CCG-203971

Rho; SRE.L ( IC50 = 0.64 μM )
Rho/MRTF/SRF transcriptional pathway [1]

体外活性：CCG-203971 抑制 SSc 成纤维细胞和溶血磷脂酸 (LPA) 和转化生长中结缔组织生长因子 (CTGF)、α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 和胶原蛋白 1 (COL1A2) 的表达β因子（TGFβ）刺激的成纤维细胞。细胞测定：将人真皮成纤维细胞（2.0×104）接种到96孔板中，并在含有10％FBS的DMEM中生长过夜。除去培养基并更换为含有 2% FBS 和 30 μM CCG-203971 或 0.1% DMSO 对照的 DMEM。 72小时后，将WST-1染料添加到每个孔中，60分钟后，使用Wallac Victor2读板器读取490 nm处的吸光度。

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1. CCG-203971可浓度依赖性抑制弥漫性皮肤系统性硬化症（SSc）患者真皮成纤维细胞中结缔组织生长因子（CTGF）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，ACTA2）和1型胶原（COL1A2）的表达；同时可抑制10 μM溶血磷脂酸（LPA）刺激的NIH-3T3成纤维细胞中上述纤维化相关基因的上调（通过qPCR检测，COL1A2引物靶向新合成的不均一核RNA，基因表达水平以GAPDH为内参进行定量）。[2]
2. 30 μM CCG-203971可降低SSc真皮成纤维细胞的增殖速率（培养3天后通过WST-1法检测活细胞密度），该细胞的增殖速率原本快于正常真皮成纤维细胞；10 μM CCG-203971可抑制转化生长因子β（TGFβ，10 ng/ml，处理3天）诱导的正常人真皮成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化（通过免疫细胞化学染色检测α-SMA表达，DAPI染核），同时可浓度依赖性降低SSc真皮成纤维细胞中α-SMA阳性细胞的比例（由盲态观察者计数）。[2]

CCG-203971 在博来霉素皮肤损伤模型中进行了测试。博莱霉素以 50 μL DMSO 形式腹腔注射。初步研究表明，以这种方式给药的博来霉素以 100 mg/kg 每天两次的剂量具有良好的耐受性。与未接受博莱霉素的 PBS+DMSO 组相比，皮内博莱霉素与 DMSO 对照（50 μL ip）一起皮内注射 2 周，导致真皮显着增厚（P<0.0001）。 CCG-203971 治疗强烈且显着地 (P<0.001) 抑制了该模型中博来霉素诱导的皮肤增厚。通过测量羟脯氨酸含量来评估皮肤胶原蛋白含量，也显示出类似的结果。博莱霉素注射液可促进胶原蛋白沉积（P<0.01），而 CCG-203971 能够阻断这种作用（P<0.05）。

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1. CCG-203971（100 mg/kg，腹腔注射，每日两次）可阻止博来霉素（0.1 mg皮内注射，持续2周）诱导的C57BL/6J小鼠皮肤增厚和胶原沉积（每组n=7）；与博来霉素+溶媒组相比，给药组小鼠皮肤厚度（每只小鼠测量三次）和羟脯氨酸含量（胶原标志物）显著降低（通过Masson三色染色和羟脯氨酸检测法评估，单因素方差分析结合Bonferroni事后检验：羟脯氨酸含量P<0.05，皮肤厚度P<0.001）。[2]
2. CCG-203971体内效力一般且药代动力学性质较差，不适合长期疗效研究；其类似物CCG-232601（8f）经口给药（50 mg/kg，每日灌胃，持续14天）可抑制小鼠博来霉素诱导的皮肤纤维化（每组n=8），疗效与4倍剂量的CCG-203971腹腔注射相当。[1]

将人真皮成纤维细胞 (2.0 × 10⁴) 接种到 96 孔板中，在含有 10% FBS 的 DMEM 中培养整晚。除去培养基后，将其替换为含有 0.1% DMSO 对照或 30 μM CCG-203971 以及 2% FBS 的 DMEM。 72小时后将WST-1染料添加到每个孔中，并在60分钟后测量490nm处的吸光度。

