Divalent cation ionophore; antibiotic

表型筛选发现Calcimycin在体外和THP-1细胞中能有效抑制牛分枝杆菌BCG（M. bovis BCG）生长。本研究旨在解析其抗分枝杆菌作用机制。我们发现calcimycin处理可上调巨噬细胞中Beclin-1、自噬相关基因（Atg）7、Atg 3等自噬标志物，并促进微管相关蛋白1A/1B-轻链3-I（LC3-I）向LC3-II的转化。这种calcimycin介导的胞内耻垢分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG杀灭作用可被3-甲基腺嘌呤（3-MA）阻断。实验证实calcimycin与嘌呤能受体P2X7（P2RX7）结合后，通过调节ATP的胞外释放升高胞内钙离子水平。ATP能以自分泌方式通过P2RX7调控calcimycin诱导的自噬。使用1-[N,O-双(5-异喹啉磺酰基)-N-甲基-L-酪氨酰]-4-苯基哌嗪（KN-62）阻断P2RX7表达，或通过1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸四(乙酰氧基甲酯)（BAPTA-AM）降低胞内钙水平，均能消除calcimycin的抗分枝杆菌活性。结果表明，calcimycin通过调控P2RX7依赖的钙依赖性ATP释放诱导自噬，从而发挥抗分枝杆菌作用。分支杆菌E的杀灭由calcimycin（A-23187）介导，通过激活P2RX7触发钙调节的自噬[4]。

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Calcimycin在0.4 μM以上对THP-1细胞具有细胞毒性[4]
通过药理活性化合物小分子库（LOPAC1280）的体外筛选实验，我们鉴定出calcimycin具有抗分枝杆菌活性。其对牛分枝杆菌BCG体外培养的MIC99值为1.25 μM。为探究其抗胞内菌机制，我们检测了calcimycin对THP-1细胞的毒性。不同浓度（0.001–1 μM）和时间点（24–72 h）的细胞活力实验显示，细胞存活率呈剂量和时间依赖性下降（图1A）。72小时处理后，0.6、0.8和1 μM calcimycin组的细胞活力分别降至83.6 ± 3.5%、76.4 ± 3.6%和60 ± 2.2%（图1A）。台盼蓝拒染实验进一步验证了MTT结果：处理72小时后，>0.4 μM的calcimycin均显示细胞毒性（图1B），故后续实验选用0.4 μM浓度。

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Calcimycin上调THP-1细胞自噬[4]
鉴于calcimycin可升高胞内钙水平，而钙水平通过调节自噬影响分枝杆菌存活，我们检测了其对THP-1细胞自噬的诱导作用。时序实验（图S1A、B、1C、D）显示，calcimycin处理12小时后，Beclin-1、Atg 7和Atg 3表达达峰值（图1C、D、2A），LC3-I向LC3-II转化增加，且LC3斑点形成增多（图2B）。这些效应可被自噬抑制剂3-MA阻断（图2C、D）。使用液泡ATP酶抑制剂Bafilomycin A1（Baf-A1）处理后，calcimycin组LC3斑点进一步增加（图2E、F），表明其影响自噬流。结果证实calcimycin能诱导巨噬细胞自噬。

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Calcimycin通过感染细胞自噬影响分枝杆菌存活[4]
在耻垢分枝杆菌感染的THP-1细胞中，calcimycin处理12小时使Beclin-1、Atg 7和Atg 3表达分别上调1.7、2.3和2.1倍（图3A、B），并导致胞内菌载量下降4倍（图3C）。3-MA预处理可消除这些效应。对慢生长的牛分枝杆菌BCG，calcimycin同样上调自噬标志物（Beclin-1 1.3倍、Atg 7 4.4倍、Atg 3 1.7倍）（图4A、B），增强LC3转化（图4C）和斑点形成（图4D、E），使感染后6天的胞内菌载量降低4.4倍（图4F）。这些作用均依赖自噬途径。

