CA3 (CIL-56)

YAP/TEAD interaction

在体外，CA3显着减少食管腺癌细胞的生长。诱导细胞凋亡、减少肿瘤球形成和减少 ALDH1+ 细胞的数量都是 CA3 可能的作用。在 293T 细胞中共转染每个转录因子的单独启动子荧光素酶后，CA3 特异性抑制 Tead/YAP1 转录活性，但对 Super-TOP/Wnt、CBF1/Notch 或 AP-1 没有影响。抗辐射食管腺癌细胞中富含的 CSC 特性优先被 CA3 抑制[1]。

在异种移植模型中，CA3 表现出有效的抗肿瘤活性，且没有明显的毒性[1]。

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CA3在可诱导的高YAP异种移植小鼠体内模型中具有较强的抗肿瘤作用[1]
为了进一步证实CA3靶向YAP1在体内的抗肿瘤作用，我们利用可诱导的YAP1高SKGT-4 （Dox+）细胞异种移植模型。以每只小鼠1 × 106个细胞的剂量给裸鼠植入Dox -和Dox+ SKGT-4细胞。在这个浓度下，我们观察到在注射10-14天后，只有Dox+ SKGT-4细胞能够形成肿瘤（图5B），这表明YAP1是体内驱动肿瘤生长所必需的。为了确定CA3对yap诱导的肿瘤生长的抑制作用，我们将携带Dox+ SKGT-4 EAC异种移植物的小鼠随机分为两组，然后分别给予对照磷酸盐缓冲盐水或1mg /kg的CA3治疗。在我们3周的给药计划结束时，测量SKGT-4异种移植肿瘤的重量和体积以及小鼠的体重。体内SKGT-4 Dox+异种移植物模型的结果表明，CA3处理的Dox+ SKGT-4异种移植物小鼠体内肿瘤大小和重量大大减少（图5b&5c），而在整个实验期间，植入Dox - SKGT-4细胞的小鼠未形成肿瘤（图5B）。CA3处理组与对照组小鼠体重无显著差异（图5D）。此外，免疫组织化学在小鼠肿瘤组织中进一步证实，CA3处理sktt -4 Dox+后，YAP1、SOX9和KI67的表达显著降低（图5E）。因此，CA3在体内有效抑制EAC肿瘤生长，这些作用至少部分归因于抑制干性基因YAP1和SOX9。

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CA3与5-FU协同抑制EAC细胞体外和体内生长[1]
为了确定CA3单独或与5-FU联合处理对EAC细胞系生长的抑制作用，我们首先在96孔板中播种4个YAP1组成高表达的EC细胞系（sktt -4、JHESO、OACP和YES-6），并分别用CA3单独、5-FU单独或CA3与5-FU在指定浓度下联合处理。图6A的结果表明，尽管CA3对这四种细胞系的生长产生了剂量依赖性的降低，但CA3与5-FU的结合对其生长的抑制作用显著，尤其是CA3与5-FU的结合作用最大。为了进一步研究CA3对EAC细胞的抑制是否依赖于YAP1，我们用CA3单独、5-FU单独或联合处理Dox+ （YAP1诱导）和Dox - SKGT4 （PIN20YAP1）细胞，我们发现CA3单独与YAP1低SKGT-4细胞（Dox−）相比，优先抑制YAP1高SKGT-4细胞（Dox+）的生长，并且呈剂量依赖性（图6B）。此外，CA3和5-FU联合处理对Dox+和Dox−SKGT-4细胞的生长均产生最大的抑制作用（图6b）。这些结果表明，CA3与5-FU在GAC细胞生长抑制中的协同作用。

SOX9 荧光素酶报告基因之前已有描述。之前也描述过的 5 × -UAS-荧光素酶报告基因和 Gal4-TEAD4 构建体是从 MD 安德森癌症中心的 Johnson 博士获得的。如前所述，用 SOX9 荧光素酶报告基因和 Renilla 载体或 5 × -UAS-荧光素酶报告基因和 Gal4-TEAD4 与 CMV-β-gal 构建体瞬时共转染食管腺癌细胞。

将 SKGT-4 和 JHESO 细胞接种到 DMEM 中的 6 孔板（1 × 105/孔）中，培养 24 小时以允许细胞贴壁。然后将细胞按照推荐的不同剂量暴露于 0.1% DMSO（对照）或 CA3 中 48 小时。然后收集细胞，用甲醇固定，洗涤，用RNase A处理，用碘化丙啶进行DNA染色，并进行DNA直方图和细胞周期阶段分布的流式细胞术分析。

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细胞增殖试验[1]
用0.1%二甲亚砜（对照）、不同剂量的<强>CA3处理EAC细胞及其耐药对应细胞。对于联合处理实验，按指示用<强>CA3、5-FU或不同浓度的联合处理细胞6天，并使用前面描述的MTS法评估细胞活力。所有试验一式三份，至少重复三次。

