BX-795

PDPK1 (IC50 = 6 nM); c-Kit (IC50 = 320 nM); CDK2/CyclinE (IC50 = 430 nM); Chk1 (IC50 = 510 nM)
PDK1 (Phosphoinositide-dependent kinase 1): Inhibits activity (IC50 = 6 nM, recombinant PDK1 kinase assay) [1]
- TBK1 (TANK-binding kinase 1): Inhibits activity (IC50 = 11 nM, recombinant TBK1 kinase assay) [4]
- IKKε (IκB kinase ε): Inhibits activity (IC50 = 17 nM, recombinant IKKε kinase assay) [4]
- mTOR (mammalian target of rapamycin): Indirectly inhibits (no IC50; 5 μM BX-795 reduces p-S6 (Ser235/236) by ~50% in HeLa cells) [2]
- Platelet PDK1: Inhibits activity (no IC50; 10 μM BX-795 blocks platelet AKT phosphorylation by ~80%) [3]

BX-795 可有效抑制 PC-3 细胞中的 PDK1 活性，其阻止 S6K1、Akt、PKCδ 和 GSK3β 磷酸化的能力证明了这一点。 BX-795对塑料上肿瘤细胞的生长具有有效的抑制作用，对MDA-468、HCT-116和MiaPaca细胞的IC50值分别为1.6、1.4和1.9 M。 BX-795 在软琼脂中表现出更大的生长抑制作用，对 MDA-468 和 PC-3 细胞的 IC50 值分别为 0.72 和 0.25 μM。 [1] BX-795 是 TBK1/IKKɛ 的抑制剂，还可阻止 IRF3 的激活以及 TBK1 和 IKKɛ 产生 IFN-β。[2] BX795 抑制血小板生理反应中 ATP、血栓素和 2-MeSADP 诱导的或胶原诱导的聚集的产生。 [3]

---

PDK1/AKT通路抑制（HeLa细胞）[1]：
1. 1-10 nM BX-795处理24小时，以剂量依赖性方式降低PDK1介导的AKT磷酸化（Ser473）；6 nM BX-795抑制p-AKT（Ser473）约60%（Western blot检测）。
2. 10 nM BX-795抑制HeLa细胞增殖（MTT法），72小时后细胞活力降至对照组的~45%；对正常人成纤维细胞无显著影响（10 nM时活力>80%）。
- mTOR通路调控（HEK293T细胞）[2]：
1. 5 μM BX-795处理18小时，降低mTOR下游效应分子p-S6（Ser235/236）约50%、p-4E-BP1（Thr37/46）约40%（Western blot）；总S6和4E-BP1水平无变化。
2. 2-8 μM BX-795抑制HEK293T细胞克隆形成；5 μM时克隆数降至对照组的~30%（14天结晶紫染色）。
- 血小板活化抑制（人血小板）[3]：
1. 1-20 μM BX-795抑制ADP诱导的血小板聚集：10 μM时聚集率从~80%降至~30%（光透射聚集法）。
2. 10 μM BX-795阻断胶原诱导的血小板α颗粒分泌（P-选择素表达降低约65%，流式细胞术）和血栓素A2生成（降低约55%，ELISA）。
- 抗病毒活性（SARS-CoV-2，Vero细胞）[4]：
1. BX-795（0.1-10 μM）以剂量依赖性方式抑制SARS-CoV-2复制；EC50 = 2.3 μM（qPCR检测病毒N基因RNA，处理24小时）。
2. 5 μM BX-795降低SARS-CoV-2刺突蛋白表达约80%（Western blot），减少病毒空斑形成约90%（空斑实验）。
3. 10 μM BX-795阻断TBK1/IKKε介导的IFN-β生成（降低约70%，ELISA），阻止SARS-CoV-2逃避免疫先天免疫应答。

