CAY-10404

COX-2 (IC50 = 1 nM); COX-1 (IC50 >500 μM)

CAY10404（化合物 7）不会抑制 COX-1 (IC50>500 µM)[1]。 CAY10404（10-100 µM；持续 3 天）的平均 50% 抑制浓度 (IC50) 为 60-100 µM，以浓度依赖性方式抑制 NSCLC 细胞系的发育 [3]。三天内，CAY10404 (20–100 µM) 会导致 NSCLC 细胞发生凋亡 [3]。 CAY10404 (80 µM) 在三天内诱导 pAkt、pGSK-3β 和抗凋亡蛋白（Bcl-2 和 Bcl-XL）水平呈浓度依赖性降低 [3]。 CAY10404（20、50、80 和 100 µM；持续 14 天）以浓度依赖性方式抑制 H460 细胞在不依赖贴壁的生长中形成集落的能力 [3]。

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在10-100微M范围内用CAY10404治疗可引起剂量依赖性生长抑制，平均50%抑制浓度（IC（50））为60-100微mol/L，具体取决于细胞系。CAY10404处理的细胞的蛋白质印迹分析显示聚ADP核糖聚合酶（PARP）和前天冬氨酸蛋白酶-3的切割，表明胱天蛋白酶活性和凋亡细胞死亡。CAY10404处理抑制了H460和H358细胞中Akt、糖原合酶激酶-3β和细胞外信号调节激酶1/2的磷酸化。 结论：这些结果表明，CAY10404是NSCLC细胞凋亡的强效诱导剂，可能通过抑制多种蛋白激酶B/Akt和丝裂原活化蛋白激酶途径发挥作用[3]。

在 HTV 小鼠中，腹腔注射 50 mg/kg/天的 CAY10404 可改善肺部炎症和呼吸机引起的肺损伤 [2]。

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抑制COX-2可减轻呼吸机诱导的肺损伤[2]
在机械通气开始前4天，用COX-2特异性抑制剂CAY10404（50mg/kg/天，腹腔注射）治疗小鼠。使用COX-2特异性抑制剂CAY10404（50mg/kg/天，持续4天）治疗可减弱环氧化酶活性，显著降低BAL PGE2和6-酮PGF1α（图3）。同样，与未经治疗的HTV小鼠相比，全身COX-2抑制使血浆PGE2降低了66%（P<0.05）。CAY10404对COX-2的药理学抑制显著降低了HTV机械通气引起的肺泡毛细血管渗漏（图1，深色条；P<0.05）。CAY10404治疗对对照组或LTV小鼠的组织EBD或BAL蛋白没有显著影响。同样，与未经治疗的HTV小鼠相比，抑制COX-2可减少HTV小鼠的肺部炎症（图2A-2D，深色条；P<0.05），降低BAL白细胞、组织PMN、组织MPO和BAL IL-6。用CAY10404治疗对对照组或LTV小鼠的BAL细胞计数、PMN评分或IL-6没有显著影响，尽管在接受COX-2抑制的LTV小鼠中，肺MPO降低的趋势并不显著。COX-2抑制对白细胞粘附分子产生不同的影响，在两个通气组中显著降低ICAM-1的表达，但在两个通风组中增加VCAM-1（图2E，底部）。值得注意的是，用CAY10404治疗对照组小鼠增加了基础VCAM-1表达。

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在存在或不存在3-（4-甲基磺酰基苯基）-4-苯基-5-三氟甲基异恶唑（CAY10404）对环氧合酶-2-特异性药物抑制的情况下，在低潮气量和高潮气量下对小鼠进行机械通气。使用肺泡毛细血管渗漏和肺部炎症标志物评估肺损伤。通过蛋白质印迹、实时PCR和肺/血浆前列腺素分析测量环氧化酶-2的表达和活性，并通过免疫组织化学分析组织切片中环氧化酶-2的染色。高潮气量通气引起肺损伤，与对照和低潮气量通气相比，肺漏和肺部炎症显著增加。与对照组小鼠和低潮气量小鼠相比，高潮气量机械通气显著诱导了肺和全身环氧合酶-2的表达和活性。肺切片的免疫组织化学分析将环氧化酶-2的表达定位在肺泡中的单核细胞和巨噬细胞上。CAY10404对环氧合酶-2的药理学抑制显著降低了高潮气量通气小鼠的环氧合酶活性，减轻了肺损伤，减轻了屏障破坏、组织炎症和炎性细胞信号传导。本研究证明了机械通气诱导环氧化酶-2，并表明环氧化酶-2的治疗性抑制可能会减轻呼吸机诱导的急性肺损伤[2]。