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流式细胞术及凋亡分析[1]
采用流式细胞术对EAC细胞凋亡进行分析。简而言之，将SKGT-4和JHESO细胞在Dulbecco改良Eagle培养基中接种到六孔板上（每孔1 × 105），培养24小时以使细胞附着。然后用0.1%二甲亚砜（对照）或CA3按不同剂量处理细胞48小时。接下来，收集细胞，用甲醇固定，清洗，用RNase A处理，用碘化丙啶染色，用流式细胞仪分析细胞的DNA直方图和细胞周期分布。

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蛋白的提取和Western blot分析[1]
从经CA3处理的EAC细胞中分离出蛋白质，并按照前面描述的方法进行Western blotting分析。

In vivo xenograft mouse model[1]
In vivo experiments have been conducted in accordance with an Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). SKGT-4 (PIN20YAP1) cells (1 × 106) without (Dox−) or with (Dox+) YAP1 induction by Doxycycline were inoculated into nude mice (n = 5/group). The mice in the Dox+ group were fed drinking water containing 2.5% sucrose and 2.5% Doxycycline, whereas those in the Dox− group were fed water containing only 2.5% sucrose. After 10 days, CA3 was introperitoneally injected into the animals in the Dox+ group at 1 mg/kg/mouse three times a week for total 3 weeks.

In a JHESO xenograft model of EAC, 2 × 106 JHESO cells were subcutaneously injected into nude mice (n = 5/group). After about 10 days, the mice underwent intraperitoneal injection of CA3 at 1 mg/kg/mouse, 5-FU at 30 mg/kg/mouse, or a combination of them three times a week for total 3 weeks. A control group was given phosphate-buffered saline at 100 µl/mouse. The mice’s tumor volumes, tumor weights, and body weights were measured as described previously (4). All measurements were compared using an unpaired Student t-test.

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PBS; 1 mg/kg; i.p.

JHESO xenograft mice model of esophageal adenocarcinoma

[1]. Mol Cancer Ther . 2018 Feb;17(2):443-454.

Mounting evidence suggests that the Hippo coactivator Yes-associated protein 1 (YAP1) is a major mediator of cancer stem cell (CSC) properties, tumor progression, and therapy resistance as well as often a terminal node of many oncogenic pathways. Thus, targeting YAP1 may be a novel therapeutic strategy for many types of tumors with high YAP1 expression, including esophageal adenocarcinoma. However, effective YAP1 inhibitors are currently lacking. Here, we identify a small molecule (CA3) that not only has remarkable inhibitory activity on YAP1/Tead transcriptional activity but also demonstrates strong inhibitory effects on esophageal adenocarcinoma cell growth especially on YAP1 high-expressing esophageal adenocarcinoma cells both in vitro and in vivo Remarkably, radiation-resistant cells acquire strong cancer stem cell (CSC) properties and aggressive phenotype, while CA3 can effectively suppress these phenotypes by inhibiting proliferation, inducing apoptosis, reducing tumor sphere formation, and reducing the fraction of ALDH1+ cells. Furthermore, CA3, combined with 5-FU, synergistically inhibits esophageal adenocarcinoma cell growth especially in YAP1 high esophageal adenocarcinoma cells. Taken together, these findings demonstrated that CA3 represents a new inhibitor of YAP1 and primarily targets YAP1 high and therapy-resistant esophageal adenocarcinoma cells endowed with CSC properties. Mol Cancer Ther; 17(2); 443-54. ©2017 AACR.

C23H27N3O5S2

489.61

489.139

C, 56.42; H, 5.56; N, 8.58; O, 16.34; S, 13.10

300802-28-2

654092

White to off-white solid powder

1.5±0.1 g/cm3

741.7±70.0 °C at 760 mmHg

402.4±35.7 °C

0.0±2.6 mmHg at 25°C

1.714

3.66

124

1

8

4

33

870

0

S(C1C=CC2=C(/C(/C3C=C(C=CC2=3)S(N2CCCCC2)(=O)=O)=N/O)C=1)(N1CCCCC1)(=O)=O

XYZXEEIUKQGUHB-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H27N3O5S2/c27-24-23-21-15-17(32(28,29)25-11-3-1-4-12-25)7-9-19(21)20-10-8-18(16-22(20)23)33(30,31)26-13-5-2-6-14-26/h7-10,15-16,27H,1-6,11-14H2

N-[2,7-bis(piperidin-1-ylsulfonyl)fluoren-9-ylidene]hydroxylamine

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (5.11 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液； 超声和加热处理
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.25 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (4.25 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 5% DMSO+40% PEG 300+5% Tween 80+50% ddH2O: 0.5mg/ml

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。