CA3 (CIL-56)

YAP/TEAD interaction
The target of CA3 (CIL-56) is Yes-associated protein 1 (YAP1)/Tead transcriptional complex; [1]

在体外，CA3显着减少食管腺癌细胞的生长。诱导细胞凋亡、减少肿瘤球形成和减少 ALDH1+ 细胞的数量都是 CA3 可能的作用。在 293T 细胞中共转染每个转录因子的单独启动子荧光素酶后，CA3 特异性抑制 Tead/YAP1 转录活性，但对 Super-TOP/Wnt、CBF1/Notch 或 AP-1 没有影响。抗辐射食管腺癌细胞中富含的 CSC 特性优先被 CA3 抑制[1]。

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1. 抑制YAP1/Tead转录活性：在共转染Gal4-Tead、5×UAS-荧光素酶和YAP1 cDNA的293T细胞中，与其他化合物（A414、A432、A413、A433、VP）相比，CA3 (CIL-56)处理可显著降低YAP1/Tead荧光素酶报告基因活性。此外，在SKGT-4和JHESO食管腺癌（esophageal adenocarcinoma, EAC）细胞中，通过相同的荧光素酶报告基因实验发现，CA3 (CIL-56)可呈剂量依赖性降低YAP1/Tead转录活性[1]
2. 对EAC细胞的抗增殖活性：4种EAC细胞系（SKGT-4、Flo-1、JHESO、OACP）经CA3 (CIL-56)（0.1µM、0.5µM、1µM）处理后，MTS实验结果显示，与0.1% DMSO对照组相比，细胞增殖和活力呈剂量依赖性抑制。对于经多西环素诱导YAP1过表达的SKGT-4细胞（DOX+），CA3 (CIL-56)的抗增殖效应比未诱导YAP1的细胞（DOX−）更显著[1]
3. 诱导细胞周期阻滞和凋亡：SKGT-4和JHESO细胞经CA3 (CIL-56)（0.5µM、1µM）处理24h和48h后，经碘化丙啶染色并通过流式细胞术分析。结果显示，与对照组相比，细胞周期时相分布发生改变（细胞周期阻滞），且肿瘤细胞死亡指数显著升高[1]
4. 下调YAP1和SOX9表达：免疫印迹分析表明，CA3 (CIL-56)可呈剂量依赖性降低SKGT-4和JHESO细胞中YAP1及其下游靶蛋白SOX9的表达水平。实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR, qPCR）进一步证实，CA3 (CIL-56)可降低这些细胞中YAP1的mRNA水平。免疫荧光染色也显示，经CA3 (CIL-56)处理的JHESO细胞中YAP1和SOX9的表达降低[1]
5. 抑制辐射抵抗性EAC细胞的癌症干细胞（cancer stem cell, CSC）特性：Flo-1 XTR（辐射抵抗性EAC细胞）比亲本Flo-1-P细胞具有更强的CSC特性（肿瘤球形成能力增强、ALDH1+细胞比例升高）。CA3 (CIL-56)呈剂量依赖性抑制Flo-1-P和Flo-1 XTR细胞的肿瘤球形成，且对Flo-1 XTR细胞的抑制效应更显著。此外，CA3 (CIL-56)（0.5µM处理48h）可降低Flo-1 XTR细胞中ALDH1+细胞的比例，并下调这些辐射抵抗性细胞中YAP1、磷酸化EGFR（phospho-EGFR）和磷酸化S6（phospho-S6）的蛋白水平[1]
6. 与5-氟尿嘧啶（5-FU）的协同作用：4种EAC细胞系（SKGT-4、JHESO、OACP、Yes-6）及YAP1过表达的SKGT-4（DOX+）细胞经CA3 (CIL-56)与5-FU单独或联合处理后，MTS实验显示，与单独用药或对照组相比，联合处理可显著增强细胞生长抑制作用，且在YAP1高表达的EAC细胞中协同效应更强[1]
7. 对YAP1/Tead通路的特异性：在转染YAP1/Tead、Super-TOP/Wnt、CBF1/Notch或AP-1通路报告质粒的293T细胞中，CA3 (CIL-56)（0.5µM、1µM）仅特异性抑制YAP1/Tead的荧光素酶活性，而不影响Wnt、Notch或AP-1通路的活性[1]