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1. LPA刺激的纤维化基因表达实验：将NIH-3T3细胞用不同浓度的CCG-203971或DMSO处理23小时；提取RNA前1小时，用10 μM LPA刺激细胞；提取总RNA后，通过qPCR检测CTGF、ACTA2和COL1A2的mRNA表达（COL1A2引物靶向hnRNA），表达水平以GAPDH为内参归一化；实验独立重复两次，数据以均值±标准差表示。[2]
2. SSc成纤维细胞基因表达实验：培养正常供体或SSc患者的原代人真皮成纤维细胞（传代≤5代）；对于SSc成纤维细胞，用指定浓度的CCG-203971或300 μM吡非尼酮（PFD）处理24小时后提取RNA；通过qPCR定量CTGF、ACTA2和COL1A2的mRNA表达，数据以均值±标准误表示（SSc样本n≥4例，正常样本n=3例）。[2]
3. 成纤维细胞增殖实验：将正常/SSc真皮成纤维细胞接种于96孔板，用30 μM CCG-203971或DMSO培养3天；通过WST-1法（水溶性四唑盐的酶促还原反应）检测活细胞密度，数据以均值±标准误表示（n=3例）。[2]
4. 肌成纤维细胞转化实验：将正常人真皮成纤维细胞接种于盖玻片，用10 ng/ml TGFβ处理3天（同时加入/不加入10 μM CCG-203971或DMSO）；将SSc真皮成纤维细胞接种于盖玻片，用指定浓度的CCG-203971处理；固定细胞后，进行α-SMA免疫细胞化学染色（DAPI染核），由盲态观察者计数α-SMA阳性细胞比例（数据以均值±标准误表示，n≥4例）。[2]

Mice: In C57BL/6 mice (female, 8 weeks old), a local intracutaneous injection of 100 μL of Bleomycin (1 mg/mL) in phosphate-buffered saline (PBS) is administered daily for two weeks in a predetermined area (~1 cm2) on the upper back to induce skin fibrosis. A control is a 100 μL intracutaneous injection of PBS. A total of 21 mice are used, divided into three groups. Two groups are given bleomycin challenges while the first group is given PBS injections. During the first two weeks of the Bleomycin challenge, 100 mg/kg of CCG-203971 administered intraperitoneally twice daily in 50 μL of DMSO is started. The vehicle control system is DMSO. The animal groups are as follows: (1) Bleomycin/DMSO; (2) PBS/DMSO; and (3) Bleomycin/CCG-203971. Following therapy, cervical dislocation is used to humanely kill the animals, and tissue is gathered.

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1. Bleomycin-induced skin fibrosis model in mice: Three groups of C57BL/6J mice (n=7 per group) received intradermal injections of bleomycin (0.1 mg) or PBS (control) for 2 weeks; mice in the treatment group received twice daily intraperitoneal injections of CCG-203971 (100 mg/kg) or vehicle (50 μl DMSO); at the end of treatment, skin samples were collected for Masson’s trichrome staining (skin thickness measurement) and hydroxyproline content analysis. [2]
2. Pharmacokinetic optimization study in mice: CCG-203971 was evaluated for metabolic stability and solubility; analogs (including CCG-232601/8f) were tested for plasma exposure in mice (over 10-fold increase vs CCG-203971); for the efficacy study of CCG-232601, three groups of mice (n=8 per group) were treated for 14 days: Control (intracutaneous PBS), Bleo (intracutaneous bleomycin + oral vehicle), Bleo + 8f (intracutaneous bleomycin + 50 mg/kg 8f daily oral gavage). [1]

1. CCG-203971 had poor pharmacokinetic (PK) properties, including low metabolic stability and solubility were reported for CCG-203971 itself; its analogs (e.g., CCG-232601/8f) showed over 10-fold increases in plasma exposures in mice after optimization. [1]

[1]. Bioorg Med Chem Lett . 2017 Apr 15;27(8):1744-1749.

[2]. J Pharmacol Exp Ther . 2014 Jun;349(3):480-6.