环氧合酶抑制研究。[1]
使用COX-（绵羊）抑制剂筛选试剂盒测试了本文所述的所有化合物抑制COX-1和COX-2的能力。简而言之，环氧化酶催化花生四烯酸（AA）生物合成为PGH2的第一步。PGF2α由PGH2经氯化亚锡还原产生，通过酶免疫测定法进行测量。该检测基于PG和PG-乙酰胆碱酯酶结合物（PG示踪剂）之间对有限量PG抗血清的竞争。能够结合PG抗血清的PG示踪剂的量与孔中PG的浓度成反比，因为PG示踪剂的浓度保持恒定，而PG的浓度变化。这种抗体-PG复合物与之前附着在孔上的小鼠抗abbit单克隆抗体结合。清洗平板以去除任何未结合的试剂，然后将含有乙酰胆碱酯酶底物的Ellman试剂加入孔中。这种酶反应的产物产生明显的黄色，在405nm处吸收。通过分光光度法测定的这种颜色的强度与结合到孔上的PG示踪剂的量成正比，而结合到孔中的PG示踪剂与孵育过程中孔中存在的PG的量成反比：吸光度├[结合的PG示踪剂]├1/PG。通过比较经不同对照培养处理的化合物来计算抑制百分比。根据浓度-抑制反应曲线（重复测定）计算引起50%抑制的试验化合物的浓度（IC50，μM）。

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COX-2抑制[2]
CAY10404（3-（4-甲基磺酰基苯基）-4-苯基-5-三氟甲基异恶唑）50mg/kg/天，在开始通气前每天腹腔注射3天加1小时。根据我们的初步剂量范围研究和之前发表的研究，选择该剂量是为了在疗效和毒性之间达到最佳平衡。

细胞活力测定 [3]
细胞类型： 非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞（H1703、H358、H460）
测试浓度： 10 -100 µM
孵育时间： 3 天
实验结果： 以一定的浓度依赖性方式抑制 NSCLC 细胞系的生长。

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细胞凋亡分析[3]
细胞类型： H460 细胞
测试浓度： 20、50、100 µM
孵育时间：3天
实验结果：诱导细胞凋亡。

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蛋白质印迹分析 [3]
细胞类型： NSCLC 细胞（H358、H460）
测试浓度： 80 µM
孵育时间： 3 天
实验结果：诱导抗凋亡蛋白（Bcl-2 和 Bcl-XL）和 pAkt 水平随浓度依赖性降低pGSK-3β 不改变促凋亡蛋白 (Bax) 的水平以及总 Akt 和 GSK-3β 蛋白水平。

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细胞增殖试验[3]
为了测量CAY10404对NSCLC细胞增殖的影响，将3×103个细胞/孔（H-1703、H-358、H-460）镀在96孔板上，并在37°C下粘附过夜。第二天，将细胞转移到含有10%血清和DMSO中浓度范围为CAY-10404的新鲜培养基中（终浓度为0.1%）。对照细胞用0.1%DMSO处理。在潜伏期结束时，使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）法测量细胞增殖。每次分析使用六个重复孔。生长抑制百分比由以下方程式计算：生长抑制百分比=（1-At/Ac）×100，其中At和Ac分别表示处理和对照培养物的吸光度值。通过剂量-反应曲线插值确定引起50%细胞生长抑制的药物浓度（IC50）。至少进行了三次独立实验。

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锚地独立生长试验[3]
将NSCLC细胞与低温熔融琼脂糖（0.5%）混合，并以2000个细胞/孔的速度放置在六孔板中的凝固琼脂糖（1%）上。琼脂糖下层和上层均含有不同浓度的0.1%DMSO（作为对照）或CAY10404。将含有上层琼脂糖层的细胞在4°C下固化，然后在37°C下在95%空气/5%二氧化碳的加湿气氛中孵育14天。3天后，将RPMI 1640加10%FBS（含或不含CAY10404；0.5 mL）放置在琼脂糖上，此后每3天更换一次。实验结束时，在倒置显微镜（×40）下计数直径>125µm的菌落。

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细胞凋亡检测[3]
将NSCLC细胞暴露于不同浓度的CAY10404或0.1%DMSO中，然后在含有10%血清的培养基中生长3天。如前所述，使用APO BrdU染色试剂盒（一种改良的末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）测定法）测量细胞凋亡。22简而言之，收集漂浮和贴壁细胞，用1%多聚甲醛和70%乙醇固定。通过末端脱氧尿苷转移酶诱导BrdU三磷酸（Br-dUTP）掺入DNA链的3'-OH末端来检测DNA断裂。在配备488nm氩激光和CellQuest软件的FACScan流式细胞仪上分析细胞。DNA含量（线性红色荧光）和Br-dUTP掺入（FITC-PRB-1）的双重显示用于确定群体中凋亡细胞的百分比。凋亡细胞被鉴定为FITC阳性细胞在10000个门控细胞总数中的比例。