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Calcimycin通过ATP-P2RX7通路升高胞内钙水平[4]
qRT-PCR显示calcimycin使THP-1细胞P2RX7 mRNA表达升高14倍（p = 0.04），在分枝杆菌感染细胞中升高8-12倍（图5A）。其处理组胞外ATP水平增加2-2.5倍（图5B），胞内钙水平升高2倍（图5C），钙信号阳性细胞增加3倍（p = 0.003）（图5D、E）。分子对接表明calcimycin可与人类P2RX7的LYS311和LYS64形成氢键（结合自由能-5.05 kcal/mol）（图6A、B）。P2RX7抑制剂KN-62预处理使calcimycin组的胞内钙水平降低1.6倍（图6C），而钙螯合剂BAPTA-AM使ATP释放减少1.9倍（图6D），证实calcimycin-P2RX7结合通过钙-ATP通路调控自噬。

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抑制P2RX7或胞内钙水平影响Calcimycin的自噬诱导与抗菌活性[4]
BAPTA-AM或KN-62预处理均显著降低calcimycin诱导的自噬标志物表达和LC3斑点形成（图7A-D）。延时实验（calcimycin处理2小时后加KN-62）未检测到自噬增强（图S3A、B），排除了ATP非依赖性途径。这两种抑制剂可使calcimycin对耻垢分枝杆菌的抗菌效果分别逆转4.7和6倍（图7E）。综上，calcimycin通过P2RX7-钙-ATP通路诱导自噬抑制胞内分枝杆菌生长（图8）。

胸膜内注射 2.5 或 7.5 nM Calcimycin(A-23187) 可诱导蛋白质渗漏 [5]。

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本研究证实了a23187诱导小鼠胸膜炎的存在。A23187使小鼠胸膜内蛋白渗漏、白细胞积累、LTB4和PGE2的产生呈剂量依赖性增加。在7.5 nmol A23187胸腔内注射时，蛋白水平在0.5-2 h达到峰值，PMN白细胞积累在3-4 h达到峰值，LTB4和PGE2的产生在0.5-1 h达到峰值。在这个体内模型中，我们研究了从雷虎藤中分离的去甲氧基三醇的抗炎作用。去甲酰基三醇(ID50约为30.6 mg/kg / p)、吲哚美辛和BW755C可减少a23187诱导的蛋白渗漏。去甲硫醇(ID50约为16.8 mg/kg, i.p)和BW755C可抑制a23187诱导的PMN白细胞积累，而吲哚美辛可增强其积累。与BW755C一样，去甲芥子醇降低了LTB4和PGE2的产生(ID50分别为18.6和29.1 mg/kg / p)，而吲哚美辛降低了PGE2的产生，但没有降低LTB4的产生。我们还证明了去甲三醇对醋酸诱导的扭体反应的镇痛作用。去甲硫醇(ID50约为27.9 mg/kg / p)、吲哚美辛和布洛芬均能抑制醋酸致扭体反应。这些结果表明，与BW755C一样，norathyriol可能是一种双重但弱的环加氧酶和脂加氧酶途径阻断剂。norathyriol对a23177诱导的小鼠胸膜炎和醋酸诱导的扭体反应的抑制作用被认为依赖于炎症部位二十烷类化合物形成的减少。[5]

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Calcimycin/A 23 187诱导的蛋白质泄漏[5]
当将A23 187注射到胸膜腔中时，7.5 nmole A23 187治疗组的泄漏蛋白水平高于2.5 nmole A21 187治疗组动物（曲线下面积值为8.8+0.4 vs.6.1+0.4，P<0.01，峰值为2.67+0.18 mg/小鼠vs.2.21+0.18 mg/m小鼠）（图1）。然而，在这方面，A23 187的两种浓度下的反应曲线相似。A23 187注射后0.25-0.5小时，蛋白质水平显著升高。胸膜内注射2.5 nmole A23 187的蛋白质水平在0.5-1小时达到峰值，7.5 nmole A21 87的蛋白质水平为0.5-2小时，然后逐渐下降。在2.5 nmole A23 187后两小时，或7.5 nmole A21 87后3小时，胸膜腔内的蛋白质水平相当于其相应峰值的一半左右。静息蛋白水平为1.16+0.06mg/只小鼠。在7.5 nmole A23 187攻击前30分钟，小鼠腹腔注射吲哚美辛3和10mg/kg（图2a，b），BW755C，一种环氧合酶和脂肪氧合酶双重抑制剂（Higgs等人，1979），腹腔注射3和30mg/kg（图2c，d），以及去甲三醇30 mg/kg（图2g），胸膜腔内蛋白质水平显著降低。去甲硫醚减少了A23187诱导的胸膜炎中的蛋白质渗漏，IDs0值约为30.6mg/kg。