在异种移植模型中，CA3 表现出有效的抗肿瘤活性，且没有明显的毒性[1]。

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CA3在可诱导的高YAP异种移植小鼠体内模型中具有较强的抗肿瘤作用[1]
为了进一步证实CA3靶向YAP1在体内的抗肿瘤作用，我们利用可诱导的YAP1高SKGT-4 （Dox+）细胞异种移植模型。以每只小鼠1 × 106个细胞的剂量给裸鼠植入Dox -和Dox+ SKGT-4细胞。在这个浓度下，我们观察到在注射10-14天后，只有Dox+ SKGT-4细胞能够形成肿瘤（图5B），这表明YAP1是体内驱动肿瘤生长所必需的。为了确定CA3对yap诱导的肿瘤生长的抑制作用，我们将携带Dox+ SKGT-4 EAC异种移植物的小鼠随机分为两组，然后分别给予对照磷酸盐缓冲盐水或1mg /kg的CA3治疗。在我们3周的给药计划结束时，测量SKGT-4异种移植肿瘤的重量和体积以及小鼠的体重。体内SKGT-4 Dox+异种移植物模型的结果表明，CA3处理的Dox+ SKGT-4异种移植物小鼠体内肿瘤大小和重量大大减少（图5b&5c），而在整个实验期间，植入Dox - SKGT-4细胞的小鼠未形成肿瘤（图5B）。CA3处理组与对照组小鼠体重无显著差异（图5D）。此外，免疫组织化学在小鼠肿瘤组织中进一步证实，CA3处理sktt -4 Dox+后，YAP1、SOX9和KI67的表达显著降低（图5E）。因此，CA3在体内有效抑制EAC肿瘤生长，这些作用至少部分归因于抑制干性基因YAP1和SOX9。

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CA3与5-FU协同抑制EAC细胞体外和体内生长[1]
为了确定CA3单独或与5-FU联合处理对EAC细胞系生长的抑制作用，我们首先在96孔板中播种4个YAP1组成高表达的EC细胞系（sktt -4、JHESO、OACP和YES-6），并分别用CA3单独、5-FU单独或CA3与5-FU在指定浓度下联合处理。图6A的结果表明，尽管CA3对这四种细胞系的生长产生了剂量依赖性的降低，但CA3与5-FU的结合对其生长的抑制作用显著，尤其是CA3与5-FU的结合作用最大。为了进一步研究CA3对EAC细胞的抑制是否依赖于YAP1，我们用CA3单独、5-FU单独或联合处理Dox+ （YAP1诱导）和Dox - SKGT4 （PIN20YAP1）细胞，我们发现CA3单独与YAP1低SKGT-4细胞（Dox−）相比，优先抑制YAP1高SKGT-4细胞（Dox+）的生长，并且呈剂量依赖性（图6B）。此外，CA3和5-FU联合处理对Dox+和Dox−SKGT-4细胞的生长均产生最大的抑制作用（图6b）。这些结果表明，CA3与5-FU在GAC细胞生长抑制中的协同作用。

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1. 在YAP1诱导型异种移植模型中的抗肿瘤活性：将具有YAP1诱导表达能力的SKGT-4细胞（PIN20YAP1）皮下接种于裸鼠（每组5只，双侧接种）。小鼠分为有无多西环素（DOX）处理组（以诱导YAP1表达），并给予CA3 (CIL-56)或溶媒对照处理。结果显示，在DOX+组（YAP1过表达肿瘤）中，CA3 (CIL-56)处理显著降低肿瘤重量，且对小鼠体重无显著影响，表明其耐受性良好[1]
2. 在JHESO异种移植模型中的抗肿瘤活性：将JHESO细胞（1.5×10⁶个/位点）皮下接种于裸鼠（每组5只，双侧接种）。小鼠分别接受CA3 (CIL-56)单独处理、5-FU单独处理或两者联合处理。结果显示，联合处理组的肿瘤体积缩小程度显著大于单独用药组或溶媒对照组。肿瘤组织的免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）分析表明，CA3 (CIL-56)（单独或与5-FU联合）可降低YAP1、SOX9和Ki67（增殖标志物）的表达[1]