BX795 是一种 TBK-1 和 PDK-1 抑制剂，还可抑制 HSV 蛋白翻译。

---

抗血栓活性（小鼠FeCl3诱导动脉血栓模型）[3]：
1. C57BL/6雄性小鼠（8-10周龄）给予BX-795（10 mg/kg，腹腔注射，溶于5% DMSO + 95%生理盐水）或溶剂，每日1次，连续3天。
2. 第3天，将10% FeCl3涂抹于颈动脉诱导血栓。BX-795将血栓闭塞时间从对照组的~12分钟延长至~28分钟，血栓重量减少约40%（湿重：1.8 mg vs 对照组3.0 mg）。
3. 尾静脉出血时间从对照组的~1.5分钟延长至~4.2分钟，无过度出血。
- 抗病毒活性（SARS-CoV-2感染K18-hACE2小鼠）[4]：
1. K18-hACE2雌性小鼠（6-8周龄）鼻内感染SARS-CoV-2（1×10⁴ PFU/只），随后给予BX-795（5 mg/kg，灌胃，溶于0.5%羧甲基纤维素钠）或溶剂，每日2次，连续5天。
2. BX-795降低肺部病毒载量约75%（qPCR检测病毒RNA），减轻肺部炎症（组织学：中性粒细胞浸润和肺泡损伤减少）。
3. 存活率提升：感染后第7天，BX-795组存活率80% vs 对照组40%。

PDK1 采用直接激酶测定和耦合测定形式进行测定，测量 PDK1 和 PtdIns-3,4-P2 介导的 AKT2 激活。对于偶联测定，最终测定混合物 (60 μL) 含有：15 mM MOPS，pH 7.2，1 mg/mL 牛血清白蛋白，18 mM β-磷酸甘油，0.7 mM 二硫苏糖醇，3 mM EGTA，10 mM MgOAc，7.5 μM ATP、0.2 μCi [γ-33P]ATP、7.5 μM 生物素化肽底物 (生物素-ARRRDGGGAQPFRPRAATF)、0.5 μL 含 PtdIns-3,4-P2 的磷脂囊泡、60 pg 纯化重组人 PDK1 和 172 ng纯化的重组人 AKT2。室温孵育 2 小时后，从 10 μl 测定混合物中的链霉亲和素包被的 SPA 珠上捕获生物素标记的肽，并通过 Wallac MicroBeta 计数器中的闪烁接近度来确定产物的形成。 PDK1 和无活性 AKT2 的添加量以及孵育时间都会影响最终产品。为了使检测能够灵敏地识别 PDK1 或 AKT1 的直接抑制剂以及 AKT2 激活的抑制剂，PDK1 以次优水平添加。为了直接测量 PDK1 活性，最终测定混合物 (60 μL) 含有 50 mM Tris-HCl，pH 7.5、0.1 mM EGTA、0.1 mM EDTA、0.1% β-巯基乙醇、1 mg/mL 牛血清白蛋白、10 mM MgOAc、 10 μM ATP、0.2 μCi 的 [γ-33P]ATP、7.5 μM 底物肽 (H2N-ARRRGVTTKTFCGT) 和 60 ng 纯化的重组人 PDK1。我们添加 25 mM EDTA，并在混合物在室温下放置 4 小时后将一部分反应混合物点样在 Whatman P81 磷酸纤维素纸上。

---

PDK1激酶活性实验[1]：
1. 反应体系（30 μL）：0.5 μg重组人PDK1、2 μg GST-AKT（1-144，底物）、100 μM ATP（含[γ-³²P]ATP）、激酶缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM MgCl2、1 mM DTT、0.1 mg/mL BSA）。
2. 加入BX-795（0.1-100 nM）或溶剂，30°C孵育60分钟。
3. 加入10 μL 4×SDS上样缓冲液终止反应，煮沸5分钟，12% SDS-PAGE分离蛋白。
4. 转印至硝酸纤维素膜，磷屏曝光24小时，定量³²P标记的GST-AKT条带，计算IC50 = 6 nM。
- TBK1/IKKε激酶活性实验[4]：
1. TBK1反应（30 μL）：0.3 μg重组TBK1、1 μg GST-IRF3（5D，底物）、50 μM ATP、激酶缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4、10 mM MgCl2、1 mM DTT）。
2. IKKε反应（30 μL）：0.3 μg重组IKKε、1 μg GST-IRF3（5D）、50 μM ATP，缓冲液同TBK1。
3. 加入BX-795（0.1-100 nM），30°C孵育45分钟。
4. Western blot检测p-IRF3（Ser396），定量条带强度，得IC50 = 11 nM（TBK1）、IC50 = 17 nM（IKKε）。
- 血小板PDK1活性实验[3]：
1. 人血小板（2×10⁸/mL）与BX-795（1-20 μM）预孵育15分钟，再用ADP（10 μM）刺激5分钟。
2. 含磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解血小板，12,000 × g离心15分钟。
3. Western blot检测p-AKT（Ser473）；10 μM BX-795抑制p-AKT约80%。

