争性激酶抑制剂而言，选择性不足尤其令人担忧，因为缺乏选择性会限制其可达到的治疗窗口。这阻碍了利用基因定义的依赖性进行药物治疗。本文介绍了一种同源选择性CDK6降解剂BSJ-03–123（BSJ）。BSJ通过差异性三元复合物的形成，实现了对CDK6的蛋白质组范围内的选择性。BSJ的选择性使其能够利用超越双重CDK4/6抑制剂所能达到的分辨率的基因依赖性。我们特别指出，BSJ能够利用急性髓系白血病（AML）细胞对CDK6的同源选择性依赖性，从而凸显了选择性CDK6降解剂在进一步转化研究中的潜力，并有望降低总体毒性。 CDK6的降解迅速且高效，这使我们能够绘制急性CDK6功能紊乱对下游信号网络和转录程序的整体影响图谱。虽然我们不能排除BSJ在饱和浓度下也会催化抑制CDK4，但在所检测的浓度下并未观察到抑制作用。CDK6降解和CDK4/6抑制的比较分析表明，在急性髓系白血病（AML）中，CDK6主要通过其激酶活性整合信号传导和基因活性。我们的分析发现了一些先前未与CDK6关联的信号节点和转录枢纽，例如BCL11A和NCOR2，未来需要开展进一步研究，探索这些通路在AML及其他疾病中的功能相关性。CDK6在其他恶性肿瘤以及造血干细胞和白血病干细胞中也发挥着重要作用。选择性降解CDK6将有助于区分相关的分子机制，并进一步厘清激酶依赖性和非依赖性功能。未来的药物化学研究需要拓展本文提出的概念，并开发一系列选择性降解剂，以前所未有的精度和动力学分辨率研究蛋白激酶的作用。[1]

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选择性小分子的设计常常因配体结合口袋的相似性而受阻。本文报道了一种基于邻苯二甲酰亚胺的降解剂BSJ-03–123，它利用蛋白质界面决定簇实现了对细胞周期蛋白依赖性激酶6 (CDK6) 降解的蛋白质组范围选择性。药理学方法降解CDK6可选择性地抑制急性髓系白血病细胞的活性，而对CDK6急性降解的转录组学和磷酸化蛋白质组学分析则能够动态地揭示其在协调信号传导和转录中的直接作用。[1]

C47H56N10O11

937

936.413

C, 60.25; H, 6.02; N, 14.95; O, 18.78

2361493-16-3

BSJ-03-123 HCl;2361493-16-3;

137628658

White to yellow solid powder

1.4±0.1 g/cm3

1.628

0.28

244

3

17

21

68

1870

0

O=C1C(C(C)=O)=C(C)C2=CN=C(NC3C=CC(=CN=3)N3CCN(CCOCCOCCOCCNC(COC4=CC=CC5=C4C(N(C5=O)C4C(NC(CC4)=O)=O)=O)=O)CC3)N=C2N1C1CCCC1

PHXAASMYZCBYHV-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C48H57N9O11/c1-30-35-28-51-40(26-37(35)56(32-6-3-4-7-32)47(63)43(30)31(2)58)52-39-12-10-33(27-50-39)55-17-15-54(16-18-55)19-21-66-23-25-67-24-22-65-20-14-49-42(60)29-68-38-9-5-8-34-44(38)48(64)57(46(34)62)36-11-13-41(59)53-45(36)61/h5,8-10,12,26-28,32,36H,3-4,6-7,11,13-25,29H2,1-2H3,(H,49,60)(H,50,51,52)(H,53,59,61)

N-(2-(2-(2-(2-(4-(6-((3-acetyl-1-cyclopentyl-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-1,6-naphthyridin-7-yl)amino)pyridin-3-yl)piperazin-1-yl)ethoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl)-2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)oxy)acetamide

BSJ-03123; BSJ03123; BSJ 03123; BSJ-03-123; 2361493-16-3; N-(2-(2-(2-(2-(4-(6-((6-Acetyl-8-cyclopentyl-5-methyl-7-oxo-7,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-2-yl)amino)pyridin-3-yl)piperazin-1-yl)ethoxy)ethoxy)ethoxy)ethyl)-2-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindolin-4-yl)oxy)acetamide; N-[2-[2-[2-[2-[4-[6-[(6-acetyl-8-cyclopentyl-5-methyl-7-oxopyrido[2,3-d]pyrimidin-2-yl)amino]pyridin-3-yl]piperazin-1-yl]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethyl]-2-[2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1,3-dioxoisoindol-4-yl]oxyacetamide; CHEMBL5204174; SCHEMBL22199840; BSJ-03-123; BSJ03-123; BSJ 03-123

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 本产品在运输和储存过程中需避光。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~106.72 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (2.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (2.67 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。