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中性粒细胞浸润[5]
图3显示了胸膜腔内注射2.5或7.5 nmoleCalcimycin/A23 187无菌盐水后，PMN白细胞浸润胸膜腔的时间过程。注射A23-187两小时后，PMN白细胞百分比显著增加（P<0.05）。这些值在3小时达到峰值（2.5nmole A23187的51.3±6.8%和7.5nmole A2318的80.5±3.5%），然后下降。在正常小鼠胸膜内注射无菌生理盐水三小时后，胸膜洗液由25%的PMN白细胞组成。静息状态下总细胞数和PMN白细胞数分别为1.58+0.18和0.39+0.02×10^6个细胞/只。腹腔注射吲哚美辛3mg/kg预处理的小鼠显著增加了7.5 nmole A23-187诱导的胸膜炎中PMN白细胞浸润的数量（p<0.05）（表1）。此外，经吲哚美辛（10mg/kg i.P.）治疗的小鼠胸膜腔内的总细胞和PMN白细胞计数均增加（P<0.01）。然而，BW755C 3和30mg/kg腹腔注射消除了白细胞的积聚。腹腔注射10mg/kg剂量的去甲硫醚对白细胞浸润几乎没有影响，而腹腔注射20mg/kg和30mg/kg剂量则显著减少了总细胞和PMN白细胞的数量。在A23-187诱导的胸膜炎中，诺替洛尔减少了PMN白细胞的浸润，ID50值约为16.8mg/kg。

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胸膜腔内PGE 2和LTB 4水平[5]
胸膜内注射2.5或7.5 nmoleCalcimycin/A23 187与注射无菌盐水的对照组小鼠相比，LTB 4和PGE 2水平显著升高（P<0.01）（表2）。PGE 2和LTB 4水平在0.5小时时显著升高。LTB 4的峰值水平持续至少1小时。用7.5 nmole A23 187攻击后3小时，LTB 4含量仍显著升高（P<0.05）。使用较低浓度的A23-187（2.5 nmole）时，LTB4和PGE2的水平迅速下降。吲哚美辛3和10mg/kg腹腔注射降低了PGE z水平（p<0.01），但LTB4水平不受影响（表3）。BW755C显著降低了PGE 2和LTB 4水平（P<0.01）。腹腔注射10mg/kg的去甲肾上腺素对LTB4和PGE2水平没有影响，而腹腔注射20mg/kg和30mg/kg的剂量与对照值相比，LTB 4和PGE2的水平显著降低。Norathyriol降低了A23-187胸膜炎中LTB4和PGE2的形成，IDs0值分别约为18.6和29.1mg/kg。为了评估吲哚美辛增加胸膜腔内PMN白细胞浸润数量的可能作用机制，还测定了7.5 nmole A23 187激发后3小时收集的胸膜渗出液中的LTB 4水平。A23 187攻击后3小时，正常小鼠胸膜液中的LTB 4水平大大降低（表1）。用吲哚美辛3mg/kg腹腔注射预处理的小鼠。

吡咯聚醚抗生素钙霉素(A23187)是一种罕见的离子载体，对二价阳离子具有特异性。由于其多种独特的生物效应，它被广泛用作生化和药理工具。本文报道了黄曲链霉菌(Streptomyces chartreusis) NRRL 3882生物合成基因簇的克隆、测序和突变分析。基因置换证实了基因簇的身份，DNA序列的硅分析显示27个潜在基因，包括3个α-酮吡啶片段生物合成基因、5个螺旋酮环生物合成模块化I型聚酮合成酶基因、4个3-羟基苯甲酸生物合成基因、1个n -甲基转移酶裁剪基因、1个抗性基因、1个II型硫酯酶基因、3个调节基因、4个其他功能基因。5个功能未知的基因。我们提出了钙霉素的生物合成途径，并将基因分配到生物合成步骤。我们的发现为利用基因改造而不是化学合成来生产非常理想的钙霉素衍生物奠定了基础。[1]