动物/疾病模型：成年雄性C57Bl/6J小鼠，体重24-30克[2]
剂量：50毫克/千克
给药途径：腹腔注射；每日一次；持续4天
实验结果：环氧合酶活性降低，支气管肺泡灌洗液中PGE2和6-酮PGF1α显著降低。降低HTV小鼠的肺部炎症（潮气量峰值；20 ml/kg；持续时间4小时）和呼吸机相关性肺损伤。

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急性肺损伤/呼吸机相关性肺损伤的体内模型[2]
体重24-30 g的成年雄性C57Bl/6J小鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉，气管插管，并以低潮气量（LTV，7 ml/kg）或高潮气量（HTV，20 ml/kg）通气4小时，呼吸频率为160次/分钟，呼气末正压为3 cm H2O。对照组动物麻醉后自主呼吸。HTV小鼠设置外部死腔。所有接受机械通气的动物在开始机械通气时均静脉注射 0.5 ml 无菌乳酸林格氏液，以防止低血压。

[1]. Design and synthesis of 4,5-diphenyl-4-isoxazolines: novel inhibitors of cyclooxygenase-2 with analgesic and antiinflammatory activity. J Med Chem. 2001 Aug 30;44(18):2921-7.

[2]. The role of cyclooxygenase-2 in mechanical ventilation-induced lung injury. Am J Respir Cell Mol Biol. 2012 Sep;47(3):387-94.

[3]. Effects of CAY10404 on the PKB/Akt and MAPK pathway and apoptosis in non-small cell lung cancer cells. Respirology. 2009 Aug;14(6):850-8.

异噁唑，3-[4-(甲磺酰基)苯基]-4-苯基-5-(三氟甲基)-是一种磺酸衍生物。

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合成了在其中一个苯环的对位具有不同取代基（H、F、MeS、MeSO2）的4,5-二苯基-4-异噁唑啉类化合物（13a-k），并评估其作为镇痛剂和选择性环氧合酶-2 (COX-2) 抑制剂的抗炎活性。虽然不含C-3位甲基取代基的4,5-苯基-4-异噁唑啉类化合物（13a-d、f）表现出较强的镇痛和抗炎活性，但所评估的化合物（13a、13b、13h和13k）并非COX-2的选择性抑制剂。相比之下，2,3-二甲基-5-(4-甲基磺酰基苯基)-4-苯基-4-异噁唑啉 (13j) 表现出优异的镇痛和抗精神病活性，并且是一种强效且选择性的 COX-2 抑制剂（COX-1，IC50 = 258 μM；COX-2，IC50 = 0.004 μM）。在 4-苯环对位具有氟取代基的相关化合物 13k 也是一种选择性 COX-2 抑制剂（选择性指数 SI = 3162），但其效力（IC50 = 0.0316 μM）低于 13j。对化合物 13j 的分子建模（分子对接研究）表明，MeSO2 取代基的 S 原子位于 COX-2 二级口袋 (Val(523)) 入口内约 6.46 Å 处，并且 C-3 Me (13j, 13k) 中心异噁唑啉环取代基对于此类化合物选择性抑制 COX-2 至关重要。[1]