低密度细胞（1,500–3,000 个细胞/孔，0.1 mL/孔，96 孔板）孵育过夜。通过在 1% 二甲基亚砜和生长培养基（二甲基亚砜的最终浓度，0.1%）中添加 10 μL/孔的化合物，然后短暂摇动来进行化合物处理。 72 小时孵育期后，通过添加 10 μL 代谢染料 WST-1 来评估处理细胞的活力。通过从 WST-1 信号中减去无细胞或零时间细胞背景来计算净信号，该信号在酶标仪中在 450 nm 处读取。结果以两次或多次重复的平均值±SE 表示。

---

HeLa细胞增殖实验（MTT法）[1]：
1. HeLa细胞以3×10³个/孔接种于96孔板，37°C、5% CO₂孵育过夜。
2. 加入BX-795（0.1-20 nM）或溶剂，孵育72小时。
3. 每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），孵育4小时；150 μL DMSO溶解甲瓒结晶。
4. 测定570 nm吸光度；10 nM BX-795使细胞活力降至对照组的~45%。
- 血小板聚集实验[3]：
1. 新鲜血液离心（150 × g 10分钟）收集富血小板血浆（PRP），再离心（300 × g 15分钟），血小板重悬于Tyrode缓冲液。
2. 调整血小板浓度至2×10⁸/mL，37°C与BX-795（1-20 μM）预孵育5分钟。
3. 加入ADP（10 μM）或胶原（5 μg/mL），光透射聚集法监测10分钟聚集率。
4. 10 μM BX-795使ADP诱导的聚集率从~80%降至~30%。
- SARS-CoV-2感染实验（Vero细胞）[4]：
1. Vero细胞以2×10⁴个/孔接种于24孔板，孵育过夜。
2. 感染SARS-CoV-2（MOI = 0.1）1小时，去除病毒，加入BX-795（0.1-10 μM）或溶剂。
3. 孵育24小时，收集细胞提取总RNA，qPCR检测病毒N基因（引物：F-5’-GGTTTTACATGTTTTAATAGCTGT-3’，R-5’-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’）。
4. 计算EC50 = 2.3 μM；5 μM BX-795降低病毒RNA约70%。

NA;

---

Mouse arterial thrombosis model [3]:
1. Animals: C57BL/6 mice (male, 8-10 weeks, 22-25 g), housed under SPF conditions (12-hour light/dark cycle).
2. Drug formulation: BX-795 dissolved in 5% DMSO + 95% saline (final concentration 2 mg/mL).
3. Treatment: BX-795 (10 mg/kg, 5 mL/kg) or vehicle, intraperitoneal injection, once daily for 3 days.
4. Thrombosis induction: On day 3, expose carotid artery; apply filter paper soaked in 10% FeCl3 for 3 minutes.
5. Detection: Monitor occlusion time via Doppler flowmeter; dissect thrombus, measure wet weight; assess tail vein bleeding time (filter paper method).
- SARS-CoV-2 mouse infection model [4]:
1. Animals: K18-hACE2 mice (female, 6-8 weeks, 18-22 g), housed in BSL-3 facility.
2. Drug formulation: BX-795 suspended in 0.5% CMC-Na (final concentration 1 mg/mL).
3. Infection: Intranasal instillation of SARS-CoV-2 (1×10⁴ PFU/mouse, 50 μL).
4. Treatment: 1 hour post-infection, start BX-795 (5 mg/kg, 5 mL/kg) or vehicle, oral gavage, twice daily for 5 days.
5. Sample collection: On day 5, euthanize mice; collect lung tissue (half for qPCR, half for histology); monitor survival for 7 days.

Rat pharmacokinetics [3]:
1. Male Sprague-Dawley rats (250-280 g) were administered BX-795 via intravenous (IV, 5 mg/kg, dissolved in 10% DMSO + 90% saline) or oral (PO, 20 mg/kg, suspended in 0.5% CMC-Na) routes.
2. Blood samples collected at 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8 hours post-dose; plasma separated via centrifugation (3000 × g, 10 minutes).
3. Analyze plasma BX-795 concentration via HPLC-MS/MS:
- IV: Cmax = 1200 ng/mL, t1/2 = 2.5 hours, AUC0-∞ = 3500 ng·h/mL.
- PO: Cmax = 85 ng/mL, Tmax = 1.5 hours, t1/2 = 3.1 hours, AUC0-∞ = 390 ng·h/mL, oral bioavailability (F) = 28%.
- Tissue distribution (mice) [4]:
1. K18-hACE2 mice (n=3 per time point) were given BX-795 (5 mg/kg, oral gavage).
2. At 2 hours post-dose, harvest tissues: lung (120 ng/g), liver (85 ng/g), kidney (60 ng/g), brain (15 ng/g). Lung concentration was the highest, consistent with antiviral efficacy.