表型筛选结果表明，Calcimycin (A-23187)在体外和THP-1细胞中作为牛卡介苗分枝杆菌(M. bovis BCG)生长的有效抑制剂。在本研究中，我们的目的是破译Calcimycin (A-23187)抗细菌活性的机制。我们注意到，Calcimycin (A-23187)治疗导致巨噬细胞中不同自噬标志物如Beclin-1、自噬相关基因(Atg) 7、Atg 3的上调，以及微管相关蛋白1A/ 1b轻链3- i (LC3-I)向LC3-II转化的增强。这种Calcimycin (A-23187)介导的细胞内耻垢分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG的杀伤作用在3-甲基腺嘌呤(3-MA)的存在下被废除。我们还证明了Calcimycin (A-23187)与嘌呤能受体P2X7 (P2RX7)结合导致细胞内钙水平升高，从而调节ATP的细胞外释放。ATP能够通过P2RX7以自分泌方式调节钙化霉素诱导的自噬。用1-[N, o -二(5-异喹啉磺酰基)-N-甲基-l-酪氨酸]-4-苯哌嗪(N-62)阻断P2RX7表达或用1,2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N'，N'-四乙酸四(乙酰氧基甲基)酯(BAPTA-AM)降低细胞内钙水平均可消除Calcimycin (A-23187)的抑菌活性。综上所述，这些结果表明，Calcimycin (A-23187)通过调节细胞内钙依赖性ATP释放，以P2RX7依赖的方式诱导自噬来发挥其抗真菌作用。[4]

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3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）法[4]
每孔接种2.5×104个细胞，PMA分化过夜进行细胞活力实验。PMA洗涤后的第二天，用不同浓度的Calcimycin（0.001-1μM）处理细胞24、48和72小时。处理结束时，向每个孔中加入10μl MTT（5mg/ml），并在37°C下孵育。孵育2-3小时后，向每个孔中加入100μl裂解溶液，使用酶标仪 在562 nm处测量OD。活细胞的百分比根据以下公式计算：

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台盼蓝染料排斥试验[4]
将PMA分化的THP-1细胞以1×106个细胞/孔的密度接种在24孔板中，并在不同时间点用不同浓度的Calcimycin（0.2-1μM）处理。在处理后的指定时间点，收获细胞，用0.4%台盼蓝染料1:1稀释，并将10μl装载到血细胞计数器室中。计数有和没有染料的细胞总数，并根据以下公式计算细胞存活率：

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蛋白质印迹分析[4]
通过在12孔板中接种1×106个细胞/孔，然后在不同时间点用Calcimycin（0.4μM）处理，进行蛋白质印迹分析。在一些实验中，在添加卡霉素之前，细胞被耻垢分枝杆菌或牛分枝杆菌BCG感染。简而言之，在卡霉素处理后，细胞在含有50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1%Triton X-100、0.5%脱氧胆酸钠和0.1%SDS的RIPA（放射免疫沉淀测定）缓冲液中用1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒裂解，并使用BCA蛋白试剂盒测定这些裂解液中的蛋白质量。对于蛋白质印迹分析，将40μg蛋白质在15%SDS-PAGE上分离，并进行免疫印迹分析。简而言之，电泳后，将蛋白质转移到硝化纤维膜上，并在室温下用含有5%脱脂乳的PBST（含有0.5%吐温-20的PBS）封闭1小时。随后，将膜与PBST中1:1000稀释的一抗一起孵育，然后用HRP偶联的二抗孵育，最后使用ECL试剂盒观察蛋白质。使用ImageJ软件对印迹的相应条带强度进行定量。

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共聚焦显微镜[4]
分化的THP-1细胞在35毫米培养皿中以105个细胞/ml的密度在玻璃盖玻片上生长过夜。第二天，洗涤细胞，用Calcimycin处理12小时，然后用1%对甲醛固定。在一些实验中，在添加Calcimycin之前，用牛结核分枝杆菌BCG感染细胞。将固定细胞透化，用2 mg/ml BSA封闭，在4°C下与LC3一抗孵育过夜，并按照制造商的建议用相应的Alexa 568偶联二抗染色。这些染色细胞用含有DAPI的ProLong-Gold防褪色试剂进行安装。图2B的图像是在奥林巴斯FV1000共聚焦显微镜上获得的，图2E和7C是在共聚焦扫描激光显微镜（CSLM）上获得的。扫描的图像被导出并使用Adobe Photoshop版本7软件进行处理。