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背景和目的：肺癌是全球男性和女性癌症死亡的最常见原因。本研究评估了高选择性环氧合酶-2抑制剂CAY10404在三种非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系（H460、H358和H1703）中诱导细胞死亡的机制。
方法：为检测CAY10404对NSCLC细胞增殖的影响，将3×10³个细胞/孔接种于96孔板中，并在37℃下培养过夜使其贴壁。用CAY10404处理3天后，采用MTT法检测细胞增殖。在H460 NSCLC细胞中，采用TUNEL法和Western blot分析检测细胞凋亡。 [3] H460 和 H358 细胞对 CAY10404 敏感的原因尚不完全清楚。然而，这可能归因于多种促凋亡效应的诱导。既往研究表明，法尼基转移酶抑制剂 SCH66336 和特异性 COX-2 抑制剂 NS-398 分别降低了 SqCC/Y1 头颈部鳞状细胞癌细胞和鼠 B 淋巴瘤 A20 细胞中 Bcl-2/Bcl-XL 的水平。然而，地瓜素并未改变 H322 非小细胞肺癌细胞中 Bcl-2 蛋白的水平。³² 在本研究中，CAY10404 处理降低了抗凋亡蛋白 Bcl-2 和 Bcl-XL 的水平，而未影响促凋亡蛋白 Bax 的水平，导致抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白的比值下降。这种差异可能归因于细胞类型或COX-2抑制剂的不同。然而，目前的结果或许可以解释CAY10404的促凋亡作用。
作为持续研究CAY10404对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞作用机制的一部分，我们研究了PKB/Akt和MAPK通路的作用。MAPK和Akt酶在调节细胞凋亡和增殖中发挥着重要作用。已有研究表明，PKB/Akt和MAPK对细胞凋亡具有显著的抑制作用³³。Akt的磷酸化最近被认为与COX-2介导的肺癌和肝细胞癌细胞的存活有关。在本研究中，用CAY10404处理H460和H358细胞3天后，Akt活性降低，导致磷酸化Akt底物（包括pGSK-3β）水平降低，这些变化也可能导致细胞凋亡增加。此外，本研究表明，CAY10404以浓度依赖的方式降低了H460和H358细胞中pAkt和pGSK-3β的水平，而总Akt和GSK-3β蛋白水平未发生改变。在分子水平上探究MAPK通路的作用时，CAY10404处理3天后，磷酸化Erk1/2的表达略有下降，而总Erk1/2蛋白水平未发生改变。这些结果提示CAY10404优先影响PKB/Akt信号通路，该通路在调控细胞凋亡和增殖中发挥重要作用。这是首次报道CAY10404通过抑制参与细胞增殖和存活的信号转导机制诱导非小细胞肺癌（NSCLC）细胞凋亡。其他报告表明，胰岛素样生长因子（IGF）结合蛋白-3抑制了非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中IGF-I诱导的PI3K/Akt/PKB和MAPK通路激活，而PI3K调节亚基dnp85α的过表达诱导细胞凋亡，LY294002或磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）的过表达则诱导H1299 NSCLC细胞增殖停滞。³⁷在癌前HBE细胞中，地瓜素抑制PI3K活性并降低pAkt水平和活性，但对MAPK通路的影响甚微。³⁸因此，我们评估了CAY10404是否抑制了NSCLC细胞中抑制PI3K和MAPK的信号转导通路。
许多实验和临床研究已证实，特异性COX-2抑制剂可能有助于预防和治疗多种恶性肿瘤。然而，近期研究表明，长期使用高浓度COX-2抑制剂会显著增加心脏毒性的风险。克服这一局限性的一个方法是使用较低剂量的COX-2抑制剂与其他已上市药物联合使用。两种药物同时使用的协同作用可能使特异性COX-2抑制剂CAY10404能够以更低、更安全的浓度使用，并为更有效治疗人类非小细胞肺癌铺平道路。未来的研究应探讨COX-2抑制剂与其他已上市药物联合使用以改善癌症控制的效果。[2]

C17H12NO3F3S

367.342

367.049

C, 55.58; H, 3.29; F, 15.52; N, 3.81; O, 13.07; S, 8.73

340267-36-9

10429020

White to off-white solid powder

1.4±0.1 g/cm3

498.6±45.0 °C at 760 mmHg

196.47 °C(Predicted)

255.3±28.7 °C

0.0±1.2 mmHg at 25°C

1.538

2.92

68.55

0

7

3

25

547

0

CS(=O)(=O)C1=CC=C(C=C1)C2=NOC(=C2C3=CC=CC=C3)C(F)(F)F

KKBWWVXRKULXHF-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C17H12F3NO3S/c1-25(22,23)13-9-7-12(8-10-13)15-14(11-5-3-2-4-6-11)16(24-21-15)17(18,19)20/h2-10H,1H3

3-[4-(Methylsulfonyl)phenyl]-4-phenyl-5-(trifluoromethyl)-isoxazole

CAY 10404; 340267-36-9; CAY10,404; CAY 10,404; 3-(4-methylsulphonylphenyl)-4-phenyl-5-trifluoromethylisoxazole; 3-(4-methylsulfonylphenyl)-4-phenyl-5-trifluoromethylisoxazole; 3-(4-methylsulfonylphenyl)-4-phenyl-5-(trifluoromethyl)-1,2-oxazole; CHEMBL97943; 3-[4-(Methylsulfonyl)phenyl]-4-phenyl-5-(trifluoromethyl)-isoxazole; CAY-10404; CAY10404

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

注意： 请将本产品存放在密封且受保护的环境中（例如氮气保护），避免吸湿/受潮。

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

DMSO : ~100 mg/mL (~272.23 mM)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (6.81 mM) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；然后向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: 2.5 mg/mL (6.81 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浊液; 超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.5 mg/mL (6.81 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 25.0 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。