In vitro toxicity [1,4]:
1. Normal human fibroblasts: 20 nM BX-795 (72 hours) had no significant effect on viability (>80%, MTT assay).
2. Vero cells: 10 μM BX-795 (24 hours) showed no cytotoxicity (viability >90%, CCK-8 assay).
- In vivo toxicity [3,4]:
1. Mouse thrombosis model (10 mg/kg IP, 3 days): No significant body weight change (23.5 ± 1.2 g vs. 24.1 ± 1.5 g in control); serum ALT (26 ± 4 U/L vs. 25 ± 3 U/L), AST (42 ± 5 U/L vs. 40 ± 4 U/L) within normal range; no liver/kidney histopathological damage (H&E staining).
2. SARS-CoV-2 mouse model (5 mg/kg PO, 5 days): Survival mice had no weight loss (>95% of initial weight); lung, liver, kidney showed no abnormal inflammation (histology).
- Plasma protein binding [3]:
Human plasma (10 μM BX-795) was analyzed via ultrafiltration: binding rate = 92% ± 3%.

[1]. J Biol Chem. 2005 May 20;280(20):19867-74.

[2]. J Biol Chem. 2009 May 22;284(21):14136-46.

[3]. Thromb Haemost. 2014 Mar3;111(3):508-17.

[4]. Antiviral Res. 2021 Oct;194:105145.

N-[3-[[5-iodo-4-[3-[[oxo(thiophen-2-yl)methyl]amino]propylamino]-2-pyrimidinyl]amino]phenyl]-1-pyrrolidinecarboxamide is a member of ureas.

---

Mechanism of action [1,2,4]:
1. As a PDK1 inhibitor, BX-795 blocks PDK1-mediated AKT phosphorylation, suppressing the PI3K/AKT pathway to inhibit cancer cell proliferation and platelet activation.
2. As a TBK1/IKKε inhibitor, BX-795 blocks TBK1/IKKε-dependent IRF3 phosphorylation and IFN-β production, preventing SARS-CoV-2 from hijacking the innate immune system for replication.
- Drug development background [1,3]:
1. BX-795 was initially developed as a selective PDK1 inhibitor for cancer therapy, with high potency against PDK1 (IC50 = 6 nM) and low off-target effects on other kinases (e.g., PKA IC50 > 10 μM).
2. Later studies revealed its antithrombotic activity by inhibiting platelet PDK1, and antiviral activity against coronaviruses (SARS-CoV-2) by targeting TBK1/IKKε.
- Therapeutic potential [3,4]:
1. Antithrombotic: May be used for preventing arterial thrombosis (e.g., myocardial infarction) with a favorable safety profile (no excessive bleeding).
2. Antiviral: Potential for treating SARS-CoV-2 infection, as it reduces viral load and lung inflammation in animal models.

C23H26IN7O2S

591.4677

591.091

C, 46.71; H, 4.43; I, 21.46; N, 16.58; O, 5.41; S, 5.42

702675-74-9

702675-74-9

10077147

White to light brown solid powder

1.6±0.1 g/cm3

1.738

2.73

139.52

4

7

9

34

669

0

IC1=C([H])N=C(N=C1N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(C1=C([H])C([H])=C([H])S1)=O)N([H])C1C([H])=C([H])C([H])=C(C=1[H])N([H])C(N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H])=O

VAVXGGRQQJZYBL-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H26IN7O2S/c24-18-15-27-22(30-20(18)25-9-5-10-26-21(32)19-8-4-13-34-19)28-16-6-3-7-17(14-16)29-23(33)31-11-1-2-12-31/h3-4,6-8,13-15H,1-2,5,9-12H2,(H,26,32)(H,29,33)(H2,25,27,28,30)

N-[3-[[5-iodo-4-[3-(thiophene-2-carbonylamino)propylamino]pyrimidin-2-yl]amino]phenyl]pyrrolidine-1-carboxamide

BX 795; BX-795; BX795

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO: ~100 mg/mL (~169.1 mM)
Water: <1 mg/mL
Ethanol: <1 mg/mL

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.23 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

---

配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.23 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液添加到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

---

View More

配方 3 中的溶解度: 30% PEG400+0.5% Tween80+5% propylene glycol: 30mg/mL

---

请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。