动物/疾病模型：小鼠（ICR，25-30 g）[5]
剂量：2.5 或 7.5 nM
给药途径：胸膜内注射
实验结果：2.5 nM 组在攻击后 2 小时（小时）或 7.5 nM 组在攻击后 3 小时（小时）时，胸膜腔内蛋白质水平约为其相应峰值的一半。

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钙霉素/A 23187 诱导的胸膜炎。[5]
小鼠（ICR，25-30 g）用戊巴比妥钠（60 mg/kg）麻醉。将25毫升无菌生理盐水、2.5或7.5纳摩尔钙霉素/A23187（A23187配制成10毫摩尔的DMSO储备液，并用无菌生理盐水稀释）通过27号针头进行胸膜内注射。在设定的时间间隔内，通过放血处死小鼠。打开胸膜腔，然后用0.5毫升0.2%（w/v）EDTA磷酸盐缓冲液冲洗一次。收集胸膜腔内的液体，并立即置于冰浴中保存。91 蛋白质测定。将收集的液体在4℃下以600×g离心5分钟。取上清液测定蛋白质含量（Bradford 1976）。简而言之，将标准品或样品与考马斯亮蓝G 250混合。用分光光度计在595 nm处检测颜色变化。根据标准曲线估算蛋白质含量。此外，还分析了数据，以基于梯形法则比较时间-蛋白质水平曲线下的面积。

[1]. Characterization of the biosynthesis gene cluster for the pyrrole polyether antibiotic calcimycin(A23187) in Streptomyces chartreusis NRRL 3882. Antimicrob Agents Chemother. 2011 Mar;55(3):974-82.

[2]. IKCa1 activity is required for cell shrinkage, phosphatidylserine translocation and death in Tlymphocyte apoptosis. EMBO Rep. 2003 Feb;4(2):189-94.

[3]. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 2013 Oct;9(10):1475-90.

[4]. Calcimycin mediates mycobacterial killing by inducing intracellular calcium-regulated autophagy in a P2RX7 dependent manner. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2017 Dec;1861(12):3190-3200.

[5]. Effect of norathyriol, isolated from Tripterospermum lanceolatum, on A23187-induced pleurisy and analgesia in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1994 Jul;350(1):90-5.

5-(甲氨基)-2-[[(2S,3R,5R,6S,8R,9R)-3,5,9-三甲基-2-[(2S)-1-氧代-1-(1H-吡咯-2-基)丙-2-基]-1,7-二氧杂螺[5.5]十一烷-8-基]甲基]-1,3-苯并恶唑-4-羧酸是一种苯并恶唑类化合物。
据报道，链霉菌属和沙特氏链霉菌中含有钙霉素，并有相关数据。
钙霉素是一种来自沙特氏链霉菌的离子载体聚醚类抗生素。它能结合并转运钙离子和其他二价阳离子穿过细胞膜，并能解偶联氧化磷酸化，同时抑制大鼠肝线粒体的ATPase活性。该物质主要用作生化工具，用于研究二价阳离子在各种生物系统中的作用。

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综上所述，本研究揭示了钙霉素诱导THP-1细胞自噬并杀灭胞内分枝杆菌的机制。我们发现，用钙霉素处理THP-1巨噬细胞会导致钙离子浓度升高，进而增强ATP释放，ATP通过P2RX7调节自噬。因此，了解钙离子载体介导的自噬机制可能为控制分枝杆菌感染提供一个有吸引力的靶点，这将有助于开发更好的抗结核治疗方法。[4]