SOX9 荧光素酶报告基因之前已有描述。之前也描述过的 5 × -UAS-荧光素酶报告基因和 Gal4-TEAD4 构建体是从 MD 安德森癌症中心的 Johnson 博士获得的。如前所述，用 SOX9 荧光素酶报告基因和 Renilla 载体或 5 × -UAS-荧光素酶报告基因和 Gal4-TEAD4 与 CMV-β-gal 构建体瞬时共转染食管腺癌细胞。

将 SKGT-4 和 JHESO 细胞接种到 DMEM 中的 6 孔板（1 × 105/孔）中，培养 24 小时以允许细胞贴壁。然后将细胞按照推荐的不同剂量暴露于 0.1% DMSO（对照）或 CA3 中 48 小时。然后收集细胞，用甲醇固定，洗涤，用RNase A处理，用碘化丙啶进行DNA染色，并进行DNA直方图和细胞周期阶段分布的流式细胞术分析。

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细胞增殖试验[1]
用0.1%二甲亚砜（对照）、不同剂量的<强>CA3处理EAC细胞及其耐药对应细胞。对于联合处理实验，按指示用<强>CA3、5-FU或不同浓度的联合处理细胞6天，并使用前面描述的MTS法评估细胞活力。所有试验一式三份，至少重复三次。

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流式细胞术及凋亡分析[1]
采用流式细胞术对EAC细胞凋亡进行分析。简而言之，将SKGT-4和JHESO细胞在Dulbecco改良Eagle培养基中接种到六孔板上（每孔1 × 105），培养24小时以使细胞附着。然后用0.1%二甲亚砜（对照）或CA3按不同剂量处理细胞48小时。接下来，收集细胞，用甲醇固定，清洗，用RNase A处理，用碘化丙啶染色，用流式细胞仪分析细胞的DNA直方图和细胞周期分布。

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蛋白的提取和Western blot分析[1]
从经CA3处理的EAC细胞中分离出蛋白质，并按照前面描述的方法进行Western blotting分析。

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1. YAP1/Tead转录活性实验（荧光素酶报告基因实验）：将293T细胞或EAC细胞（SKGT-4、JHESO）共转染Gal4-Tead质粒、5×UAS-荧光素酶报告质粒和YAP1 cDNA质粒（以过表达YAP1）。转染后，用不同浓度（0.5µM、1µM或其他指定剂量）的CA3 (CIL-56)处理细胞48h，随后检测荧光素酶活性，以评估CA3 (CIL-56)对YAP1/Tead转录活性的抑制作用。为检测通路特异性，将细胞转染Super-TOP/Wnt、CBF1/Notch或AP-1通路的报告质粒，再经CA3 (CIL-56)处理并检测荧光素酶活性[1]
2. 细胞增殖/活力实验（MTS实验）：将EAC细胞（SKGT-4、Flo-1、JHESO、OACP、Yes-6，包括SKGT-4 DOX+和DOX−细胞、Flo-1-P和Flo-1 XTR细胞）接种于适宜的培养板中。细胞贴壁后，用CA3 (CIL-56)（0.1µM、0.5µM、1µM）单独、5-FU单独或两者联合（指定浓度）处理6天（协同实验）或其他指定时长。向各孔中加入CellTiter Aqueous One Solution（MTS试剂），检测490nm处的吸光度（OD490），并以0.1% DMSO对照组为参照，计算细胞增殖/活力百分比[1]
3. 细胞周期与凋亡分析（流式细胞术）：将SKGT-4和JHESO细胞接种于6孔板中，用CA3 (CIL-56)（0.5µM、1µM）或0.1% DMSO处理24h和48h。收集细胞、固定后用碘化丙啶染色，通过流式细胞术分析DNA直方图以确定细胞周期时相分布，并计算肿瘤细胞死亡指数[1]
4. 免疫印迹实验：用指定剂量的CA3 (CIL-56)处理EAC细胞（SKGT-4、JHESO、Flo-1-P、Flo-1 XTR），制备细胞裂解液，经凝胶电泳分离蛋白后转移至膜上，用抗YAP1、SOX9、phospho-EGFR、phospho-S6或其他相关蛋白的抗体进行孵育。采用标准免疫印迹流程进行检测，并对蛋白水平进行半定量分析[1]
5. 实时定量PCR（qPCR）：用指定剂量的CA3 (CIL-56)处理SKGT-4和JHESO细胞，提取总RNA并合成互补DNA（cDNA）。使用YAP1特异性引物进行qPCR，以合适的内参基因（如GAPDH）为参照，采用2⁻ΔΔCt法计算YAP1 mRNA的相对表达量[1]
6. 免疫荧光染色：用CA3 (CIL-56)或对照处理JHESO细胞，固定并透化后，加入抗YAP1和SOX9的一抗孵育，再用荧光标记的二抗孵育。通过共聚焦显微镜观察并定量YAP1和SOX9的表达[1]
7. 肿瘤球形成实验：将Flo-1-P和Flo-1 XTR细胞以低密度接种于超低吸附培养板中，在培养开始时加入指定浓度的CA3 (CIL-56)。培养8~10天后，在显微镜下计数直径>50µm的肿瘤球，拍摄球体制备图像，通过球体数量量化评估CSC的自我更新能力[1]
8. ALDH1+细胞比例分析：用ALDH1标记试剂盒对Flo-1、Flo-1 XTR细胞及经CA3 (CIL-56)（0.5µM处理48h）处理的Flo-1 XTR细胞进行染色，通过流式细胞术检测并定量ALDH1+细胞（CSC标志物）的百分比[1]