1. CCG-203971 is a novel small-molecule inhibitor of the Rho/MRTF/SRF transcriptional pathway, a key regulator of myofibroblast activation; it blocks MRTF nuclear localization, thereby inhibiting the profibrotic gene transcriptional program activated by multiple stimuli (LPA, TGFβ) in fibrosis. [2]
2. CCG-203971 is a potential antifibrotic therapeutic for systemic scleroderma (SSc) and other fibrotic disorders; current SSc therapies focus on anti-inflammatory drugs or single receptor targets, while CCG-203971 targets a common downstream pathway (Rho/MRTF/SRF) of multiple profibrotic inputs, potentially offering broader efficacy. [2]
3. CCG-203971 was originally developed as an inhibitor of Rho-mediated gene transcription, efficacious in acute fibrosis animal models (including scleroderma) when administered intraperitoneally, but its poor PK properties necessitated medicinal chemistry optimization to improve metabolic stability and solubility. [1]

C23H21CLN2O3

408.88

408.124

C, 67.56; H, 5.18; Cl, 8.67; N, 6.85; O, 11.74

1443437-74-8

71681561

White to off-white solid powder

1.3±0.1 g/cm3

656.0±55.0 °C at 760 mmHg

350.5±31.5 °C

0.0±2.0 mmHg at 25°C

1.633

3.76

62.55

1

3

4

29

579

0

ClC1C([H])=C([H])C(=C([H])C=1[H])N([H])C(C1([H])C([H])([H])N(C(C2=C([H])C([H])=C([H])C(C3=C([H])C([H])=C([H])O3)=C2[H])=O)C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H])=O

HERLZBNILRVHQN-UHFFFAOYSA-N

InChI=1S/C23H21ClN2O3/c24-19-8-10-20(11-9-19)25-22(27)18-6-2-12-26(15-18)23(28)17-5-1-4-16(14-17)21-7-3-13-29-21/h1,3-5,7-11,13-14,18H,2,6,12,15H2,(H,25,27)

N-(4-chlorophenyl)-1-[3-(furan-2-yl)benzoyl]piperidine-3-carboxamide

2934.99.9001

Powder      -20°C    3 years

                     4°C     2 years

In solvent   -80°C    6 months

                  -20°C    1 month

Room temperature (This product is stable at ambient temperature for a few days during ordinary shipping and time spent in Customs)

配方 1 中的溶解度: 2.5 mg/mL (6.11 mM) in 10% DMSO + 90% (20% SBE-β-CD in Saline) (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 悬浮液；超声助溶。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将100 μL 25.0 mg/mL澄清DMSO储备液加入900 μL 20% SBE-β-CD生理盐水溶液中，混匀。
*20% SBE-β-CD 生理盐水溶液的制备（4°C，1 周）：将 2 g SBE-β-CD 溶解于 10 mL 生理盐水中，得到澄清溶液。

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配方 2 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.09 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 40% PEG300 + 5% Tween80 + 45% Saline (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL澄清的DMSO储备液加入到400 μL PEG300中，混匀；再向上述溶液中加入50 μL Tween-80，混匀；然后加入450 μL生理盐水定容至1 mL。
*生理盐水的制备：将 0.9 g 氯化钠溶解在 100 mL ddH₂O中，得到澄清溶液。

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配方 3 中的溶解度: ≥ 2.08 mg/mL (5.09 mM) (饱和度未知) in 10% DMSO + 90% Corn Oil (这些助溶剂从左到右依次添加，逐一添加), 澄清溶液。
例如，若需制备1 mL的工作液，可将 100 μL 20.8 mg/mL 澄清 DMSO 储备液加入到 900 μL 玉米油中并混合均匀。

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配方 4 中的溶解度: 10% DMSO: 40% PEG300: 5% Tween-80: 45% saline: ≥ 2.5 mg/mL

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请根据您的实验动物和给药方式选择适当的溶解配方/方案：
1、请先配制澄清的储备液(如：用DMSO配置50 或 100 mg/mL母液(储备液));
2、取适量母液，按从左到右的顺序依次添加助溶剂，澄清后再加入下一助溶剂。以 下列配方为例说明 (注意此配方只用于说明，并不一定代表此产品 的实际溶解配方):
10% DMSO → 40% PEG300 → 5% Tween-80 → 45% ddH2O (或 saline);
假设最终工作液的体积为 1 mL, 浓度为5 mg/mL: 取 100 μL 50 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀/澄清；向上述体系中加入50 μL Tween-80，混合均匀/澄清；然后继续加入450 μL ddH2O (或 saline)定容至 1 mL；
3、溶剂前显示的百分比是指该溶剂在最终溶液/工作液中的体积所占比例;
4、 如产品在配制过程中出现沉淀/析出，可通过加热(≤50℃)或超声的方式助溶;
5、为保证最佳实验结果，工作液请现配现用！
6、如不确定怎么将母液配置成体内动物实验的工作液，请查看说明书或联系我们;
7、 以上所有助溶剂都可在 Invivochem.cn网站购买。