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本研究证实了钙霉素/A23187可诱导小鼠胸膜炎。A23187以剂量依赖的方式增加小鼠胸膜腔内的蛋白质渗漏、白细胞聚集以及LTB4和PGE2的产生。胸膜内注射7.5 nmol A23187后，蛋白质水平在0.5-2小时达到峰值，PMN白细胞聚集在3-4小时达到峰值，LTB4和PGE2的产生在0.5-1小时达到峰值。在本体内模型中，我们研究了从雷公藤（Tripterospermum lanceolatum）中分离得到的诺拉西醇的抗炎作用。诺拉西醇（ID50约为30.6 mg/kg，腹腔注射）、吲哚美辛和BW755C均能降低A23187诱导的蛋白质渗漏。诺拉西醇（ID50约为16.8 mg/kg，腹腔注射）和BW755C可抑制A23187诱导的PMN白细胞聚集，而吲哚美辛则可增强PMN白细胞聚集。与BW755C类似，诺拉替醇可降低LTB4和PGE2的生成（ID50分别为18.6和29.1 mg/kg，腹腔注射），而吲哚美辛可降低PGE2的生成，但对LTB4的生成无影响。我们还证实了诺拉替醇对醋酸诱导的扭体反应具有镇痛作用。诺拉替醇（ID50约为27.9 mg/kg，腹腔注射）、吲哚美辛和布洛芬均可抑制醋酸诱导的扭体反应。这些结果表明，诺拉替醇可能与BW755C一样，是一种双重但作用较弱的环氧合酶和脂氧合酶通路阻断剂。诺拉西醇对小鼠A23187诱导的胸膜炎和醋酸诱导的扭体反应的抑制作用被认为依赖于炎症部位二十碳酸类介质生成的减少。[5]

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近期，我们发现诺拉西醇降低了化合物48/80激活的大鼠腹膜肥大细胞的细胞内钙离子浓度，并抑制了马铃薯纯化的5-1-脂氧合酶活性（数据未显示）。诺拉西醇是否也作为多形核白细胞中的钙阻滞剂和/或5-1-脂氧合酶的氧化还原抑制剂，从而抑制白三烯的生成，还需要进一步研究。总之，我们已证明，钙霉素/A23187诱导的小鼠胸膜炎是研究药物对前列腺素和白三烯生成影响的有效体内模型。结果表明，诺拉替醇与 BW755C 一样，能够抑制环氧合酶和脂氧合酶途径，这种作用可能是其抗炎和镇痛作用的原因。[5]

C29H37N3O6

523.63

523.268

C, 66.52; H, 7.12; N, 8.02; O, 18.33

52665-69-7

Calcimycin hemicalcium salt;59450-89-4;Calcimycin hemimagnesium;72124-77-7; 76455-48-6 (bromo); 52665-69-7

11957499

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

710.3±55.0 °C at 760 mmHg

187-190 °C

383.4±31.5 °C

0.0±2.4 mmHg at 25°C

1.611

5.66

126.68

3

8

7

38

873

7

CNC1C(C(O)=O)=C2N=C(CC3C(C)CCC4(C(C)CC(C)C(C(C)C(=O)C5=CC=CN5)O4)O3)OC2=CC=1

HIYAVKIYRIFSCZ-BNJSRTAHSA-N

InChI=1S/C29H37N3O6/c1-15-10-11-29(17(3)13-16(2)27(38-29)18(4)26(33)20-7-6-12-31-20)37-22(15)14-23-32-25-21(36-23)9-8-19(30-5)24(25)28(34)35/h6-9,12,15-18,22,27,30-31H,10-11,13-14H2,1-5H3,(H,34,35)/t15-,16+,17+,18+,22-,27-,29+/m1/s1

4-Benzoxazolecarboxylic acid, 5-(methylamino)-2-((3,9,11-trimethyl-8-(1-methyl-2-oxo-2-(1H-pyrrol-2-yl)ethyl)-1,7-dioxaspiro(5.5)undec-2-yl)methyl)-, (6S-(6alpha(2S*,3S*),8beta(R*),9beta,11alpha))-

Calcimycin; A23187; A 23187; 52665-69-7; antibiotic A-23187; A23187; Calcium ionophore III; Calcimycin A23187; rel-Calcimycin; A-23187; A-23187; Ionophore A23187; Antibiotic 23187

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中，避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~33.33 mg/mL (~63.65 mM)

配方 1 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.77 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (4.77 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 3 中的溶解度: 10% DMSO+40% PEG300+5% Tween-80+45% Saline: ≥ 2.5 mg/mL (4.77 mM)

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。