PBS；1 mg/kg；腹腔注射
JHESO 食管腺癌异种移植小鼠模型 体内异种移植小鼠模型[1]
体内实验均按照机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的规定进行。将 SKGT-4 (PIN20YAP1) 细胞 (1 × 10⁶) 接种到裸鼠体内（每组 n = 5），其中部分细胞经强力霉素诱导表达 YAP1（Dox− 组），部分细胞经强力霉素诱导表达 YAP1（Dox+ 组）。Dox+ 组小鼠饮用含 2.5% 蔗糖和 2.5% 强力霉素的水，而 Dox− 组小鼠饮用仅含 2.5% 蔗糖的水。 10天后，Dox+组小鼠腹腔注射CA3（1 mg/kg/只），每周三次，共3周。
在JHESO异种移植EAC模型中，将2 × 10⁶个JHESO细胞皮下注射到裸鼠体内（n = 5/组）。约10天后，小鼠接受腹腔注射CA3（1 mg/kg/只）、5-FU（30 mg/kg/只）或二者联合用药，每周三次，共3周。对照组注射磷酸盐缓冲液（100 µl/只）。小鼠的肿瘤体积、肿瘤重量和体重按先前描述的方法进行测量(4)。所有测量结果均采用非配对 Student t 检验进行比较。

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1. YAP1 诱导型 SKGT-4 异种移植实验：
- 细胞制备：培养并收集处于对数生长期的 YAP1 诱导型 SKGT-4 细胞（PIN20YAP1）。
- 异种移植建立：将 SKGT-4 (PIN20YAP1) 细胞皮下接种到裸鼠（每组 5 只）的两个部位（左侧和右侧腹部）。
- 治疗分组：将小鼠分为接受或未接受强力霉素 (DOX) 治疗（以诱导 YAP1 表达）的组，并分别用 CA3 (CIL-56) 或载体对照进行治疗。 CA3 (CIL-56) 的具体剂量和给药频率/途径未明确说明，但治疗持续了 6 周。
- 终点：6 周后，处死小鼠，切除肿瘤并称重。定期测量小鼠体重以监测毒性。收集肿瘤组织进行YAP1、SOX9和Ki67的免疫组织化学（IHC）分析[1]
2. JHESO异种移植实验：
- 细胞制备：培养JHESO EAC细胞，并制备每点1.5×10⁶个细胞用于注射。
- 异种移植瘤建立：将JHESO细胞皮下接种于裸鼠（每组5只）的两个部位（左侧和右侧腹部）。
- 治疗分组：将小鼠随机分为四组：载体对照组、CA3 (CIL-56)单药组、5-FU)单药组或CA3 (CIL-56)+5-FU联合组。 CA3 (CIL-56) 和 5-FU 的具体剂量以及给药频率/途径并未明确说明，但治疗持续至研究终点。
- 研究终点：定期使用游标卡尺测量肿瘤体积（肿瘤体积 = 长 × 宽² / 2）。监测小鼠体重以评估耐受性。研究结束时，收集肿瘤组织进行 YAP1、SOX9 和 Ki67 的免疫组化分析 [1]

唯一与毒性相关的观察结果是，在两种异种移植模型中，使用CA3 (CIL-56)（单独使用或与5-FU联合使用）治疗均未导致小鼠体重显著下降，表明在测试剂量下体内耐受性良好。文献[1]中未提供CA3 (CIL-56)的半数致死量(LD50)、肝毒性、肾毒性、药物相互作用或血浆蛋白结合率的数据。

[1]. Mol Cancer Ther . 2018 Feb;17(2):443-454.

越来越多的证据表明，Hippo共激活因子Yes相关蛋白1 (YAP1) 是癌症干细胞 (CSC) 特性、肿瘤进展和治疗耐药性的主要介质，并且通常是许多致癌通路的终末节点。因此，靶向YAP1可能成为治疗多种YAP1高表达肿瘤（包括食管腺癌）的新型治疗策略。然而，目前尚缺乏有效的YAP1抑制剂。本文鉴定了一种小分子化合物（CA3），它不仅对YAP1/Tead转录活性具有显著的抑制作用，而且在体外和体内均表现出对食管腺癌细胞生长，尤其是YAP1高表达食管腺癌细胞的强效抑制作用。值得注意的是，放射抗性细胞会获得强大的癌症干细胞（CSC）特性和侵袭性表型，而CA3可以通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、减少肿瘤球形成以及降低ALDH1+细胞比例来有效抑制这些表型。此外，CA3与5-FU联用可协同抑制食管腺癌细胞的生长，尤其是在YAP1高表达的食管腺癌细胞中。综上所述，这些发现表明CA3是一种新型的YAP1抑制剂，主要靶向具有CSC特性的YAP1高表达和耐药性食管腺癌细胞。Mol Cancer Ther; 17(2); 443-54. ©2017 AACR.

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1. 背景：Yes 相关蛋白 1 (YAP1) 是 Hippo 通路中的一种共激活因子，是多种癌症（包括食管腺癌 (EAC)）中癌症干细胞 (CSC) 特性、肿瘤进展和治疗耐药性的关键介质。YAP1 通常是多个致癌通路的末端节点，使其成为潜在的治疗靶点。然而，此前缺乏有效的 YAP1 抑制剂 [1]
2. 作用机制：CA3 (CIL-56) 主要通过特异性抑制 YAP1/Tead 转录复合物发挥其抗肿瘤作用。这种抑制作用导致下游效应，包括 YAP1 及其靶基因 SOX9 的下调、CSC 特性的抑制（肿瘤球形成减少、ALDH1+ 细胞减少）、诱导细胞周期阻滞和凋亡以及抑制细胞增殖。在放射抗性EAC细胞中，CA3 (CIL-56) 还能下调磷酸化EGFR和磷酸化S6，而磷酸化EGFR和磷酸化S6与治疗耐药性相关[1]
3. 治疗潜力：CA3 (CIL-56) 对YAP1高表达的EAC细胞和放射抗性EAC细胞（具有增强的CSC特性）表现出特别的疗效。它与5-FU（一种常用的EAC化疗药物）的协同作用表明，CA3 (CIL-56) 可能是一种有前景的YAP1驱动的、治疗耐药性EAC的候选药物[1]
4. 化学结构：CA3 (CIL-56) 的化学结构见文献[1]中的图1E

C23H27N3O5S2

489.61

489.139

C, 56.42; H, 5.56; N, 8.58; O, 16.34; S, 13.10

300802-28-2

654092

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

741.7±70.0 °C at 760 mmHg

402.4±35.7 °C

0.0±2.6 mmHg at 25°C

1.714

3.66

124

1

8

4

33

870

0

S(C1C=CC2=C(/C(/C3C=C(C=CC2=3)S(N2CCCCC2)(=O)=O)=N/O)C=1)(N1CCCCC1)(=O)=O

XYZXEEIUKQGUHB-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H27N3O5S2/c27-24-23-21-15-17(32(28,29)25-11-3-1-4-12-25)7-9-19(21)20-10-8-18(16-22(20)23)33(30,31)26-13-5-2-6-14-26/h7-10,15-16,27H,1-6,11-14H2

N-[2,7-bis(piperidin-1-ylsulfonyl)fluoren-9-ylidene]hydroxylamine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.11 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液； 超声和加热处理
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.25 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.25 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 5% DMSO+40% PEG 300+5% Tween 80+50% ddH2O: 0.5mg/ml

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。